Az elhízás lehetséges hatása az androgén, progeszteron és ösztrogénreceptorok (ERα és ERβ) génexpressziójára mellrákos betegeknél

Cikk információk

Absztrakt

Háttér

Az elhízás összefüggésbe hozható a hormonfüggő rákok, például az emlőrák megnövekedett halálozásával, amely a nők körében a leggyakoribb rák. Az elhízás és az emlőrák közötti kapcsolat annak tulajdonítható, hogy a zsírszövetben az aromatizálás során termelődik a felesleges ösztrogén. A szteroid hormon receptorok szerepe az emlőrák kialakulásában jól tanulmányozott, de ennek a vizsgálatnak az volt a célja, hogy az elhízás hogyan befolyásolhatja a szteroid hormonok expressziós mintázatát az emlőrák különböző fokozatú betegeiben.

Mód

Nem ismertek azok az okok, amelyek miatt az elhízott betegeknél az emlőrák gyakrabban fordul elő ER +/PR +. Másrészt ezek közül több ER-/PR- tumor expresszálja az androgénreceptort magas szinten. Az elhízás egyes tanulmányok szerint a hormonreceptor-pozitív tumorok megnövekedett előfordulásával jár, míg mások a hormonreceptor-negatív daganatok növekedésére utalnak. Ez az eltérés magyarázható a laboratóriumi technikák különbségeivel vagy a hormon-válaszkészség kritériumaival. 19.

Az ER gén expressziója mellett más emelt hormonok, például a progeszteron és az androgén receptorok szerepe az emlőrák kialakulásában jól tanulmányozott, de az elhízás lehetséges szerepe ezen szteroid receptorok expressziójában nem egyértelmű. Egyelőre csak néhány tanulmány vizsgálta az elhízás és az összes ER összefüggését fehérjeszinten. Ebben a tanulmányban a Real Time PCR-t használtuk megbízható és robusztus technikaként a szteroid hormon receptorok génexpressziójának expressziós mintázatának értékelésére normál és elhízott emlőrákos betegeknél, hogy tanulmányozzuk az elhízás lehetséges hatását a szteroid hormonok génexpressziójára, és annak értékelésére, hogy ezek a megállapítások összhangban vannak a fehérje alapú módszerek eredményeivel.

Anyagok és metódusok

Betegek és minták

Ez a tanulmány leíró keresztmetszeti vizsgálat volt. Az összes mintát 70 olyan nőtől vettük, akiket biopszián vagy masztektómián műtöttek a Tabriz Emam Reza Kórházban 2009 júliusától 2010 májusáig. Az egész projektet a Tabriz Drug Applied Research Center-ben hajtották végre. A mintákat egy patológus szövettanilag vizsgálta a tumorsejtek jelenlétére nézve. A betegek a következő kritériumoknak feleltek meg: primer egyoldalú, nem metasztatikus emlőrák, amelyről teljes klinikai, szövettani és biológiai adatok álltak rendelkezésre; műtét előtt nincs sugárkezelés vagy kemoterápia. Az interjú után a műtét során a tumor szövetmintákat steril csövekben folyékony nitrogénbe vettük, majd a lehető leghamarabb elosztottuk és -70 ° C-on tároltuk a későbbi elemzésig. A kezelés mérésekre gyakorolt hatásának csökkentése érdekében kérdőíves adatokat nyertek a műtét előtt.

Testtömeg-index (BMI)

Ennek megfelelően a WHO Rep 2000 (Egészségügyi Világszervezet, 2000) BMI-t kg/m 2 -ként számították ki a diagnózis idején a klinikai feljegyzésekből származó információk felhasználásával. Az elemzések során a BMI-t két kategóriára osztották: BMI 2 (nem elhízott) és BMI ≥ 25 kg/m 2 (elhízott).

Kérdőív adatainak összegyűjtése- daganatos szövetek

Miután engedélyezték a betegek részvételét, minden alanytól írásos tájékozott beleegyezést kaptak. Minden résztvevő vállalta a kérdőív kitöltését. Információkat kellett felvenni a társadalmi demográfiai jellemzőkről, az életkorról, a menarkád életkoráról, a menstruációs előzményekről, a testtömeg-indexről és a menopauza állapotáról. A vizsgálat vak volt, és az adatgyűjtők nem voltak tisztában a tanulmány hipotézisével. Valamennyi résztvevő magasságát és súlyát standardizált technikákkal is mértük. A BMI-t, mint az általános elhízás mutatóját, a kilogrammban kifejezett tömeg és a magasság négyzetméterének hányadosa között számítottuk.

Minta előkészítés

Közvetlenül az interjú után 10 ml-es vérmintát vettünk kódolt EDTA-val kezelt csövekbe, és 3000 fordulat/perc sebességgel 10 percig szobahőmérsékleten centrifugáltuk a gyűjtéstől számított 1 órán belül. A plazmát, a Buffy-bevonatot és a vörösvérsejteket elválasztottuk, és a későbbi elemzésig -70 ° C-on tároltuk. A kezelés mérésre gyakorolt hatásának elkerülése érdekében kérdőíves adatokat és vérmintákat kaptak a végleges emlőrák-kezelés megkezdése előtt, beleértve a műtétet és/vagy a rádió- vagy kemoterápiát.

Szteroid hormon szint (plazma ösztrogén, androgén és progeszteron szint)

Az ösztrogén, az androgén és a progeszteron plazmakoncentrációit kereskedelmi forgalomban kapható kvantitatív szendvics-enzimhez kapcsolt immunszorbáns assay (ELISA) készletekkel (DRG Estradiol ELISA, EIA 2693, DRG Progesterone ELISA, EIA1561 és DRG Androgen ELISA, EIA-1559 Németország) határoztuk meg. . Ennek a vizsgálatnak az érzékenysége 9,714 pg/ml volt ösztradiolra, mind a progeszteronra, mind az androgénre 0,083 ng/ml volt. Az egyes tételekhez tartozó maszkos osztott mintákat használtuk a variációk együtthatójának (CV) kiszámításához a tételeken belül és között: az estaradiol, a progeszteron és az androgén intra- és inter-CV CV-je 6,81% és 7,25%, 5,4% és 9,96% alatt volt. illetve 4,16% és 9,94%. Az összes egyeztetett vérmintát azonos módon kezeltük, és ugyanazon analitikai futtatás során vizsgáltuk. A vérmintákat csak számmal jelöltük, és véletlenszerűen rendeltük az egyes esetek – kontroll párok között.

A teljes RNS előállítása

Az egyes daganatokból körülbelül 100 mg szövetet gyorsan lefagyasztottak folyékony nitrogénben, és kézzel kalapáccsal finom porra porítottak. A sejtport összegyűjtöttük, és tiszta RNáz-mentes csőben 1 ml RNX plusz reagensben szuszpendáltuk. 5 percig szobahőmérsékleten végzett inkubálás után a mintát pipettázzuk, majd 200 μl kloroform hozzáadásával kezeljük, majd szobahőmérsékleten 5 percig tartjuk, majd 15 másodpercig alaposan rázzuk. Az elegyet 15 percig 12 000 x g-vel centrifugáltuk, majd az RNS-t tartalmazó vizes fázist egy tiszta RNáz-mentes csőbe helyeztük. A teljes RNS-t 0,5 ml izopropil-alkohol hozzáadásával kicsapjuk, és szobahőmérsékleten 15 percig inkubáljuk. A teljes RNS-t tartalmazó pelletet 75% -os etanollal mossuk, és 7500xg sebességgel 8 percig centrifugáljuk. Az etanol szárítása után az RNS-pellet újra TE-pufferben szuszpendálódik. A teljes RNS koncentrációját az OD260/280 arány mérései alapján számítottuk ki, az RNS tisztaságának kezelésére szolgáló eszközként.

cDNS szintézis

Az RNS-t átalakítottuk cDNS-re, miután DNáz I-vel kezeltük. Az RNS reverz transzkripcióját 20 μl végtérfogatban végeztük cDNS első szálú szintézis készlet (Fermentase) véletlenszerű hexamer és 1 μg teljes RNS felhasználásával. A mintákat 65 ° C-on 10 percig és 42 ° C-on 60 percig inkubáltuk, és a reverz transzkriptázt inaktiváltuk 70 ° C-on 5 percig melegítve és 4 ° C-on 5 percig hűtöttük.

Valós idejű RT- PCR

Alapelv: A reakciókat a PCR-termék ciklusos amplifikációjának detektálása jellemzi, nem pedig a rögzített ciklusszám után felhalmozódott PCR-termék mennyisége. Ha a célmolekula mennyisége nagyobb volt, akkor korábban a fluoreszcencia jelentős növekedése figyelhető meg. A Ct (küszöbciklus) paramétert olyan ciklusszámként definiáljuk, amelynél a szonda hasításával generált fluoreszcencia egy rögzített küszöböt halad át az alapvonal felett. A ΔΔ-t használtukCT módszer relatív ERs gén expresszió meghatározására. A Ct minden célgénhez képest a Ct belső kontrolljának (béta-aktin gén).

Végeredmények, kifejezve: N-a tesztelt gén (elhízott) száma a kontroll génhez képest (egyik sem elhízott), az úgynevezettN szeres változásokat ”a következőképpen határoztuk meg:

N f o l d c h a n g e s = 2 (Δ C t T e s t - Δ C t c o n t r o l)

ahol ΔCt A minta és a kontroll értékeit az átlag levonásával határozzuk meg Ct a célgén értéke az átlagtól Ct a béta-aktin gén értéke.

qRT-PCR assay: standardok létrehozása a célgénhez

A PCR-vizsgálat egyenlő hatékonyságának biztosítása érdekében elkészítettük egy minta sorozatos hígítását, amely a kiválasztott gént magas szinten választotta ki, és mind az ER-ek, mind a kontroll gének standard görbéjét. A PCR hatékonysága mind a kontroll, mind a cél gén számára elfogadható volt. Ezenkívül az olvadási görbe elemzése azt mutatta, hogy csak egy szegmens volt (egy választás), és ez jelzi a kívánt specifikus PCR termék amplifikációját a vizsgálatunkban.

Az RNS koncentrációjának abszorbancia és cDNS szintézis alapján történő meghatározása után a cDNS pontos mennyiségét adtuk az egyes reakcióelegyekhez. Az mRNS molekulák kvantitatív detektálását kvantitatív, valós idejű RT-PCR technikával határoztuk meg a Syber Green-I (Fermentase Co. utasítás szerint) Rotor-Gene ™ 6000 rendszer (Corbett Research, Ausztrália) felhasználásával a gyártó utasításai szerint. . A cDNS-szintézis után specifikus primereket alkalmaztunk az ER-ek és a szteroid hormon receptorok, a progeszteron és az androgén receptor amplifikálására. (Az 1. táblázatban bemutatott alapozó szekvenciák). Humán béta-aktin mRNS-t választottak háztartási génnek (referencia gén), és a specifikus előre és reverz primerek alkalmazásával amplifikálták. Minden elemzésbe beletették a béta-aktin mRNS-t, amelyet belső kontrollként mértünk (egy mRNS, amely a sejttípustól függően nem változik bőségben). Röviden, mindegyik mintát normalizáltuk a betakarított sejtek számához. Az RNS kimutatásának protokollja 95 ° C-on 10 percen át denaturált. Ezt a lépést 40 denaturálási ciklus követte 95 ° C-on 15 másodpercig; izzítás 60 ° C-on 30 másodpercig; 72 ° C-on 30 másodpercig, majd 70 ° C és 95 ° C közötti olvadási görbe elemzéssel, a megfelelőség értékeléséhez.

1. táblázat: RT-valós idejű PCR alapozó szekvenciái.