Az EMD386088 metabolikus és kardiovaszkuláris előnyei és kockázatai - 5-HT6 receptor részleges agonista és dopamin transzporter inhibitor

Magdalena Kotańska

1 Farmakodinamikai tanszék, Gyógyszerésztudományi Kar, Jagiellonian University Medical College, Krakkó, Lengyelország

Joanna Śniecikowska

2 Gyógyszerészeti Kémia Tanszék, Gyógyszerésztudományi Kar, Jagiellonian University Medical College, Krakkó, Lengyelország

Magdalena Jastrzębska-Więsek

3 Klinikai Gyógyszerészeti Tanszék, Gyógyszerésztudományi Kar, Jagiellonian University Medical College, Krakkó, Lengyelország

Marcin Kołaczkowski

2 Gyógyszerészeti Kémia Tanszék, Gyógyszerésztudományi Kar, Jagiellonian University Medical College, Krakkó, Lengyelország

4 Adamed Ltd., Pieńków, Lengyelország

Pytka Karolina

1 Farmakodinamikai tanszék, Gyógyszerésztudományi Kar, Jagiellonian University Medical College, Krakkó, Lengyelország

Absztrakt

Bevezetés

A szerotonerg 5-HT6 receptorok központi idegrendszeren belüli megoszlása magában foglalja a hipotalamusz régiókat, amelyek fontos szerepet játszanak az étvágyban, az ételbevitelben és a testsúlykontrollban (Heal és mtsai., 2008). A vizsgálatok azt mutatták, hogy az 5-HT6 receptor ligandumok elhízás elleni aktivitással bírhatnak (Woolley és mtsai, 2001; Heal és mtsai, 2008; Karila és mtsai, 2015). Az 5-HT6 receptor antagonisták (azaz PRX-07034, Ro 04-6790, BVT 5182, SB 271046) csökkentették a táplálékfelvételt azáltal, hogy fokozták a jóllakottságot, és mély súlycsökkenést okoztak az elhízás különféle rágcsáló-modelljeiben (Heal et al., 2008; Karila és mtsai., 2015). Érdekes módon Fisas és mtsai. (2006) kimutatta az E-6837 - egy részleges 5-HT6 receptor agonista - elhízásellenes hatását. A vegyület jelentős hypophagia-t okozott nem elhízott és étrend okozta elhízott patkányokban (Fisas és mtsai, 2006; Heal és mtsai, 2008).

A dopamin transzporter továbbra is potenciális célpontja az antagonista vagy antagonista-szerű szubsztitúciós terápiáknak a stimulánsokkal való visszaélés, valamint az elhízás szempontjából (Schmitt és Reith, 2010; Reith et al., 2015). A dopaminreceptor agonisták csökkentik az orexigenikus neuropeptid és az Y neuropeptid megemelkedett szintjét a hipotalamuszban, és normalizálják az elhízott ob/ob egerekben megfigyelt hiperfágia, testtömeg-növekedést és hiperglikémiát (Bina és Cincotta, 2000). A megnövekedett extracelluláris dopaminszint (amelyet a dopamin transzporter gátlása okoz) részben részben a bupropion - egy dopamin és noradrenalin transzporter inhibitor - hipofág és termogén hatásait okozza. Sőt, Liu és mtsai. (2004) bebizonyította, hogy a D1/D2 receptor blokád jelentősen gyengítette a bupropion által kiváltott termogenezist.

A megnövekedett dopaminszint befolyásolhatja a vérnyomást (Volkow és mtsai, 2003) és a zsigeri betegségeket (Takeda és mtsai, 1993). A magas vérnyomást gyakran megfigyelik olyan betegeknél, akiket dopaminnal és noradrenalin-gátlókkal, például bupropionnal (Cunningham és Wiviott, 2014) és tesofenasinnal kezeltek (Appel és mtsai, 2014). Ezenkívül a naltrexon/bupropionhoz kapcsolódó gyakori mellékhatások közé tartozik az émelygés, a hányás (Makowski et al., 2011).

Az EMD386088-at először Mattsson et al. (2005) 5-HT6 receptor agonistaként (EC50 = 1,0 nM), amely szelektivitást mutat más 5-HT receptorokkal szemben, kivéve az 5-HT3-at. Nem volt affinitása az α1, α2, β1, D2, D3, GABAA, opioid μ receptorok és 5-HT transzporterek iránt sem (Jastrzebska-Wiesek et al., 2013). A mérsékelt affinitás ellenére az EMD386088 sem a szerotonin-5-HT3 receptor agonistaként, sem antagonistájaként nem hatott a biofunkciós vizsgálatokban (Jastrzebska-Wiesek és mtsai, 2014). A legújabb in vitro vizsgálatok azt mutatták, hogy az EMD386088 erős 5-HT6 receptor részleges agonistaként viselkedett (Jastrzebska-Wiesek et al., 2013). Az EMD386088 szintén jelentősen blokkolta a dopamin transzportert (Jastrzebska-Wiesek et al., 2016).

Az EMD386088 érdekes farmakológiai profilja azt jelzi, hogy az ilyen típusú vegyületek előnyösek lehetnek az elhízás kezelésében. Ezért a jelen tanulmányban az EMD386088 testtömegre, táplálékfelvételre és anyagcserezavarokra gyakorolt hatásának értékelését tűztük ki célul a magas zsírtartalmú étrend okozta elhízás modellben és a patkányok túlzott étkezésének modelljében. Meghatároztuk a vegyület hányás kiváltó képességét és a vérnyomásra gyakorolt hatását is.

Anyagok és metódusok

Állatok

A kísérleteket hím Wistar patkányokon végeztük. A kezdeti testtömeg: 140–160 g: elhízási modell, 190–220 g: a túlzott evés modellje, vagy 190–220 g: olyan patkányok, amelyeknél az elhízás vagy a túlzott evés modelljét nem indukálták. Az állatokat párban műanyag ketrecekben helyeztük el állandó hőmérsékletű, világos-sötét ciklusnak kitett helyiségekben; víz és étel ad libitum volt elérhető. A kontroll és a kísérleti csoportok mindegyike hat-nyolc állatból állt. Valamennyi kísérletet a Jagelló Egyetem Állathasználati és Gondozási Bizottságának irányelvei szerint hajtották végre, és jóváhagyásra kerültek (2013 és 2015, Lengyelország; Engedélyek száma: 136/2013 és 258/2015).

Gyógyszerek és vegyületek

A heparint a Polfa Warszawa S.A. (Varsó, Lengyelország) szállította, míg a tiopental-nátrium és a ketoprofen a Sandoz GmbH-tól (Ausztria), a ketamin és a xilazin a Biowet Puławy-tól (Lengyelország), a cefuroxim pedig a Polfarma S.A.-tól (Lengyelország). Az EMD 386088-at (1. ábra) 1) a Jagiellonian University Medical College, Gyógyszerészeti Kémia Tanszékén szintetizálták, Krakkó, Lengyelország. Az EMD 386088 két adagját (azaz 2,5 és 5 mg/kg) választottuk korábbi kísérleteink alapján (Jastrzebska-Wiesek et al., 2016).

A tesztvegyület kémiai szerkezete: EMD 386088.

A magas zsírtartalmú étrend és a testsúly befolyásolása által kiváltott elhízás

A hím Wistar patkányokat 14 héten keresztül 40% zsírtartalmú keverékből (Labofeed B 40% sertészsírral, Morawski, Manufacturer Feed, Lengyelország) tartalmazó, zsírtartalmú táplálékkal táplálták 14 héten át, ad libitum vízzel (Dudek et al., 2015, 2016). A kontroll patkányokat standard táplálékkal etettük (Labofeed B, Morawski Manufacturer Feed, Lengyelország). 10 hét elteltével az étrendjük által kiváltott elhízást mutató patkányokat véletlenszerűen három egyenlő csoportba osztottuk, amelyeknek az átlagos testtömege azonos volt, és intraperitoneálisan kezeltük a tesztvegyületekkel a következő dózisokban: 2,5 vagy 5 mg/testtömeg-kg/nap és kontrollcsoport: jármű - 0,3 ml/kg víz (magas zsírtartalmú étrend + hordozó = elhízás kontrollcsoport) naponta egyszer reggel 9: 00-10: 00 között, 21 napig. A kontroll patkányokat 21 napig standard étrenden tartottuk, vivőanyag-víz intraperitoneális adagolásával (standard étrend + vivőanyag = kontrollcsoport). Az élelmiszer- és vízfelvételt hetente háromszor mértük, közvetlenül a gyógyszer beadása előtt. Az állatok mindig szabadon jutottak takarmányhoz és vízhez. A 22. napon, 20 perccel 1000 j/patkány heparin intraperitoneális beadása és tiopental (70 mg/ttkg) plazma összegyűjtése állatoktól.

Nagy zsírtartalmú takarmányösszetétel (932 g száraz tömeg): fehérje - 193 g, zsír (zsír) - 408 g, rost - 28,1 g, nyershamu - 43,6 g, kalcium - 9,43 g, foszfor - 5,99 g, nátrium - 1,76 g, cukor - 76 g, magnézium - 1,72 g, kálium - 7,62 g, mangán - 48,7 mg, jód - 0,216 mg, réz - 10,8 mg, vas - 125 mg, cink - 61,3 mg, kobalt - 0,253 mg, szelén - 0,304 mg, A-vitamin - 15000 egység, D3-1000 egység, E-vitamin-95,3 mg, K3 -3,0 mg, B1 -8,06 mg, B2 -6,47 mg, B6 -10,3 mg, B12 -0,051 mg, folsav - 2,05 mg, nikotinsav - 73,8 mg, pantoténsav - 19,4 mg, kolin - 1578 mg.

A magas zsírtartalmú étrend 100 g takarmányt tartalmazott - 550 kcal.

Az EMD 386088 hatása az elhízott patkányok testtömegére, valamint táplálék- és vízfogyasztására ízletes táplálékkal (túlzott evés modellje)

Az EMD 386088 anorektikus aktivitásának meghatározása érdekében értékelték annak hatását a kalória- és vízfelvételre a túlzott evés modelljében. Hím Wistar patkányokat (190–220 g) párban helyeztünk el. Két, 6 patkányból álló csoportot dióval, sajttal, sózott földimogyoróval és 7% sűrített tejből álló tejcsokoládéval tápláltak, és 3 hétig normál takarmányhoz (Labofeed B, Morawski Manufacturer Feed, Lengyelország) és ad libitum vízhez is hozzáférhettek. Ízletes kontrollcsoport (ízletes étrend + vivőanyag) vivőanyagot kapott (vizet, intraperitoneálisan), míg az ízletes tesztcsoportot (ízletes étrend + EMD 386088) 5 mg/kg testtömeg kg dózisban (intraperitoneálisan) injektáltuk EMD 386088-mal. vízben feloldva. Az étel és a víz felvételét hetente háromszor értékelték, és közvetlenül a gyógyszer beadása előtt naponta mérték a testtömeget. A 22. napon, 20 perccel 1000 j/patkány heparin intraperitoneális beadása és tiopental (70 mg/ttkg) plazma összegyűjtése állatoktól.

Ízletes étrend tartalmazta: 100 g földimogyoró - 614 kcal; 100 ml sűrített tej - 131 kcal; 100 g mogyorós tejcsokoládé - 195 kcal; 100 g sajt (görög típusú) —270 kcal.

A szokásos étrend 100 g takarmányt tartalmazott - 280 kcal.

Az EMD 386088 csak a normál étrenddel etetett nem elhízott patkányok testsúlyára, valamint táplálék- és vízfogyasztására gyakorolt hatása

Hím Wistar patkányokat (190–220 g) párban helyeztünk el. A kontroll csoport (standard étrend + vivőanyag) vivőanyagot kapott (vizet, intraperitoneálisan), míg a tesztcsoportot (standard étrend + EMD 386088) 5 mg/ttkg testtömeg-dózisban (intraperitoneálisan) injektáltuk EMD 386088-mal. vízben feloldva. Az étel és a víz felvételét hetente háromszor értékelték, és közvetlenül a gyógyszer beadása előtt naponta mérték a testtömeget.

Az EMD 386088 hatása a plazma glükózszintjére

A plazma glükózszintjének meghatározásához standard enzimatikus és spektrofotometriás vizsgálatokat (Biomaxima S.A. Lublin, Lengyelország) használtunk. A szubsztrátot a megfelelő terméknek megfelelő enzimekkel bontották le, amelyeket színes vegyületté alakítottak. A színezés arányos volt a koncentrációval. Az abszorbanciát 500 nm hullámhosszon mértük.

Az EMD 386088 hatása a glicerin szintjére étrend okozta elhízott patkányokban

A plazma glicerinszintjének meghatározásához glicerin kolorimetriás vizsgálati készleteket (Cayman, USA) használtunk.

Az EMD 386088 hatása a zsigeri megbetegedésekre a kaolin bevitel mérésével (pica viselkedés)

Annak kizárása érdekében, hogy az EMD 386088 által elfogyasztott táplálékot zsigeri megbetegedések okozták, a pica viselkedését a beadás után értékelték. A teszt időtartama 5 nap volt. A takarmányokhoz való szabad hozzáférés mellett az állatok szabadon hozzáférhettek a fehér kaolinhoz. Az állatok az első napokban hozzászoktak a kaolin jelenlétéhez ketreceikben. A negyedik napon intraperitoneálisan kapták az EMD 386088-ot 5 mg/ttkg testtömegben. vagy vivőanyag (negatív kontrollcsoport) vagy CuSO4 oldata 6 mg/ttkg dózisban. (1/3 LD50; LD50 = 18 mg/kg patkánynál ebben az adagolási módban; pozitív kontrollcsoport). A jóváhagyott étel, az elfogyasztott víz és a kaolin mennyiségét 24 óra elteltével határoztuk meg. Ezenkívül az állatokat megmérjük a vegyület beadása előtt és 24 óra elteltével.

Az EMD 386088 vérnyomásra gyakorolt hatásának meghatározása 22 órás vizsgálat során természetes tartási körülmények között élő wistar patkányokban - telemetriás módszer

Az EMD 386088-mal kezelt patkányok vérnyomását 22 óra alatt mértük 5 mg/ttkg testtömeg után, intraperitoneálisan, egy speciális telemetrikus rendszerrel - Stellar (TSE-Systems, Németország; Dudek et al., 2016).

Műtét: A műveletet 30 perc alatt, steril körülmények között hajtották végre. A patkányokat ketaminnal és xilazinnal altattuk (intramuszkuláris injekció: 100 és 10 mg/kg). A műtét előtt és az azt követő 7 napban az állatokat cefuroximmal (20 mg/kg/nap) intramuszkuláris injekcióval és ketoprofennel (5 mg/kg/nap) intraperitoneális injekcióval kezelték. A véráramlást a hasi aortában ideiglenesen blokkoltuk, és egy nyomásmérő adó csúcsát helyeztük be. Az adót a hasüregbe varrtuk.

A patkányokat 2 hétig külön-külön ketrecben tartották, hogy meggyógyuljanak a műtéti vágás után. Ezután az állatokat párban ketrecbe helyezték, hogy csökkentse izolációs stresszüket. A vérnyomást mértük: a vegyületek intraperitoneális beadása előtt - 0 perc és ezután 22 óra.

Statisztikai analízis

A statisztikai számításokat GraphPad Prism 6 programmal végeztük. Az eredményeket számtani átlagként adjuk meg, az átlag standard hibájával. A statisztikai szignifikanciát Student-féle t-teszttel számítottuk (ha két csoportot hasonlítottunk össze), egyirányú ANOVA-t Dunnett post-hoc többszörös összehasonlító vizsgálatával (biokémiai kísérletek), kétirányú ANOVA-t Bonferroni-vizsgálattal post-hoc (in vivo kísérletek). A különbségeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük: p ≤ 0,05.

Eredmények

A tesztvegyületek hatása elhízott patkányok testtömegére, kalória- és vízfelvételére

EMD 386088 intraperitoneálisan, 5 mg/ttkg dózisban adagolva. a magas zsírtartalmú étrendet fogyasztó patkányoknál a testtömeg-növekedés jelentős csökkenését okozta az elhízott patkányokhoz képest (elhízás kontrollcsoport). Az eredményeket a 2A. Ábra mutatja. 2A. A testtömeg csökkentése szempontjából nem volt szignifikáns hatás, amikor a tesztelt vegyületet intraperitoneálisan, 2,5 mg/ttkg dózisban adtuk be. EMD 386088 intraperitoneálisan, 5 mg/ttkg dózisban adagolva. csökkentette az állatok által a tesztcsoportban elfogyasztott kalória mennyiségét az elhízás kontrollcsoporthoz képest (3A., B. ábra). EMD 386088 intraperitoneálisan, 2,5 és 5 mg/ttkg dózisban adva. csökkentette a vízbevitelt a tesztcsoportban az elhízás kontrollcsoporthoz képest (ábra (3C. ábra). 3C). Mivel a 2,5 mg/kg dózis inaktív volt a testtömeg és a kalóriabevitel csökkentésében, a következő kísérletekben csak 5 mg/kg-ot használtunk.

A kalóriabevitelhez hasonlóan az ízletes takarmánnyal etetett és az EMD 386088-mal kezelt állatok szignifikánsan kisebb súlygyarapodást mutattak, mint a preferenciális takarmányt fogyasztó kontrollcsoportba tartozó állatok (ábra (2B ábra). 2B). A kísérlet hetedik napjától kezdve statisztikailag szignifikáns különbség volt a csoportok között. A súlykülönbség a hét napon 5,02% volt, a huszonegyedik napon 16,09%. Ami a legfontosabb, hogy az EMD 386088-mal kezelt és a preferenciális takarmányhoz hozzáférhető patkányok testtömege nem különbözött szignifikánsan a standard takarmánnyal etetett kontroll állatok tömegétől. Az EMD 386088-mal kezelt és standard takarmányt fogyasztó állatoknál a testtömegre gyakorolt hatást nem figyelték meg. Az eredményeket a 2C 2C ábra szemlélteti .

A preferenciális takarmánnyal és a normál takarmánnyal etetett csoportokban nem volt szignifikáns különbség az állatok vízfogyasztása tekintetében. Az eredményeket a 3F., I. ábra mutatja .