Az elhízás okozta gyulladás összefügg a szubcelluláris cinkkészletek változásával és a szoptató egerek korai emlőmirigy-bevonásával.

A szerző közzététele: SR Hennigar, V Velasquez és SL Kelleher, nincsenek összeférhetetlenségek.

Stephen R Hennigar, Vanessa Velasquez, Shannon L Kelleher, Az elhízás okozta gyulladás összefügg a szubcelluláris cinkkészletekben bekövetkezett változásokkal és a tejelő egerek korai emlőmirigy-bevonásával, The Journal of Nutrition, 145. évfolyam, 9. szám, 2015. szeptember, 1999–2005. Oldal, https://doi.org/10.3945/jn.115.214122

Absztrakt

Háttér: A szoptatás kudarca gyakori a túlsúlyos és elhízott nőknél; a pontos mechanizmus azonban ismeretlen marad.

Célkitűzés: Megvizsgáltuk azt a hipotézist, miszerint az elhízás okozta gyulladás az emlőmirigyben (MG) újraelosztja a szubcelluláris cinkkészleteket, hogy elősegítse az emlő hámsejtjeinek (MEC) sejthalálát és az idő előtti involúciót.

Mód: A nőstény DBA/2J egereket 5 hétig magas zsírtartalmú (elhízott; zsírból 45% kcal, n = 60) vagy kontroll étrendet (sovány; 10% kcal zsírból, n = 50) táplálták és tenyésztették. Az MG citokineket és a makrofágok beszivárgását reverz transzkriptáz-polimeráz láncreakcióval, illetve F4/80 festéssel határoztuk meg. A cinkkoncentrációt atomi abszorpciós spektroszkópiával elemeztük, és immunblottal mértük a cink transzportereket és az endoplazmatikus retikulum (ER) stressz, autofágia és involúció markereit. A gyulladás hatásainak igazolására a tumor nekrózis faktor-α-t (TNF) vagy vivőanyagot injektálták a sovány laktáló C57BL/6 egerek szomszédos MG-ibe (n = 5), és a tenyésztett MEC-eket (HC11 sejtek) TNF-vel kezeltük in vitro.

Eredmények: Az elhízott egerek 77 százaléka nem tudott laktálni (sovány: 39%; P 2; sovány: 63,8 ± 8,9 makrofág/mm 2; P

Bevezetés

A reproduktív korú nők több mint egyharmada túlsúlyos (BMI: 25–29 kg/m 2) vagy elhízott (BMI: ≥30 kg/m 2) (1). A túlsúly vagy az elhízás károsítja az emlőmirigy (MG) 6 működését, és veszélyezteti a laktáció megkezdésének és fenntartásának képességét [áttekintette Jevitt et al. (2), Rasmussen (3) és Stuebe és mtsai. (4)]; az elhízott nők laktációs rendellenességeiért felelős biológiai mechanizmusok azonban nem tisztázottak.

Az adipociták számos proinflammatorikus citokint választanak ki, beleértve az IL-6-ot, az IL-1β-t és a monocita kemotaktikus fehérjét 1 (MCP-1). Valójában nagyobb TNF és IL-6 expresszió detektálható elhízott patkányok MG-jében (5). Mind a TNF, mind az MCP-1 kemoattraktánsként működik a makrofágok toborzásában (6), amelyek viszont citokint, például IL-6-ot, TNF-et és kolóniastimuláló 1-es faktort (CSF1) (7) választanak ki, fenntartva az előgyulladásos fenotípust. Ez különösen fontos, mert a TNF-ről kimutatták, hogy aktiválja a posztlaktációs involúciót (8, 9). Továbbá mind a laktáció (10), mind az elhízás (11) az endoplazmatikus retikulum (ER) fokozott stresszének fiziológiai állapotát hozza létre. Az ER stressz jelzés mozgásba hozza a kibontakozott fehérjeválasz (UPR) rövid távú citoprotektív mechanizmusát, amely a fehérje transzlációjának csillapítását koordinálja a makroszofofágiaként ismert (itt autofágiaként ismert) lizoszómális-degradációs út növekedésével és az ER- a sejthalál elleni védelemhez kapcsolódó lebontási út (12, 13). Tartós ER stressz esetén az UPR csökken, és apoptotikus mechanizmusok aktiválódnak (14). Tehát az emlő hámsejtjei (MEC) képesek hatékonyan kezelni a laktációban rejlő ER stresszt és autofágiát, de az elhízás hozzáadott fiziológiai stressz a halál fenotípusát a halál felé billentheti.

A szubcelluláris cinkkészletekben bekövetkező változások alapjául szolgálhatnak az autofágia, az ER stressz és a sejthalál aktiválása. A lizoszómákban a cink felhalmozódása aktiválja az autofágia tenyésztett idegsejtekben (15) és a lizoszómák által közvetített sejthalál MEC-ekben (9). A 2-es cinktranszporter (ZnT2) normál körülmények között cinket szekréciós vezikulákba importál a laktáció alatt (16), és nem található meg a nullos vagy laktáló egerek vagy MEC-ek lizoszómáiban (16, 17). Nemrégiben azonban azt tapasztaltuk, hogy a TNF újraelosztja a ZnT2-t, hogy felhalmozódjon a cink a lizoszómákban, és aktiválja a MEC-ek lizoszomális közvetítésű sejthalálát az MG involzió kezdeti szakaszában (9). Ezenkívül az ER cink kimerülése aktiválja az ER stresszt (18–20), a funkcióvesztés mutációi pedig az ER cinkexportőr Catsup [humán zrt- irt-szerű fehérje 7 (ZIP7) homológ] hatására károsodik a szekréciós kereskedelem és aktiválódik a sejthalál. (21) Itt teszteltük azt a hipotézist, miszerint az elhízott MG proinflammatorikus mikrokörnyezete megváltoztatja az ER és a lizoszomális cinkkészleteket, szekréciós hibákat, sejthalált és korai involúciót eredményezve.

Mód

Egér tartása.

Ezt a tanulmányt a Pennsylvaniai Állami Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá, amelyet a Laboratory Animal Care International Association of Assessment and Accreditation Association akkreditált. Az összes egeret egyedileg polikarbonát ketrecekben helyezték el, szabadon hozzáférhettek a takarmányhoz és a vízhez, és 12 órás világos/sötét ciklusban tartották őket szabályozott hőmérséklet és páratartalom mellett.

A diéta okozta elhízás egérmodellje.

A hím és nőstény DBA/2J egereket kereskedelemben (Jackson Laboratories) szereztük be 3 hetes korban. 4 hetes korban a nőstény egereket véletlenszerűen vagy magas zsírtartalmú (45% kcal zsírból, n = 60), vagy kontroll (10% kcal zsírból, n = 50) étrendhez (D12451 és D12450B) rendelték;, Inc.). Az étrend összetétele hasonló volt, kivéve a zsír- és szénhidráttartalmat ( 1. kiegészítő táblázat ), és általában étrend által kiváltott elhízási modell létrehozására használják (22–25). A magas zsírtartalmú étrendet tápláló egereket étrend által kiváltott elhízottakként határozták meg, miután testtömegük> 2 SD-val meghaladta a kontroll étrendtel táplált csoport átlagát (~ 20% -kal nehezebb) (26). A nőstény egereket pározták, és hagyták őket természetes úton elszabadulni. Az egereket vemhesség alatt a laktáció napjáig (LD) 5-ig etették. Az almokat lemértük, és az alomra jutó kölykök számát megszámoltuk a születés napján és az LD 5-nél. A vizsgálatot a korai laktáció alatt abbahagytuk, mivel ebben az étrend által kiváltott elhízási modellben jelentős mértékű alomvesztés következett be.

TNF-injektált egerek.

Az egereket tenyésztették és az almokat 6 kölyök/gát értéken tartották. A TNF-et (R&D Systems) laktáló egerek (n = 5) MG-jébe injektáltuk, az előzőekben leírtak szerint (8, 9).

Sejtkultúra.

Az egér MEC-k (HC11) Jeffrey Rosen (Baylor College of Medicine, Houston, Texas) ajándékai voltak, és Bernd Groner (Biomedical Research Institute, Frankfurt, Németország) engedélyével használták fel őket. A sejteket az előzőekben leírtak szerint tartottuk fenn (9). A HC11 sejtek szekréciós fenotípussá történő megkülönböztetéséhez a sejteket differenciáló táptalajban (szérummentes növekedési táptalajban, epidermális növekedési faktor nélkül, 1 μg/ml prolaktinnal és 1 μM kortizollal kiegészítve) tenyésztettük 24 órán át 37 ° C-on. Differenciálás után a sejteket előkezeltük cink-szulfáttal (10 μM) 3 órán át a táptalajon, majd inkubáltuk TNF-el vagy anélkül (15 μg/l) 24 órán át szérummentes táptalajban 37 ° C-on.

Tejváladék.

A tej szekrécióját sovány és elhízott egerekben (n = 5–6 egér/csoport) mértük LD 5-en, mérés-szívás-mérés technikával 30 perc alatt (27). Az egereket szén-dioxid inhalációval leöltük, és az MG-ket 4% foszfáttal pufferolt paraformaldehidben rögzítettük egy éjszakán át.

Tej- és szövetgyűjtés.

A tejet manuálisan (n = 6–8 egér/csoport) expresszáltuk LD 5-en (28). Az egereket szén-dioxid belégzésével leöltük. Az elemzéshez inguinalis MG-ket használtunk. A fehérjeelemzéshez használt MG-ket szárazjégre fagyasztották, és az elemzésig -80 ° C-on tárolták. Az RNS-hez felhasznált MG-ket RNS-anyagban (Sigma-Aldrich) tároltuk -20 ° C-on az elemzésig.

Tejfehérje koncentráció.

A teljes tejet (n = 6–8 egér/csoport) 2000 x g-vel 15 percig 4 ° C-on centrifugáltuk. A krémréteget pipetta hegyével elkapartuk, és a fölözött tejet egy tiszta csőbe helyeztük. A sovány tejet 2 térfogatrész pufferben (50 mol/l Na2PO4, 150 mmol/l NaCl, 50 mmol/l EDTA) hígítottuk, és kétszer centrifugáltuk 11 600 x g-vel 15 percig 4 ° C-on. A felülúszó fehérjekoncentrációját Bradford-esszével mértük.

Szövettan.

A paraformaldehiddel fixált MG-ket (n = 3 egér/csoport) etanolban sorozatosan dehidratáltuk, paraffinba ágyazottuk, és (5 μm) pozitív töltésű üveglemezekre osztottuk (28). A metszeteket hematoxilinnal és eozinnal (H&E) festettük, és immunhisztokémia alkalmazásával értékeltük (28). H & E-vel festett metszeteket használtunk az adipocita szám és méret értékeléséhez. Megszámoltuk az adipociták számát 3 véletlenszerű területen, 4x-es nagyítás mellett, és adipociták/egységnyi egység (mm2) ± SD számaként fejeztük ki. Az adipocita méretét úgy értékeltük, hogy összehasonlítottuk a H & E-vel festett képek maximális adipocita-átmérőjét a Photoshop vonalzó eszközével. Patkány anti-egér F4/80-at (makrofág marker, 1: 1000; MCA497; AbD Serotech) használtunk immunfestésre, és biotinilált kecske anti-patkány IgG-vel (Vector Labs) detektáltuk, amelyet az ABC Vectastain kit (Vector Labs) segítségével tettünk láthatóvá, és toluidinkékkel (EMD) ellenfestjük. Az F4/80-ra pozitívan festődő sejtek számát 3 véletlenszerű területen számoltuk meg 10-szeres nagyítással, és átlag ± SD/egységnyi egységként fejeztük ki (mm2). A metszeteket Leica DM IL LED mikroszkóp és LAS V3.6 szoftver (Leica Microsystems) segítségével készítettük.

Valós idejű relatív RT-PCR.

Az MG-ket (n = 7–8 egér/csoport) TRIzol-ban (Sigma-Aldrich) homogenizáltuk, és az RNS-t a gyártó utasításainak megfelelően izoláltuk (Invitrogen). Valós idejű PCR-t a korábban leírtak szerint hajtottunk végre (16). Az alapozó szekvenciákat a Primer3 (Whitehead Institute for Biomedical Research; 2. kiegészítő táblázat ), és a specifitást az egyetlen hőmérsékleti disszociációs csúcs értékelésével validáltuk (az adatokat nem mutatjuk be). Mindegyik mintát duplikátumban mértük, és β-aktinná (Actb) normalizáltuk. Az adatokat a sovány csoport hányadosaként fejeztük ki (átlag ± SD).

Szubcelluláris frakcionálás.

Nyers membránfehérjéket (29) és szubcelluláris frakciókat (30) izoláltunk a korábban leírtak szerint.

Savfoszfatáz aktivitás.

A lizoszomális aktivitás és az autofágia indexeként savas foszfatáz aktivitást alkalmaztunk. Az aktivitást egy kereskedelemben kapható készlet (CS0740; Sigma-Aldrich) segítségével mértük, az előzőekben leírtak szerint (9).

Immunblot.

Statisztikai analízis.

Az eredményeket átlag ± SD-ként mutatjuk be. A statisztikai összehasonlításokat Student t tesztjével (Prism GraphPad) végeztük. χ 2 -analízist (Fisher pontos tesztje) alkalmaztunk a laktációt fenntartani képes egerek számának összehasonlítására. Ismételt mértékű ANOVA-t használtunk a takarmánybevitel és a testsúly összehasonlítására. Az étrend jelentős hatását a 3. kiegészítő táblázatban mutattuk ki ). Az elhízott egerek> 20% -kal nehezebbek voltak, mint a kontroll étrendet etetett egerek 5 hét után (3. kiegészítő táblázat). A fogamzás aránya ~ 34% -kal alacsonyabb volt (P 4. kiegészítő táblázat ). Továbbá, lényegesen több elhízott anya (77%) nem tudta ápolni utódait az LD 5 felett a sovány gátakkal szemben (39%; P 5, 31, 32), azt találtuk, hogy az elhízott egerek gyulladásos MG mikrokörnyezetének jellemzőit mutatják. Az elhízott szoptató egerek MG-súlya (0,65 ± 0,06 g) szignifikánsan magasabb volt, mint a sovány szoptatós egerek MG-súlya (0,47 ± 0,05 g; P 2), összehasonlítva a sovány szoptató egerekkel (772 ± 53,8 adipocyták/mm2; P = 0,38). Az elhízott szoptató egerek MG-jeinek adipocita-mérete azonban 100% -kal nőtt a sovány szoptató egerek adipocitáihoz képest (1A. Ábra). A makrofágbőség szignifikánsan nagyobb volt az elhízott szoptató egerek MG-jában (135 ± 40,4 makrofág/mm 2), mint a sovány laktációs egerek MG-jében (63,8 ± 8,9 makrofág/mm 2; P 1B ábra). Ezek a tanulmányok megerősítették, hogy az elhízás gyulladásgátló mikrokörnyezetet hoz létre az MG-ben.

Adipocita méret és citokin mRNS expresszió sovány laktáló és elhízott laktáló egerek MG-jében. (A) A H & E-vel festett szakaszok reprezentatív képei. Az adipocita mérete látható (skála oszlop = 100 μm). (B) Citokin mRNS expresszió. Az adatok átlag ± SD-k, n = 8 (sovány szoptatás) vagy n = 7 (elhízott szoptatás). * Eltér a sovány szoptató egerektől, P 2A ábra). Ezután megmértük a ZIP7 mennyiségét, és azt találtuk, hogy a ZIP7 valamivel alacsonyabb volt az elhízott laktáló egerek MG-jében, mint a sovány laktáló egerek MG-jében (2B. Ábra; P 1. kiegészítő ábra ) elhízott szoptató egerek MG-jéből izolálva, összehasonlítva a sovány szoptató egerekből izolált azonos frakciókkal (2C. ábra; P 8, 9). Megállapítottuk, hogy a HSPA5 expressziója elnyomódott a TNF-be injektált MG-kben a sóoldattal injektált MG-khez képest (3A ábra; P 3B ábra; P 3C ábra; P 3D ábra; P = 0,85). Sőt, bár a TN7-stimulált sejtekben a ZIP7 bőségének enyhe csökkenését észleltük in vitro, ez statisztikailag nem volt szignifikáns (3E. Ábra; P = 0,11). Összességében ez azt sugallja, hogy a TNF proinvolúciós jel elnyomja az ER stresszt és a ZIP7 bőségét, de a TNF nem az egyetlen tényező, amely részt vesz az ER cinkkészletének növekedésében az involúció során.

A TNF hatása az ER stressz és a cink anyagcsere markereire sovány szoptató egér MG-kben in vivo és differenciált MEC-ek in vitro. A HSPA5 fehérje-bőségének reprezentatív immunblotjai (A) TNF- és vivőanyaggal injektált egér MG-k in vivo és (B) HC11 MEC-ek in vitro. (C) A ZIP7 fehérje-bőségének reprezentatív immunblotja TNF-ben és vivőanyaggal injektált MG-kben. (D) TNF- és vivőanyag-injektált MG-kből izolált ER/Golgi készülékben dúsított frakciók cinkkoncentrációja. Az adatok átlag ± SD-k, n = 5 egér/csoport. * P 4A. Ábra; P 33) és v-ATPáz expresszió (4B. Ábra; P 34) a sovány laktáló egerekhez képest. Amikor az autofágia aktiválódik, a citoszolban található LC3-I fehérjét lipidálják és LC3-II-ként inszertálják az autofagoszómák membránjaiba (35).

A lizoszómás aktivitás/autofágia és a cink anyagcsere markerei sovány laktató és elhízott laktáló egerek MG-jében. (A) Az adatok átlag ± SD-k, n = 5 egér/csoport. * P + -ATPáz; ZnT2, cink transzporter 2.

Végső soron tanulmányunk azt szemlélteti, hogy a laktáció alatt az elhízással járó hozzáadott patofiziológiai ER stressz a fenotípust a sejthalál felé tereli, elhízott egerekben hajlamossá teszi a MG-ket a laktációs kudarcra. Mivel megnövekedett lizoszómás aktivitást és autofágiát tapasztalunk, az ER stressz szuppressziója valószínűleg visszacsatolás eredménye, az elhízott MG-ben a átalakító mechanizmusok aktiválása miatt. Fontos, hogy mechanisztikus vizsgálataink újszerű kapcsolatot teremtenek az elhízás okozta gyulladás, a megváltozott szubcelluláris cinkkészletek és az idő előtti MG involúció aktiválása között. Eredményeinkkel összhangban mások megmutatták, hogy az elhízás által kiváltott MG-gyulladás megfordul a kalória-korlátozás hatására (47). A jövőbeni vizsgálatoknak meg kell határozniuk, hogy a gyulladás terhesség előtti vagy terhességi megszüntetése hatékony stratégia-e a laktáció sikerének valószínűségének növelésére.

Köszönetnyilvánítás

VV és SLK megalkotta a vizsgálatot; SRH, VV és SLK tervezték a kísérleteket és elemezték az adatokat; SRH és VV végezték a kísérleteket; SRH és SLK írta a kéziratot; Az SLK volt az elsődleges felelősség a végső tartalomért. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot.