Az ERRγ-HNF1β genomi integrációja szabályozza a vese bioenergetikáját és megakadályozza a krónikus vesebetegségeket

Szerkesztette: Bert W. O’Malley, Baylor College of Medicine, Houston, TX, és jóváhagyta 2018. április 11-én (2018. március 21-én kapott felülvizsgálatra)

Jelentőség

A vese hámsejtjei (REC) bőséges mitokondriumokat tartalmaznak, amelyek nélkülözhetetlenek az elektrolitok, a glükóz és az aminosavak vese reabszorpciójának támogatásához. Azt azonban továbbra sem ismerik, hogy a mitokondriális anyagcsere hogyan koordinálódik a vese reabsorptív funkcióival. Itt megmutatjuk, hogy az ösztrogénnel kapcsolatos receptor gamma (ERRγ) törlése a REC-ekben súlyos vese mitokondriális és reabsorptív diszfunkciókat eredményez folyadékkal töltött ciszták esetén. Az ERRγ közvetlenül szabályozza a mitokondriális anyagcserét, és együttműködik a vese reabsorpciós gének szabályozásában a máj 1-es nukleáris faktorával (HNF1β), amelyek mutációi feltűnően hasonló veseműködési zavarokat és cisztákat okoznak állatokban és emberekben. Ezek a megállapítások feltárják az ERRγ szerepét a vesebetegség szempontjából releváns renális energiát termelő mitokondriális és energiafogyasztó reabsorptív funkciók transzkripciós programjának egyidejű koordinálásában.

Absztrakt

A mitokondriumok olyan organellumok, amelyek oxidatív foszforilezéssel (OxPhos) és zsírsav-oxidációval (FAO) generálják a sejtek energia nagy részét. Optimális funkciójuk központi szerepet játszik az egészség szempontjából. A mitokondriális DNS és fehérjék mutációi közvetlenül a mitokondriális megbetegedést okozzák, a magas mitokondriális tartalmú és energetikai igényű szervekben, köztük a vese, gyakran súlyos hibákat észlelnek (1 ⇓ –3). A mitokondriális diszfunkció általában elismerten hozzájárul a szívbetegségekhez, az elhízáshoz, a cukorbetegséghez, a neurodegenerációhoz, az öregedéshez és számos vesebetegséghez, beleértve az akut vesekárosodást, a policisztás vesebetegséget és a krónikus vesebetegséget (CKD) (1, 4 ⇓ ⇓ ⇓ - 8.) A CKD-t a vesefunkció fokozatos elvesztése jellemzi, különféle etiológiákkal, hiányosan ismert kórélettan és gyógyítás nélkül. A CKD egyaránt jellemzi a glomeruláris és a tubuláris sejtek diszfunkcióját, valamint a metabolikus diszregulációt (9). A transzkripciós és metabolomikai vizsgálatok a vesekárosodásban, beleértve a CKD-t is, a mitokondriális OxPhos károsodását vonják maguk után (10, 11). Egy nemrégiben készült tanulmány azt is kimutatta, hogy a vese mitokondriális OxPhos és a FAO mind a CKD-ben szenvedő, mind az állatmodellekben a legnehezebben szabályozott sejtpályák közé tartozik (12).

Az összes vesesejt közül a tubulusban és a gyűjtőcsatorna vese hámsejtjeiben (REC) nagyon nagy a mitokondrium sűrűsége. A REC-ek fő fiziológiai feladata az egész test homeosztázisának fenntartása, az ozmolalitás, a sav-bázis egyensúly és az extracelluláris folyadék térfogata a víz, a kritikus tápanyagok és az elektrolitok visszaszívódása révén. Mechanikusan ezeket a visszaszívó funkciókat számos membránszállító és víz, glükóz, aminosav, nátrium, klorid, hidrogén-karbonát és más biomolekulák specifikus csatornájának munkájával érik el a REC apikális és bazolaterális felszínén, a celluláris ATP-t használva végső energiaforrásként. . Ennek megfelelően a REC-ek sűrűn vannak tele mitokondriumokkal, és a mitokondriális OxPhos-tól és a FAO-tól függnek, hogy energiát termelnek-e reabsorptív funkcióik támogatására. Azt azonban továbbra sem ismerjük, hogy a mitokondriális anyagcsere hogyan koordinálódik a vese reabsorptív funkcióival, és hogyan járul hozzá a mitokondriális diszfunkció a vesebetegséghez.

A közelmúltban végzett munka feltárta a nukleáris receptor ösztrogénnel kapcsolatos receptor gammát (ERRγ), mint a mitokondriális OxPhos és a FAO kritikus transzkripciós szabályozóját (13 ⇓ –15). Sejttípus-specifikus ERRγ KO egerek felhasználásával végzett vizsgálatok megkerülték az egész testet végző ERRγ KO egerek perinatális letalitását, és végleges bizonyítékot szolgáltattak az ERRγ alapvető szerepére az idegsejtek anyagcseréjében és a tanulásban/memóriában, a szív anyagcseréjében és összehúzódásában/vezetésében, a hasnyálmirigy β funkcionális érésében. sejtek, a barna adipocita termogén funkciója, valamint a vázizomrost típusának meghatározása és működése (16 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –22). Genomikai vizsgálatok azt mutatják, hogy az ERRγ közvetlenül kötődik és aktiválja a mitokondriális OxPhos neuronokban fontos gének százainak, valamint a szívsejtekben lévő OxPhos, FAO és szívkontrakciós gének transzkripcióját (17, 23). Ezenkívül az ERRγ magasan expresszálódik a vesében, és elengedhetetlen az embrionális vese normális fejlődéséhez (24). Nevezetesen, az emberi genetikai vizsgálatok azt mutatják, hogy a t (1, 2) (q41; p25.3) de novo reciprok transzlokáció az ERRγ lokuszt is magában foglalja kétoldali vese agenesis/hypoplasia/dysplasia (25).

Itt létrehoztuk a REC-ERRγ KO egereket, és megmutattuk, hogy vese mitokondriális és reabsorpciós diszfunkció alakul ki. Genomikai tanulmányok azt sugallják, hogy az ERRγ különböző mechanizmusok révén szabályozza a mitokondriális anyagcserét és a vese újrafelszívódását: bár az ERRγ önmagában szabályozza a mitokondriális OxPhos/FAO funkciókat, az ERRγ együttműködik a HNF1β-vel a vese reabsorpciós gének expressziójának aktiválásában. Ezenkívül a CKD-ben szenvedő humán betegeknél csökkent a vese ERRγ expressziója, és nagyon átfedő vesetranszkripciós aláírásaik vannak a REC-ERRγ KO egerekkel. Ezek az eredmények együttesen feltárják a vese mitokondriális és reabszorpciós funkcióinak összehangolt szabályozásának mechanizmusát, és az ERRγ jelátvitelt meghatározzák, mint fontos kapcsolatot a vesebetegséggel összefüggő mitokondriális diszfunkcióval.

Eredmények

Az ERRγ elvesztése a REC-ekben vesebetegséget eredményez cisztákkal.

Először egy ERRγ heterozigóta egér törzs elemzésével határoztuk meg, hogy hol expresszálódik az ERRγ a posztnatális vesékben, amelyben a LacZ-t bekopogtatták az ERRγ lókuszba (16). Az X-gal festés azt mutatta, hogy az ERRγ magasan és specifikusan expresszálódik a tubulusok és gyűjtőcsatornák valamennyi szegmensének REC-ében, de alig detektálható bármely más sejtben, beleértve a glomerulusokban lévő sejteket is (SI függelék, S1A ábra). Ezenkívül az ERRγ fehérje kizárólag a magban található meg, a mitokondriumokban vagy a citoszolban azonban nem, összhangban a nukleáris transzkripciós faktor funkciójával (SI függelék, S1B ábra).

Az ERRy fontosságának meghatározásához a posztnatális vesebiológiában és betegségben REC-ERRγ KO egereket állítottunk elő azáltal, hogy az ERRγ (17) floxolt allélját hordozó egereket Sim1-Cre törzssel kereszteztük. Erős vese Cre-expresszió a születéskor következett be, és gyors posztnatális veseelvesztést eredményezett a vese ERRγ-expressziójában, és csak 15% ERRγ mRNS maradt 1 hetes korban (SI függelék, S1C ábra). Kettős fluoreszcens Cre riporter egér törzs (26) felhasználásával azt is megállapítottuk, hogy ez a Sim1-Cre vonal rekombinációt közvetített specifikusan a tubulus minden szegmensében, és a vese belsejében gyűjtötte a csatorna hámját (SI függelék, S1D ábra), pontosan ott, ahol az ERRγ található. normálisan kifejezve (SI függelék, S1A ábra). Minden további vizsgálatban hím és nőstény REC-ERRγ KO egereket is használtunk.

Mind a hím, mind a nőstény REC-ERRγ KO egerek (Cre +) a várható Mendeli arány mellett születtek és éltek túl perinatálisan. Veséik születésükkor és 3 hetes korukban normális súlyúak és szövettani megjelenésűek voltak, ami arra utal, hogy nincsenek fejlődési rendellenességek (1. ábra A – C). A szövettani megfigyelésekkel összhangban az elektronmikroszkópos vizsgálat azt mutatta, hogy a vese ultrastruktúrája, beleértve a glomerulusokban lévő mitokondriumokat, a proximális tubulusokat és a disztális tubulusokat, összehasonlítható volt a 3 hetes korú kontrollokkal (SI függelék, S2. Ábra). Ezt követően azonban mind a hím, mind a női REC-ERRγ KO egereknél progresszív veseelégtelenség alakult ki (1A. Ábra). A REC-ERRγ KO egerek veséi 1 hónapos koruknál szignifikánsan nehezebbek voltak, mint a kontrollok, 3 hónapos korukban pedig háromszor nehezebbek voltak (1. B és D ábra). A szövettani vizsgálat kimutatta, hogy a REC-ERRγ KO egér vesék több, különböző méretű, folyadékkal töltött cisztát tartalmaztak (1E. Ábra), ami a vesék általános szerveződésének és szerkezetének megzavarását eredményezte. A glomerulusok jelen voltak, és hisztológiailag normálisnak tűntek a H&E festés alapján. A glomerulusok szénhidrátban gazdag bazális membránjai, beleértve a kapilláris hurkokat, amelyek a vesefiltrációs funkcióért felelősek, szintén sértetlenek maradtak, periodikus sav-Schiff festéssel értékelve (1E. Ábra). Ezek a megállapítások azt sugallják, hogy az ERRγ kritikus fontosságú a vese normál szerkezetének és működésének fenntartásához in vivo.

A REC-ERRγ KO egereknél vesebetegség alakul ki folyadékkal töltött cisztákkal. (A és B) A kontroll és a REC-ERRγ KO vesék reprezentatív képei (A) és súlya (B) különböző életkorokban (n = 12–19). (C) Három hetes kontroll és REC-ERRγ KO vesemorfológia. (Felső) H&E folt. (Méretarány, 1000 µm.) (Középső) H&E festés. (Scale bar, 100 µm.) (Alul) Periodikus sav-Schiff festés (Scale bar, 100 µm.) A nyilak a glomerulusokra mutatnak. (D) 3 hónapos kontroll és REC-ERRγ KO egerek vesei (piros nyilak), szemléltetve a testhez viszonyított relatív méretüket. (E) Három hónapos kontroll és REC-ERRγ KO vesemorfológia. A festés és a skála megegyezik a C-vel. A hibasáv a SEM-et jelöli. * P - és Cre + t teszttel. A hím és a nőstény egereket egyaránt bevontuk.

Az ERRγ közvetlenül szabályozza a mitokondriális anyagcsere és a vese reabszorpciós funkcióját.

Az ERRγ elengedhetetlen a REC mitokondriális metabolikus és vese reabsorptív gének normális expressziójának fenntartásához. (A) Vulkán-diagram, amely 3 hét múlva régi kontroll és REC-ERRγ KO vesékben RNS-Seq (n = 4) által differenciáltan expresszált géneket mutat be. A szűrési kritériumok a szeres változás> ± 1,5, a P- és a Cre + t-próbával. A hím és a nőstény egereket egyaránt bevontuk.

Ezt követően azt vizsgáljuk, hogy a REC-ERRγ KO egerekben a vese transzkripta változásai nemtől függenek-e. Mind a hím, mind a női REC-ERRγ KO egerek hasonló útváltozásokat mutattak mind a lefelé, mind a felfelé szabályozott gének esetében (SI függelék, S3B ábra). Ez összhangban áll azzal a ténnyel, hogy a REC-ERRγ KO egerek mindkét nemében vesebetegség alakul ki. Annak megállapítására, hogy a mitokondriális és a vesefunkció ezen molekuláris hibái fennmaradtak-e a vesebetegség későbbi szakaszában, 3 hónapos hím kontroll és REC-ERRγ KO egerekben végeztünk RNS-Seq elemzést, és összehasonlítottuk 3 -hét éves hím egerek. A lefelé szabályozott és a felfelé szabályozott sejtpályák többségét 3 hónapos REC-ERRγ KO egerekben tartottuk fenn (SI függelék, S3C. Ábra). Néhány további, felfelé szabályozott sejtutat találtunk 3 hónapos korban, ami valószínűleg a vesebetegség későbbi szakaszában jelentkező másodlagos változásokat tükrözi.

Ezután azt vizsgáltuk, hogy a mitokondriális anyagcsere és a vese reabsorpciós funkciója károsodott-e a REC-ERRγ KO egerekben. A több mitokondriális elektrontranszport-lánc komplexek enzimatikus aktivitását 3 hét hetes REC-ERRγ KO vesékben csökkentnek találták (3A. Ábra), összhangban a csökkent RNS-expresszióval. Ezenkívül az mtDNS-tartalom jelentősen csökkent (3B. Ábra), a normál mitokondriális ultrastruktúrák ellenére, ami a mitokondriális diszfunkcióra utal. Fontos, hogy ezek a mitokondriális anyagcsere-hibák 3 hetes korban voltak jelen, mielőtt bármilyen morfológiai vagy funkcionális veseelégtelenséget észleltek volna, ami arra utal, hogy a mitokondriális diszfunkció a vesefunkciók genezise a REC-ERRγ KO egerekben.

Az ERRγ együttműködik a HNF1β-val a vese reabsorptív gének transzkripciójának szabályozásában. (A) A top 5 de novo motívum az ERRγ ChIP-Seq csúcsok közelében. (B) A vese ERRγ és HNF1β ChIP-Seq csúcsok átfedése. Az tengely log2 címkék/10 7 olvasás. (C) Az ERRγ és/vagy HNF1β ChIP-Seq csúcsokra annotált gének top 10 útja. (D) Reprezentatív ERRγ és HNF1β ChIP-Seq csúcsok. y tengely csúcsértéket olvas. Ugyanaz a skála a kontroll és az ERRγ KO RNS-Seq sávokhoz. (E) ERRγ és/vagy HNF1β kötődése az OxPhos, a FAO és a vese reabsorpciós gének közelében ChIP-vel.

Az ERRγ és a HNF1β funkcionálisan együttműködik a vese reabszorpciós gének szabályozásában.

Funkcionális együttműködés az ERRγ és a HNF1β között a veseműködés szabályozásában. (A) HNF1β ChIP-ERRγ reChIP-Seq és adatelemzés. (B) Az Atp1b1-t ERRγ és HNF1β kötik ugyanazon sejtekben a ChIP-reChIP-qPCR segítségével. (C) Az Atp1b1 expresszió fokozott aktiválása mind ERRγ, mind HNF1β segítségével.

Ezt követően azt vizsgáltuk, hogy az ERRγ és a HNF1β funkcionálisan együttműködik-e a vese reabsorpciós gének transzkripciójának szabályozásában. A vese sejtekből vagy egér vesékből származó lizátumokban az ERRγ és a HNF1β közötti fizikai interakciót nem tudtuk kimutatni koimmunoprecipitáció, majd Western blot alkalmazásával (SI függelék, S5D. Ábra). Ez azt sugallja, hogy vagy nem lépnek kölcsönhatásba közvetlenül, vagy kölcsönhatásuk nem elég erős ahhoz, hogy ezzel a módszerrel kimutathassák őket, amint arról korábban a transzkripciós faktor-lekötés eseteiben számoltunk be (36). Az ERRγ és a HNF1β összekapcsolt gének, például az Atp1b1 expresszióját vagy ERRγ, vagy HNF1β aktiválta, és tovább növekedett mind az ERRγ, mind a HNF1β alkalmazásával (5.C ábra). Ezek az eredmények együtt azt sugallják, hogy az ERRγ és a HNF1β funkcionálisan együttműködik a vese reabsorpciós gének szabályozásában.

CKD-s humán betegeknél csökkent a vese ERRγ expressziója, és nagyon átfedő vesetranszkripciós aláírások vannak megosztva REC-ERRγ KO egerekkel.

Az ERRy ezen megállapításainak a veleszületett rendellenességeken túlmutató emberi vesebetegségekhez való viszonyításához (25) megmértük a vese ERRγ expresszióját CKD és kontroll kohorsz betegek 95 humán vese tubulus mintájában. Megállapítottuk, hogy az ERRγ expresszió pozitívan korrelált a glomeruláris filtrációs sebességgel (GFR), a veseműködés jól megalapozott klinikai indexével (6A. Ábra). Ezenkívül a vese ERRγ expressziója szignifikánsan csökkent a CKD-s betegeknél (GFR 60; 6B. Ábra). Ezután összehasonlítottuk a vese transzkriptómákat a REC-ERRγ KO egerek és a CKD-ben szenvedő humán betegek között (12). A REC-ERRγ KO egerekben a lefelé szabályozott és a felfelé szabályozott gének körülbelül 25% -át osztották meg CKD-s humán betegeknél (6. ábra C és D). Jelentős az érintett utak átfedése a REC-ERRγ KO egerek és a CKD-ben szenvedő humán betegek között. Különösen a lefelé szabályozott utak közel azonosak egérben és emberben, és sok mitokondriális funkciót és renális felszívódási utat tartalmaznak, amelyeket az ERRγ szabályoz. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az ERRγ széles és kritikus szerepet játszik az emberi vesebetegségben.

CKD-s humán betegeknél csökkent a vese ERRγ expressziója, és nagyon átfedő vesetranszkripciós aláírásaik vannak a REC-ERRγ KO egerekkel. (A) Az ERRγ expresszió Pearson-korrelációval pozitívan korrelál a GFR-rel 95 emberi vese tubulus mintán. (B) Az ERRγ expresszió jelentősen csökken a humán CKD vese tubulusokban, t teszttel. (C és D) Venn-diagram és hőtérkép összehasonlítás a 3-hetes REC-ERRγ KO egerek és a CKD-ben szenvedő humán betegek között a legszabályozott (C) vagy felfelé szabályozott (D) vese gének legfelső mértékben dúsított útvonalainak összehasonlításával. A statisztikai elemzést Fisher pontos tesztjével végeztük. (E) Az a modell, amely szemlélteti, hogy az ERRγ különböző mechanizmusok révén koordinálja az energiát termelő mitokondriális anyagcserét és az energiafogyasztó vese reabsorpciós funkciókat.

Vita

Anyagok és metódusok

Minden egérvizsgálatot jóváhagyott és a Philadelphiai Gyermekkórház Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottságának irányelvei szerint hajtott végre. Az adenovírusokat a korábban leírtak szerint állítottuk elő (39, 40). A transzmissziós elektronmikroszkópiát, a génexpressziót, a Western blot-ot, a sejt oxigénfogyasztásának mérését, a mitokondriális DNS-t és az enzimaktivitás elemzését a korábban leírtak szerint végeztük (18, 41). Az egérvizsgálatok, a sejttenyésztés, a glükózfelvétel, a szövettani elemzés, az RNS-Seq, a ChIP-Seq és a ChIP-reChIP-Seq kísérletek részletes leírását lásd az SI függelékben, az SI anyagok és módszerek című részben. A statisztikai elemzést Student's t-teszt, Pearson-korreláció vagy Fisher-pontos teszt alkalmazásával végeztük. A mikrorajz adatokat az ArrayExpress adatbázisban (E-MTAB-2502) tároltuk. Az RNA-Seq, ChIP-Seq és ChIP-reChIP-Seq adatokat a GEO adatbázisban (GSE104907) tároltuk.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Dr. Douglas Wallace-nak, Dr. Mitchell Lazar-nak, Dr. Matthew Weitzman-nak, Dr. Amita Sehgal-nak, Dr. Michael Marks-nak és Dr. Mark Kahn-nak a projekt kritikai vitáját. Köszönjük Dr. Biao Zuo, Dr. Ray Meade és az UPenn Electron Microscopy Resource Laboratory központi létesítményének a technikai támogatást. A szerzőket és ezt a munkát az Egészségügyi Védelmi Titkársági Hivatal a Peer Review orvosi kutatási programon keresztül támogatta a W81XWH-16-1-0400 díjjal, valamint a Pennsylvaniai Egyetem Diabetes Kutatóközpontjának kísérleti díjait. az NIH által támogatott támogatás (DK19525; DK111495 - LP; DK099379 - BJW; DK108987 - GDB; és DK087635 és DP3 DK108220 - KS).

Lábjegyzetek

↵ 1 Kinek kell címezni a levelezést. E-mail: lpeipennmedicine.upenn.edu .

Szerző közreműködései: J.Z. és L. P. tervezett kutatás; J.Z., K.L., B.J.W., J.L., Y.O., A.L.A., C.M., G.D.B. és L.P. kutatást végeztek; C.Q. és K.S. új reagensekkel/analitikai eszközökkel járult hozzá .; J.Z., K.L., B.J.W., C.Q., J.L., C.M., K.S., G.D.B. és L.P. elemzett adatokat; és J.Z., G.D.B. és L.P. írták a lapot.

A szerzők nem jelentenek összeférhetetlenséget.

Ez a cikk a PNAS közvetlen benyújtása.

Adatok lerakása: A mikrorajz adatok az ArrayExpress adatbázisba kerültek (E-MTAB-2502). Az RNA-Seq, a ChIP-Seq és a ChIP-reChIP-Seq adatokat a GEO adatbázisban (GSE104907) tároltuk.