Az elhízás elnyomása egy bélféreggel a bél mikrobiotájával való kölcsönhatások révén

ABSZTRAKT

Az elhízás egyre inkább életmódbeli betegségeket okoz a fejlett országokban, ahol a helmintikus fertőzéseket ritkán észlelik. Itt megvizsgáltuk, hogy a bélférgességnek, a Heligmosomoides polygyrus-nak van-e szuppresszív szerepe az egerek étrendje által kiváltott elhízásban. A H. polygyrus-fertőzés elnyomta az elhízott egerek súlygyarapodását, ami összefüggésbe hozta az adipocitákban a megszakadt protein 1 (UCP1) expressziójának növekedését és a szérum norepinefrin (NE) magasabb koncentrációját. Az NE és receptorának az adipocitákon történő interakcióinak blokkolása azt eredményezte, hogy a H. polygyrus fertőzött elhízott egerekben nem sikerült megakadályozni a súlygyarapodást és fokozni az UCP1 expressziót, ami azt jelzi, hogy az NE felelős a H. polygyrus elhízásra gyakorolt védőhatásaiért. A szimpatikus ideg eredetű NE mellett a NE intenzitás növekedésében a bél mikrobiota is részt vett. A H. polygyrus-fertőzés megváltoztatta a bélbaktériumok összetételét, és a bélbaktériumok csökkentésére szolgáló antibiotikum-kezelés megfordította a magasabb NE-koncentrációt, az UCP1 expressziót és a H. polygyrus fertőzés után megfigyelt súlygyarapodás megelőzését. Adataink azt mutatják, hogy a H. polygyrus elnyomó szerepet játszik az elhízásban az NE-t termelő mikrobiota modulációja révén.

BEVEZETÉS

Az elhízás olyan életmódbeli betegségeket okoz, mint a magas vérnyomás, a cukorbetegség és a dyslipidaemia (1). A túlzott energiafogyasztás az elhízás egyik fontos oka. A test teljes energiamérlegét a felesleges vagy hiányos energia kiigazításával, az energia bevitelével és kimenetével együtt tartják fenn. Az egyik ilyen metabolikus kontroll a zsírszövetekben van. A zsírszövet fehér vagy barna besorolású (2), mindegyiknek különböző tulajdonságai vannak. A fehér zsírszövet trigliceridként felhalmozza a túlzott mennyiségű lipidet, míg a barna zsírszövet hőként zsírsavakat fogyaszt (3). A barna zsírszövetek két különböző típusú termogén adipocitát tartalmaznak: a klasszikus barna adipocitákat és a bézs vagy világos fényű adipocitákat. Az elhízás kutatásának egyik fő célja megismerni azokat a tényezőket, amelyek aktiválják a termogén adipocitákat, amelyek aktiválják az energiafogyasztást, megakadályozva ezzel az elhízást.

Az 1. szétkapcsoló fehérje (UCP1) a barna (4) és a bézs (5) adipociták mitokondriumában expresszálódó integrál membránfehérje, amely leválasztja az oxidatív foszforilációt. Amikor az UCP1 aktiválódik, a zsírsavak és a glükóz lipolízisével keletkező energia közvetlenül hővé alakul, anélkül, hogy ATP-szintézisre irányulna, és a hő ezután eloszlik (6). Így ez a molekula döntő fontosságú az energiafelhasználás szempontjából. Az UCP1 által termelt hőtermelést a norepinefrin (NE) szabályozza, amelyet a barna zsírban sűrűn eloszló szimpatikus idegek szabadítanak fel. A zsírsavak lipolízissel jönnek létre, amelyet az NE indukál a receptorára hatva, és az adipocita lipázok, köztük a zsírszövet triglicerid lipáz és a hormonérzékeny lipáz aktivációját indukálja. Az előállított zsírsav oxidatív úton lebomlik és aktiválja az UCP1-et. Amikor az NE a fehér zsírsejtekre hat, a zsírbontás hasonló módon történik, de a keletkezett zsírsav felszabadul a vérbe, és a barna zsírsejtek és az izmok elfogyasztják. A bézs zsírsejtek jellemzője az UCP1 külső ingerek által történő dinamikus szabályozása. A β3-adrenerg receptor (β3AdR) agonisták az UCP1 markáns expresszióját indukálták bézs színű adipocitákban (5).

A legújabb tanulmányok szoros kapcsolatot mutattak ki a bél mikrobiota összetétele és számos betegség, köztük anyagcsere, gyomor-bélrendszeri és gyulladásos betegségek között (7, 8). Ezenkívül az elhízás alacsony bél mikrobiotai sokféleséggel jár, és megváltoztathatja bizonyos baktériumok összetételét emberben és állatmodellekben (9). Sok tényező, amely befolyásolja az elhízás kialakulását, a mikrobiota modulációjához kapcsolódik (10, 11). A bél mikrobiotája pszichiátriai betegségekkel, köztük depresszióval és autizmussal társul, és korábbi tanulmányok szerint a bélbaktériumok kommunikáltak a központi idegrendszerrel, hogy stimulálják a neurotranszmitterek és hormonok termelését, beleértve a szerotonint, a dopamint és a γ-amino-vajsavat (12–14). ).

Az elhízás előfordulása nőtt, különösen a fejlett országokban, ahol a helmintikus fertőzéseket szinte megszüntették (15). Számos bizonyíték utal arra, hogy fordított összefüggés van a helmintikus fertőzések és az elhízás, valamint a gyulladás által közvetített rendellenességek között (16, 17), ami arra utal, hogy a helmintáknak elnyomó hatása lehet ezekre a betegségekre. Azonban az elhízás elnyomásában szerepet játszó védekező mechanizmusok nagyrészt nem ismertek. Tekintettel arra, hogy a bélférgek modulálják a bél mikrobiotáját, a mostani tanulmány a bélfonálféreg elhízásra gyakorolt hatását vizsgálta magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) táplált egerekben, a bél mikrobiotájára összpontosítva. Megállapítottuk, hogy a helmintikus fertőzés befolyásolta a bélbaktériumokat, ami megnövekedett NE-termelést eredményezett, amely az UCP1-et szabályozta a zsírszövetekben.

EREDMÉNYEK

A Heligmosomoides polygyrus fertőzés csökkenti a kialakult elhízást. Annak megvizsgálására, hogy a Heligmosomoides polygyrus fertőzésnek van-e terápiás hatása a megállapított elhízásra, 4 hétig HFD-vel táplált egereket használtunk fertőzésgazdaként (1A. Ábra). Ez a diéta a testtömeg 20% -os növekedését, a zsírtömeg és a dyslipidaemia növekedését eredményezte (1B – E. Ábra), és ezeket az egereket elhízottnak tekintették. Az elemzés előtt megerősítettük, hogy a HFD-vel történő etetésnek nincs káros hatása a H. polygyrus fertőzésre. Az elhízott egerek felnőtt férgeket hordoztak, és a normális étrenddel etetett egerekéihez (ND) hasonló mennyiségű petéket termeltek (1F és G ábra). Az elhízott egerek folyamatos táplálása HFD-vel felgyorsította a testtömeg növekedését. Az elhízott egerek H. polygyrus-szal történő fertőzése csökkentette a testtömegét és javította a diszlipidémiát (1B – E. Ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a H. polygyrus fertőzés megelőző és terápiás hatást gyakorol a meglévő elhízásra.

A bél mikrobiotájának változásai elhízott, H. polygyrus fertőzött egerekben. (A) A bél mikrobiota összetétele a törzs szintjén látható a jelzett egércsoportokban. A bal és a jobb oldali panel minden oszlopa egy egér összetételét és öt egér átlagértékét ábrázolja. (B) Megjelenik a firmicutes és a protein baktériumok gyakorisága egerekben, amelyet az A panel adatai képviselnek. (C) A Bacillus és Escherichia fajok mennyiségét a teljes bélmikrobiotában egerekben 28 nappal a fertőzés után kvantitatív PCR alapján számítottuk, az alábbiakban leírtak szerint. Relatív bőség (%) = 2 (CT univerzális 16S - CT specifikus 16S) × 100, ahol a CT küszöbciklus. Valamennyi értéket egy reprezentatív kísérlet során ötnél több egér átlagaként ± szórásként adunk meg. *, P H. polygyrus fertőzés 28 nappal a fertőzés megjelenése után. R 2, a korrelációs együttható.

VITA

Ebben a tanulmányban bebizonyítottuk, hogy a H. polygyrus elnyomta a HFD által kiváltott elhízást. Mechanikailag a H. polygyrus befolyásolta a bél mikrobiota összetételét az NE növelése érdekében, ami fokozott UCP1 expressziót eredményezett a zsírszövetekben. Mivel az NE-vel történő stimulációról beszámoltak, hogy az UCP1 expresszióval összefüggő adipocita progenitorokból bézs színű adipocitákat indukál (5), ezek a termogén adipociták H. polygyrus fertőzés során indukálódhatnak.

Nemrégiben Su és mtsai. számolt be a H. polygyrus fertőzés megelőző hatásáról a HFD által kiváltott elhízásra, különálló immunválaszokra összpontosítva (24). A H. polygyrus fertőzés során kiváltott alternatív aktivált makrofágok (AAM) elnyomják az elhízással járó inzulinrezisztenciát és gyulladást, valamint fokozzák az UCP1 expresszióját a zsírszövetekben. Azt is gondoljuk, hogy az elhízást megakadályozó döntő effektor megnövekedett UCP1 expresszió. Ugyanakkor különböző mechanizmusokat tártunk fel, mint Su és mtsai. az AAM-ok bevonásával, amelyek szabályozták az UCP1 expresszióját. Ez a különbség oka lehet a kísérleti rendszer különbsége, és rendszerünk enyhe elhízást váltott ki anélkül, hogy hiperglikémiát vagy inzulinrezisztenciát okozott volna. Bár nem vizsgáltuk az immunválaszokat, az enyhe elhízás nem társult gyulladással, ami azt jelzi, hogy az immunválaszoktól eltérő módon is szabályozható.

A β3AdR antagonistát használó eredményeink azt mutatták, hogy az NE döntő szerepet játszik az UCP1 expressziójában. A reserpin alkalmazásával végzett kémiai denerválás még a H. polygyrus fertőzés hiányában is megnövelte a testtömeget, jelezve, hogy a neurogén NE elsősorban fiziológiai körülmények között szabályozza az UCP1 indukcióját. A neurogén NE mellett a bél mikrobiota is hozzájárult a H. polygyrus-szal fertőzött elhízott egerek NE-szintjének növekedéséhez. Mivel a H. polygyrus a vékonybélben található, úgy gondolják, hogy befolyásolja a bél mikrobiotáját. Számos tanulmány kimutatta, hogy a bélflóra összetétele megváltozott a H. polygyrus fertőzés után (25, 26). Itt megfigyeltük, hogy a H. polygyrus fertőzés megváltoztatta a bél mikrobiota összetételét, és konkrétan több Bacillus és Escherichia fajt detektáltak, amelyekről ismert, hogy mindkettő NE-t generál (14, 27). Egyéb baktériumtermékek, mint például a rövid láncú zsírsavak, elhízásellenes hatásúak, és egyes baktériumok elhízással járnak (28); ezért a mikrobiota változásai által okozott további hatások hozzájárulhatnak az elhízás csökkentéséhez. Tehát a bél mikrobiota átfogó elemzésére van szükség ahhoz, hogy jobban megértsük a metabolikus homeosztázist a H. polygyrus fertőzés alatt.

Felmerül a kérdés, hogy az NE indukciója kedvez-e a H. polygyrus parazitizmusnak. A bélférgek kiűzése a paraszimpatikus idegek által irányított mucin és perisztaltikus mozgások termelésétől függ. Így a szimpatikus idegek aktiválása elősegítheti a bélparaziták megtelepedését azáltal, hogy elnyomja a bélmozgást. Ez azonban valószínűtlennek tűnik, mivel a petesejt-termelést nem csökkentette a β3AdR agonistával vagy antibiotikumokkal végzett kezelés (3A. És 5C. Ábra). Nem foglalkoztunk azzal, hogy a H. polygyrus hogyan modulálja a mikrobiotát molekuláris szinten. További elemzések annak meghatározására, hogy mely molekulák vesznek részt, értékesek lesznek az elhízás kezelésében vagy megelőzésében, például prebiotikumok és probiotikumok alkalmazásával.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Egerek. A hím C57BL/6J egereket a Japan SLC-től (Hamamatsu, Japán) vásároltuk, specifikus kórokozóktól mentes körülmények között tartottuk, és 10-12 hetes korban használtuk őket kísérletekhez. A kísérleti etetéshez 60% zsírtartalmú HFD-t (HFD-60; Oriental Yeast Corporation, Tokió, Japán) és normál kontroll étrendet (AIN-93M; Oriental Yeast Corporation) használtunk. Valamennyi állatkísérletet felülvizsgált és jóváhagyott a Gunma Egyetem Végzős Iskolájának Állatkísérleti Etikai Bizottsága (jóváhagyási szám: 16-041), és azokat a Gunma Egyetem Végzős Iskolájában és az a japán kormány 105. számú törvényével és 6. értesítésével összhangban.

H. polygyrus fertőzés. A III. Fertőző stádiumú H. polygyrus lárvákat (L3) a korábban leírtak szerint állítottuk elő (29), és felhasználásig 4 ° C-on tároltuk. Az egereket 200 L3 lárvával orálisan oltottuk be gyomor intubálásával. A székletben lévő tojásokat mikroszkóppal detektáltuk a sikeres fertőzés megerősítésére.

Minta kollekció. Vért vettünk az egerekből szívpunkcióval altatásban, és az egereket méhnyak diszlokációval feláldoztuk. Az epididymális zsírszövetet aszeptikusan eltávolítottuk, és az adipocitákat megtisztítottuk, amint arról korábban beszámoltunk (30). Ezután megmértük a zsírszövet tömegét. Az elemzéshez szérummintákat választottunk el az összegyűjtött vértől. Egyes kísérletek során a H. polygyrus-szal fertőzött egerek vékonybéléből kinyert összes felnőtt férget megszámoltuk.

Szérumelemzés. A szérummintákat triglicerid és nem észterezett zsírsav (NEFA) szempontjából elemeztük LabAssay (Wako, Tokió, Japán) és NE szempontjából standard enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal (ELISA), a gyártó utasításainak megfelelően (ISM, Tokió, Japán).

Valós idejű RT-PCR elemzés. A teljes RNS-t RNeasy Mini kit (Qiagen, Hilden, Németország) segítségével tisztított adipocitákból extraháltuk, és a cDNS szintetizálásához a ReverTra Ace (Toyobo, Osaka, Japán) reverz átírását végeztük. A kérdéses géneket expresszáló eredmény cDNS-t valós idejű reverz transzkripció-PCR-rel (RT-PCR) számszerűsítettük SYBR-zöld (TaKaRa Bio, Shiga, Japán) alkalmazásával, a glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenázt (GAPDH) kódoló mRNS szintjéhez viszonyítva. ) a gyártó protokolljának megfelelően. A specifikus primerpárok a következők voltak: az Ucp1, 5′-ACTGCCACACCTCCAGTCATT-3 'és 5'-CTTTGCCTCACTCAGGATTGG-3' esetében; az Adrb3 esetében az 5'-TCGACATGTTCCTCCACCAA-3 'és az 5'-GATGGTCCAAGATGGTGCTT-3'; a Gapdh esetében pedig az 5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3 ′ és 5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3 ′.

Receptor blokád. A β3 adrenerg receptor blokádhoz 5 mg/testtömeg-kg SR59230-at (Sigma, St. Louis, MO, USA) intraperitoneálisan injektáltunk minden második napon 28 napig (31).

Reserpin injekció. A Reserpin-t (0,5 mg/testtömeg-kg) intraperitoneálisan injektáltuk 1 nappal a H. polygyrus fertőzés előtt, valamint 3 és 5 nappal azután.

Antibiotikum kezelés. A bélbaktériumok csökkentése érdekében a H. polygyrus-szal fertőzött elhízott egereknek ampicillin (1 g/liter), vankomicin (0,5 g/liter), neomicin (1 g/liter) és metronidazol (1 g/liter) keverékét adtuk be. ivóvizüket 28 napig.

Bél mikrobiota elemzés 16S rRNS szekvenálással. Az egerekből gyűjtött ürülékmintákat azonnal folyékony nitrogénben lefagyasztották és -80 ° C-on tárolták. A széklet DNS-extrahálását egy korábbi, kisebb módosításokkal végzett tanulmány szerint végeztük (32). Az egér ürülékének egy részét sterilizált pálcákkal szuszpendáltuk 475 μl TE10 pufferben, amely 10 mM Tris-HCl-t (pH 8,0) és 10 mM EDTA-t tartalmazott. A széklet-szuszpenziót 15 mg/ml lizozimmal (Wako) inkubáltuk 37 ° C-on 1 órán át. 2000 egység/ml tisztított achromopeptidáz (Wako) végső koncentrációt adunk hozzá, majd 30 percig 37 ° C-on inkubáljuk. A szuszpenzióhoz 1 tömeg% nátrium-dodecil-szulfátot és 1 mg/ml proteináz K-t (Merck Japan, Tokió, Japán) adtunk és 1 órán át 55 ° C-on inkubáltuk. A szuszpenzió centrifugálása után a bakteriális DNS-t fenol-kloroform-izoamil-alkohol (25: 24: 1) oldattal tisztítottuk. A DNS-t etanol és nátrium-acetát hozzáadásával kicsapjuk. RNáz A-t (Wako) adtunk a baktérium DNS-hez TE pufferben, 1 mg/ml végkoncentrációig. A töredezett kis molekulatömegű DNS eltávolítása céljából az RNáz-kezelés után polietilénglikol (PEG) 6000-tel kicsaptuk.

A széklet mikrobiota mennyiségi meghatározása valós idejű PCR-rel. Az egér székletéből származó DNS-t Stool Mini kit (Qiagen) alkalmazásával extraháltuk. A 16S rRNS-t kódoló géneket reverz transzkripció-kvantitatív PCR (RT-qPCR) kit (Qiagen) segítségével számszerűsítettük. A specifikus primerpárok a következők voltak: az Escherichia spp. Esetében az 5′-GTTAATACCTTTGCTCATTGA-3 ’és az 5′-ACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3’ (35); a Bacillus spp. esetében az 5′-CAGTAGGGAATCTTCCGCAATG-3 ’és az 5′-AGCCGTGGCTTTCTGGT-3’ (36). Az összes baktériumra használt univerzális primerpárt is alkalmaztak: 5′-GTGGTGCACGGCTGTCGTCA-3 ’és 5′-ACGTCATCCACACCTTCCTC-3’ (37).

Statisztikai analízis. A csoport átlagát kétirányú varianciaanalízissel (ANOVA) hasonlítottuk össze, amelyet Tukey post hoc teszt vagy kétfarkú Student t teszt követett. A 0,05 alatti valószínűségi értékeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönetet mondunk Wakana Mizutaninak a technikai segítségért és Jodi Smith-nek az Edanz Csoporttól (Fukuoka, Japán) a kézirat vázlatának szerkesztéséért.

Ezt a munkát a Nemzetközi Tudományos Kutatási Támogatás (B) támogatta a Japán Tudományfejlesztési Társaságtól (15H05274-től HH-ig), a Támogatás a fiatal tudósokért (B) (26870849-től CS-ig)., valamint az Oktatási, Kulturális, Sport-, Tudományos és Technológiai Minisztérium támogatása a tudományos kutatáshoz (C) (15K08441 - HH); támogatást nyújtott az Ichiro Kanehara Foundation Japan és a Takeda Science Foundation is.

LÁBJEGYZETEK

Kapott 2019. január 17-én.
Visszaadva módosításra 2019. február 20.
Elfogadva 2019. március 16.
Elfogadott kézirat, online közzétéve 2019. április 8-án.

Ez egy nyílt hozzáférésű cikk, amelyet a Creative Commons Attribution 4.0 International licenc feltételei szerint terjesztenek.