Az emberi bélbaktériumok közösségei megváltoznak a keresztesvirágú zöldségek hozzáadásával az ellenőrzött gyümölcs- és zöldségmentes étrendhez 1–3

Fei Li

4 Fred Hutchinson Rákkutató Központ, Seattle, WA 98109 és 5 Interdisplináris Táplálkozástudományi Doktori Program, Washington Egyetem, Seattle, WA 98195

Meredith A. J. Hullar

4 Fred Hutchinson Rákkutató Központ, Seattle, WA 98109 és 5 Interdisplináris Táplálkozástudományi Doktori Program, Washington Egyetem, Seattle, WA 98195

Yvonne Schwarz

4 Fred Hutchinson Rákkutató Központ, Seattle, WA 98109 és 5 Interdisplináris Táplálkozástudományi Doktori Program, Washington Egyetem, Seattle, WA 98195

Johanna W. Lampe

4 Fred Hutchinson Rákkutató Központ, Seattle, WA 98109 és 5 Interdisplináris Táplálkozástudományi Doktori Program, Washington Egyetem, Seattle, WA 98195

Társított adatok

Absztrakt

Bevezetés

Beavatkozási vizsgálatok kimutatták, hogy az étrend befolyásolhatja a bélbaktériumok összetételét (23–28). Egy nemrégiben készült tanulmány kimutatta, hogy a keleti kelbimbó, egy keresztes növényű növény, megváltoztatta a bélbaktériumok sokféleségét és metabolikus aktivitását az emberi ürülékbaktériummal összefüggő patkányokban (29). Tudomásunk szerint azonban a keresztesvirágú zöldségfogyasztás emberben a bélbaktériumok összetételére gyakorolt hatását mindeddig nem vizsgálták. Feltételeztük, hogy a keresztesvirágú zöldségek szelektív hatást gyakorolnak bizonyos bélbaktériumokra, amelyek részt vesznek a keresztesvirágú zöldségek alkotórészeinek (pl. Rost, glükozinolátok stb.) Metabolizálásában. Ennek a vizsgálatnak az volt a célja, hogy megvizsgálja, hogy a keresztesvirágú zöldségbevitel mennyiben változtatja meg a bélbaktériumok összetételét a keresztesvirágú zöldség-kiegészítők randomizált, keresztezett vizsgálatában.

Anyagok és metódusok

Humán tantárgyak.

Ez a tanulmány kiegészítő volt egy randomizált, keresztezett, kontrollált táplálkozási vizsgálathoz, amelyet úgy terveztek, hogy tesztelje a kiválasztott biotranszformációs enzimek válaszát a keresztesvirágú növényi kiegészítőkre (30). A résztvevők egészséges, nem dohányzó, 20–40 éves férfiak és nők voltak, akiket GSTM1, GSTT1 és CYP1A2 genotípusok alapján toboroztak. A kizárási kritériumok kiterjedt listája volt, amely meghatározta a résztvevők alkalmasságát a szülői tanulmányra (30). A jelenlegi vizsgálat szempontjából relevánsak voltak: a gyomor-bélrendszeri rendellenességek kórtörténete; ismert allergia/intolerancia a táplálkozási kísérlet során használt élelmiszerekre; antibiotikum-használat az elmúlt 3 hónapban; vényköteles és vény nélkül kapható gyógyszerek jelenlegi használata; súlyos és gyakori székrekedés, amely egészségügyi szakember kezelését és/vagy gyakori gyógyszeres kezelést igényel. Demográfiai információkat [életkor, nem, faj, testtömeg és magasság] gyűjtöttünk, és a szűrés során megmértük a genotípusokat. Valamennyi tevékenységet a Fred Hutchinson Rákkutató Központ Intézményi Felülvizsgálati Testülete hagyta jóvá, és tájékozott, írásos beleegyezést kapott a vizsgálat résztvevőitől.

Diétás beavatkozás.

Székletmintagyűjtés.

A székletmintákat 17 résztvevőtől gyűjtöttük egy időpontban, a bazális és a kettős keresztes növényi étrend végén. A résztvevőket székletgyűjtő csövekkel láttuk el, amelynek kanala a fedélben volt (76 × 20 mm; Sarstedt), és 5 ml RNAlatert (Ambion) tartalmaztak. Utasítást kaptak, hogy a székletürítés pillanatában azonnal gyűjtsenek össze 2 borsó méretű széklet-székletet, és helyezzék a székletet a gyűjtőcsövekbe, és rázással alaposan keverjék össze. A mintákat 24 órán belül a laboratóriumba szállítottuk, és -80 ° C-on tároltuk.

Vizelet ITC elemzése.

Huszonnégy órás vizeletgyűjtést nyertek a résztvevőktől minden diéta periódusának 13. napján. A vizeletből származó teljes ITC kiválasztódást (becsült összditiokarbamátként) HPLC-vel határoztuk meg a korábban leírtak szerint (32).

A baktériumok teljes fekális DNS-extrakciója.

Az RNAlaterben lévő székletmintákat OMNI 115 szövethomogenizátorral homogenizáltuk, és 300 μl-es alikvotokba osztottuk. A fekális baktérium genomi DNS-t QIAamp DNS széklet minikit (Qiagen) alkalmazásával extraháltuk 1 perc gyöngyveréssel (21).

tRFLP.

A tRFLP analízist a korábban leírt módszerek módosításával végeztük (21). A bakteriális 16S rRNS gént fluoreszcensen jelölt primer alkalmazásával amplifikáltuk. A PCR-termékeket megtisztítottuk, majd 0,025 mmol/l minden dNTP-vel és 2 egység Klenow-val (exo -) (New England BioLabs) kezeltük, hogy az 5'-túlnyúlásokat 37 ° C-on 30 percig feltöltjük (33). A Klenow enzimet 70 ° C-on 10 percig dezaktiváltuk, és a DNS-t egy éjszakán át 37 ° C-on emésztettük 5 U Alu-val 20 μl reakciótérfogatban. Az egyes mintákból emésztett DNS-t (20 ng) használtunk a tRFLP elemzéshez. A töredékelemzést kapilláris elektroforézissel végeztük ABI 3100-on (Applied Biosystems) a Fred Hutchinson Rákkutató Központ Genomics Shared Resource-ján. GeneScan ROX jelzéssel ellátott GS500-at (Applied Biosystems) alkalmaztunk belső méretméretként.

ASZTAL 1

A résztvevők napi energia- és makrotápanyag-bevitele, amikor gyümölcsöt és zöldséget nem tartalmazó alaptáplálékot fogyasztottak, valamint a keresztesvirágú zöldségekkel kiegészített alapdiétát (kettős keresztesvirágú zöldségdiéta) 1

MacronutrientBázis étrendKettős keresztes növényi étrend

Teljes energia, kJ/d	9577 ± 2318	9556 ± 1858
Szénhidrát, g/d	319 ± 75	330 ± 68
Zsír, g/d	74 ± 19	72 ± 14
Fehérje, g/d	87 ± 22	93 ± 17
Rost, g/d	8,9 ± 2,3	28,6 ± 5,8 *

A résztvevők bélbaktérium-közösségének tRFLP profiljainak klaszteranalízise a bazális étrend (B) és a kettős keresztes növényi étrend (D) periódusok után. A B vagy D előtti szám jelzi a résztvevő számát (1–17). Az egyes mintákon belül három ismétlődés látható 3 ágként minden centroidban. A Wishart objektív függvényét használták fel a bakteriális közösség különbségének mérésére a hierarchikus dendrogramban, és átértékelték százalékos hasonlóságként.

Az ISA szerint 5 tRFLP-fragmens volt szignifikánsan összefüggésben a diéta periódusával ( 2. táblázat ). Közülük négy szignifikánsan összefügg a keresztesvirágú zöldségfogyasztással, egy pedig az alapdiétával. A szekvenált bakteriális 16S rRNS gének in silico emésztésével azonosítottuk ezen tRFLP fragmensek feltételezett taxonómiai hovatartozását és legközelebbi rokonait (2. táblázat).

2. TÁBLÁZAT

tRFLP-fragmensek, amelyek jelentősen társulnak az ISA 1 2 kontrollált étrendjéhez

tRFLP töredékek, alap pairIndicator érték 2 Társult étrendTaksonomiai hovatartozás 3 A legközelebbi rokonokhoz hasonlóság

159	40.1	Dupla 4	Firmicutes	E06, F05, G01	Eubacterium hallii	98% 5
219	17.6	Kettős	Firmicutes	C04, C08	Phascolarctobacterium faecium	99%
222	32.8	4. alap	Proteobaktériumok	N 6	Burkholderiales	N
241	48.3	Kettős	Bacteroidetes	B03	Alistipes putredinis	98%
468	23.5	Kettős	Actinobaktériumok	N	Eggerthella spp.	N

A bélbaktérium 16S rRNS gén klón könyvtárának filogenetikai elemzése.

A széklet baktérium 16S rRNS gén klón könyvtárából nyert szekvenciaadatokat a GenBank adatbázisokhoz> FJ227596 -> FJ227683 regisztrációs szám alatt juttattuk el. Ebben a klónkönyvtárban a Firmicutes, Bacteroidetes és Actinobacterium tagjai képviseltették magukat ( 2. ábra ). Nagy rész (74%) a Clostridia osztályba tartozik, 54% a XIVa klaszterben és 19% a IV. A klónok további 6% -a a Firmicutes Bacilli osztályába tartozott. A klónok másik 19% -a Bacteroidetes volt, míg az Actinobacteria klón csak a könyvtár klónjainak 1% -át képviselte.

Keresztesvirágú zöldségfogyasztás után 1 résztvevő fekális baktériumközösségéből amplifikált 16S rRNS gén filogenetikai elemzése. A kiválasztott baktériumfajokat referenciaként felvettük a filogenetikai fába. A rendszerindítási érték> 95 értéket a fán, a klónok számát pedig zárójelben tüntetjük fel, ha egynél több van. *, Actinobacteria csoport.

Vita

Ebben a tanulmányban egy randomizált, keresztezett táplálkozási vizsgálat részeként megvizsgáltuk a magas keresztes keresztű növényi étrend, valamint a gyümölcsök és zöldségek nélküli étrend hatását a bélbaktériumok közösségére. Megmutattuk, hogy: 1) minden résztvevőnek egyedi bélbaktérium-összetétele volt, még akkor is, ha minden egyén ugyanazon ellenőrzött étrendben részesült; 2) a bélbaktériumok összetétele jelentősen különbözött, amikor a résztvevők gyümölcsöt és zöldséget nem tartalmazó alaptáplálékot fogyasztottak, összehasonlítva a keresztesvirágú zöldségekkel kiegészített étrenddel; 3) specifikus baktériumfajok társultak a keresztesvirágú zöldségbevitelhez; és 4) a bél baktériumközösség válasza a keresztesvirágú zöldségfogyasztásra egyedileg volt egyedi, de nem volt közvetlenül összefüggésben az elfogyasztott keresztesvirágú zöldségek mennyiségével.

Az ISA és a 16S rRNS gének szekvenálása segítségével feltételezhető fajokat tudtunk azonosítani, amelyek jelentősen különböztek a 2 beviteli periódus között. A tRFLP-fragmensek valószínűleg Eubacterium hallii, Phascolarctobacterium faecium, Alistipes putredinis és Eggerthella spp. a keresztesvirágú zöldségbevitelhez kapcsolódtak, és a Burkholderiales néven azonosított fragmentum az alap diétához kapcsolódott (2. táblázat). Ezen fajok némelyike filogenetikailag rokon a korábban leírt baktériumokkal, amelyek képesek metabolizálni a keresztesvirágú növényi komponenseket, például a rostot, a lignánt és a glükozinolátokat. Például kiderült, hogy az Eggerthella metabolizálja a lignánokat; a Bacteroidales rendjébe tartozó számos faj, amelyhez az Alistipes putredinis tartozik, lebonthatja a rostokat és a glükozinolátokat (11,12,14,16,44,45). Ez tovább erősíti az alkalmazott molekuláris megközelítések hatékonyságát az étrendre adott bakteriális közösség reakcióinak vizsgálatakor.

Összefoglalva, megmutattuk, hogy szignifikáns különbség mutatkozott a bélbaktériumok közösségében a keresztesvirágú zöldségekben gazdag étrend 14 napos fogyasztása után, összehasonlítva a gyümölcs- és zöldségmentes alapdiétával. Ez a baktériumközösségbeli különbség egyedülálló volt. Több feltételezett bélbaktérium-fajt is azonosítottunk, amelyek az adott étrendhez kapcsolódtak, és további bizonyítékokat szolgáltattak arra vonatkozóan, hogy a bélbaktériumokat az étrendi összetevők gyorsan módosíthatják. Ez a tanulmány azt is kimutatta, hogy a tRFLP elemzés hasznos megközelítés a bélbaktériumok közösségének összetételének értékeléséhez és az étrendi beavatkozás miatti közösségszerkezeti változások nyomon követéséhez. További vizsgálatokra van szükség az intenzív bélbaktériumok válaszának meghatározásához specifikus keresztesvirágú növényi komponensekre, például glükozinolátokra.