Az étkezési zsírhoz való táplálékbevitel az egerekben az Arcuate Melanocortin rendszer PSA-függő újravezetését vonja maga után

Absztrakt

Bevezetés

Néhány speciális agyterület felnőttkorában „plasztikus” marad, ami azt jelenti, hogy funkcionális vagy morfológiai átalakításon eshet át. A hipotalamusz, amely biztosítja mind az endokrin, mind az autonóm funkciók koordinációját, és ezáltal a belső miliő hosszú távú stabilitását, szintén átalakulhat. A körülmények széles skálája bizonyítja a hipotalamusz plaszticitását, ideértve a külső érzékszervi ingerléseket, például a fotoperiódus vagy a környezeti hőmérséklet változását, és az egyes fiziológiai ingadozásokat, például a kiszáradás, a laktáció és a petefészek-ciklus során (Oliet, 2002; Prevot, 2002; Ebling és Barrett, 2008). Ezenkívül a hipotalamusz plaszticitása széles körben konzervált folyamatnak tűnik a békákban, madarakban, rágcsálókban és főemlősökben.

2004-ben új koncepcióként jelent meg a hipotalamikus plaszticitás bevonása a teljes test energia homeosztázisának szabályozásába (Pinto et al., 2004). Ez a folyamat elengedhetetlennek tűnik, és károsodása hozzájárulhat az elhízáshoz. Laboratóriumi állatokban a hipotalamusz gyors újracsatlakozása különböző kísérleti eljárások alkalmazásával érhető el, ideértve az éhezést és a hormonkezeléseket olyan exogén hormonokkal, mint a leptin és a ghrelin (Pinto et al., 2004; Sternson et al., 2005; Andrews et al., Yang és mtsai., 2011). Az ilyen manipulációk markáns változásokat eredményeznek a táplálkozási magatartásban, amelyeket valószínűleg legalább részben a szinapszisok stimulált hormonfüggő átszervezése vált ki bizonyos hipotalamusz neuronokban (Pinto et al., 2004; Sternson et al., 2005; Andrews et al., Yang és mtsai., 2011). Mindazonáltal még mindig nem ismert, hogy a hipotalamusz plaszticitása szerepet játszhat-e a naiv állatok táplálékbevitelének szabályozásában a táplálkozási körülményeik változása szerint. Ennek a kérdésnek a kezelésére 1 hétig magas zsírtartalmú étrendet (HFD) tápláló felnőtt egerekben vizsgáltuk a hipotalamusz plaszticitását.

Anyagok és metódusok

Állatok.

Az állatok manipulálását magában foglaló jegyzőkönyveket helyi etikai testületünk felülvizsgálta, és szigorúan összhangban volt az Európai Közösség irányelveivel (86/906 irányelv). A kísérleteket két hónapos hím C57BL/6JOla hím egerekkel végeztük a Harlan Laboratories-tól. Az egereket egyedileg helyeztük el, és az érkezéstől számított 1 hétig standard pelletizált kereskedelmi táplálékkal (A04; biztonságos) tápláltuk őket. Az akklimatizáció után vagy ugyanazzal a szokásos étrenddel (STD) vagy testreszabott, nagyon ízletes, magas zsírtartalmú étrenddel (Safe) táplálkoztak. A diéták jellemzőit az 1. táblázat tartalmazza. Az étrend megváltoztatása reggel 9:00 órakor történt. és mind a szokásos, mind a magas zsírtartalmú étrendet naponta 9: 00-kor megújították. Az egerek ad libitum hozzáférést kaptak az élelemhez és a vízhez. Az élelmiszer-fogyasztást és a testsúlyt (BW) naponta mértük. A közvetett kalorimetriával végzett metabolikus vizsgálatokhoz az egereket egyedi légmentesen záródó ketrecekben helyezték el, és a gázcseréket levegő-analizátor rendszerrel (Oxylet; BIOSEB) követték nyomon. A szövetgyűjtéshez az egereket reggel 9:30 között leöltük. és 12:00 órakor. Néhány kísérletben 8-10 hetes hím transzgenikus homozigóta knock-out PST-1 egereket használtak. Ezeket az egereket az ST8SiaIV gén célzott mutációinak felhasználásával állítottuk elő (Eckhardt et al., 2000).

Az étrendek jellemzői, jelezve az energiaösszetételt, a centezimális összetételt és a lipidtartalom biokémiai elemzését

Kétoldalú injekció a hipotalamuszba.

Hypothalamus disszekció qPCR analízishez.

RNS kivonása és feldolgozása.

A szöveteket lizáltuk és 300 μl lízispufferben (RLT Buffer, Qiagen) homogenizáltuk TissueLyser rendszer (Qiagen) és 5 mm rozsdamentes acél gyöngyök (Qiagen) felhasználásával. A teljes RNS-t szilícium-dioxid-alapú membránokkal ellátott spin-oszlopokon izoláltuk (RNeasy Mini Kit, Qiagen), a gyártó utasításainak betartásával. A DNS-emésztést közvetlenül az oszlopokon végeztük. Az RNS-t 30 μl H2O-val eluáltuk. Az egyes kivonatok (1 μl) alikvot részeit RNS-koncentráció, tisztaság és integritás szempontjából az Experion elektroforézis rendszerrel (Bio-Rad) és az Experion RNS StdSens Analysis Kit (Bio-Rad) alkalmazásával ellenőriztük. Ezután az összes RNS-t -80 ° C-on tároltuk. Kis mennyiségű tisztított RNS-t (0,2 μg) fordítottan átírtak 20 μl keverékben a nagy kapacitású cDNS Archive Kit (Qiagen) segítségével, a gyártó jelzése szerint. A szintetizált cDNS-t ezután -20 ° C-on tároltuk.

qPCR elemzés TaqMan kis sűrűségű tömb segítségével.

Immunhisztokémia.

Az egereket ketamin/xilazin keverék intraperitoneális injekciójával érzéstelenítettük, majd intrakardiálisan 4% paraformaldehid-oldattal perfundáltuk. Az agyakat eltávolítottuk, egy éjszakán át 4 ° C-on utólag rögzítettük, 2 napig 4 ° C-on 30% -os szacharózzal krioprotektálva, izopentánban -60 ° C-on fagyasztottuk, végül felhasználásig -80 ° C-on tároltuk. A hipotalamust kriosztáttal (Leica) 30 μm-es sorozatokra vágtuk. A 15-18 betakarított metszet öt szakaszát, amely az íves magot tartalmazza, immunhisztokémiával kezeltük. A metszeteket először 3-4 órán át blokkoltuk, majd egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on anti-PSA (poliszialinsav-molekula) antitesttel (1: 6000, # AbC0019, EuroBio). Mosás után a metszeteket ezután Alexa546-konjugált kecske anti-egér IgM-ben (Invitrogen, 1: 400) inkubáltuk 2 órán át szobahőmérsékleten. További mosások után a részeket végül rögzítő közeggel és fedőlemezzel tartották.

Képszerzés és elemzés.

A densitometriai analízishez az immunjelölt metszeteket konfokális mikroszkópon (Leica SP2) tekintettük meg a 40x olajimmerziós objektív alatt. Az immunfestő futtatás képeit (minden állatból egy-egy állat: STD, HFD 1 d, HFD 3 d, HFD 8 d) ugyanazokkal a paraméterekkel (561 nm lézeres teljesítmény, a fényszorzó erősítése és eltolása) készítettünk. Az ImageJ szoftver használatával a szakaszonkénti PSA jelölés intenzitását kétoldalúan meghatároztuk az íves magnak megfelelő kiválasztott területen. A jelölés intenzitását állatonként 5 szakaszon mértük. Ellenőrzési területnek a gyrus fogat választották. A nagy kiterjedésű vizsgálat során metszeteket figyeltünk egy függőleges fénymikroszkóppal, az Axio Imager 2 (Zeiss) motoros színpaddal felszerelve. A teljes agymetszeteket automatikusan átkutatták a 40x objektív alatt. Nagyméretű nagyfelbontású képek készültek az Axiovision szoftverrel és a MosaiX modullal (Zeiss).

Western blottolás.

Elektrofiziológiai felvételek.

Statisztikai analízis.

A PST-1 enzimhiány a HFD bevezetése után rontja az energiafelvétel homeosztatikus szabályozását. A, Reprezentatív PSA immunfestés a PST-1 +/+ és PST-1 -/- egerek íves magjában 1 napig HFD-vel táplálva. B, A PST-1 +/+ és a PST-1 -/- egerek energiafelvétele 5 napig HFD-vel táplálkozott. Az adatok átlag ± SEM. n = 6 PST-1 +/+ egér és n = 12 PST-1 -/- egér. A csoportokat Student t tesztjével hasonlítottuk össze.

Vita

A hipotalamikus plaszticitás adaptív folyamatként határozható meg, amelynek célja a környezeti feltételek és a fiziológiai állapotok változásainak integrálása (Oliet, 2002; Prevot, 2002; Ebling és Barrett, 2008). Itt arról számolunk be, hogy az étrend megváltoztatása egy másik helyzet, amely a hipotalamusz neuronális hálózatának újbóli bekötéséhez vezet. Valóban, a tartós zsírfogyasztás növeli a miniatűr gerjesztő posztszinapikus áramok gyakoriságát a POMC idegsejtjeiben, ami erősen javasolja ezen sejtek szinaptikus átszervezését (Pinto és mtsai, 2004). Ebben a tanulmányban nem találtuk az ok-okozati összefüggést ezen elektrofiziológiai adatok és a táplálékfelvétel HFD bevezetése utáni módosulása között, amely a PSA-mediált szinaptogenezis indukálható és célzott gátlását igényli a POMC sejtekben. Azonban (1) a PSA túlexpressziója megelőzi a viselkedésbeli változásokat, (2) mind a HFD által kiváltott POMC újracsatlakozás, mind az energiafelvétel fokozatos helyreállítása EndoN-érzékeny, és (3) az anorexigén POMC idegsejtekről úgy gondolják, hogy részt vesznek az adaptív homeosztatikus folyamatokban, amelyek fenntartják energia homeosztázis (Cone, 2005). Ennek eredményeként a HFD által kiváltott PSA-függő POMC újbóli bekötése megmagyarázhatja az étkezési zsírra adott homeosztatikus reakciót.

Bár a melanokortin-rendszer szerepét a táplálékfogyasztás adaptálásában a táplálkozási körülmények változásaira válaszul már javasolták (Butler és mtsai, 2001; Pillot és mtsai, 2011), az arcív POMC idegsejtek szinaptikus átszervezésére most már szükség van. a fiziológiai visszacsatolás kulcsfontosságú elemének tekintik. Mindazonáltal nem zárhatjuk ki sem az szinergikus hatást, például az orexigén sejtek, például az NPY/AgRP idegsejtek tükör szinaptikus újbóli bekötése miatt. A metabolikus egyensúlyhiány elleni további védekezések nem szinapszisos mechanizmusokat is magukban foglalnak, mint például a POMC expresszió HFD által stimulált upregulációja (Ziotopoulou et al., 2000). Mivel az elhízott egerekben a táplálékkörökben a sejtforgalom gátolt (McNay et al., 2012), a hipotalamusz sejtmegújulása hozzájárulhat az étkezési zsír homeosztatikus reakciójához is. Ezért az energiamérleg homeosztatikus szabályozását biztosan megszilárdítja a plaszticitással kapcsolatos folyamatok kombinációja, a gyors farmakológiai és a lassabb morfológiai változások között. Sajnos mindezeket az agybiztonsági mechanizmusokat nyilván felülmúlják, ha a fűtőnyomás tartós.

Érdekes módon a plasztikus események molekuláris szűrése a HFD egerek hipotalamuszában kis sűrűségű tömbök felhasználásával rövid és ívspecifikus módosítást javasol a sejtek interakcióiban. Bár a melanokortin-rendszer széles körben elterjedt idegsejt-hálózat, úgy tűnik, hogy a diéta által kiváltott szinaptikus plaszticitás csak az íves, valószínűleg elsőrendű neuronokat érinti. Ezért az íves POMC vagy AgRP neuronok, például a paraventrikuláris MC4R-pozitív idegsejtek downstream célpontjai, amelyek döntő fontosságúak a táplálékzsírra adott homeosztatikus válaszban (Butler és mtsai, 2001), különös szinaptikus nélkül közvetíthetik a megnövekedett anorexigén tónust az íves magból. átalakítás.

Ebben a cikkben beszámolunk a testtömeg PSA-függő ellenőrzéséről. Az EndoN obesogén hatása összefüggésbe hozható az élelmiszer-bevitel szabályozásának megváltoztatásával, de az energiafogyasztásra gyakorolt hatás sem kizárt. Valójában a POMC idegsejtjei szabályozzák a „fakultatív” termogenezist is, amely rengeteg idő alatt leégeti a felesleges kalóriákat. Másrészt a glükóz tolerancia helyreállítása nem érzékeny az EndoN-re, ami azt sugallja, hogy a PSA-függő idegsejtek újbóli bekötése nem kulcsfontosságú a glükóz homeosztázis fenntartásához. Tehát úgy tűnik, hogy a PSA-függő hipotalamusz plaszticitás olyan specifikus fiziológiai válaszokra hat, mint például a táplálékbevitel szabályozása. Ez váratlan volt, tekintettel a melanokortin-rendszer perifériás anyagcserére gyakorolt széles spektrumára (Mountjoy, 2010). Tudomásunk szerint azonban a POMC neuronok újbóli bekötésének hormonális stimulációja sem változtatja meg a glükóz homeosztázist.

Úgy tűnik, hogy a POMC idegsejtek szinaptikus aktivitása elősegíti az étkezési zsír bevitelére adott homeosztatikus választ, vagyis az étkezés fokozatos csökkentését egy hét alatt. A hipotalamusz neuronkapcsolatának változása több hónapig is fennáll, annak ellenére, hogy a HFD folytatódik (Horvath et al., 2010). A HFD rövid és hosszú távú expozíciójának különböző eredményei azonban összekapcsolhatók a diéta által kiváltott elhízott állatok leptinrezisztenciájával, amely helyzetben az emelkedett leptinszint már nem tartja fenn a POMC neuronok tüzelését (Cowley et al., 2001; Enriori et al., 2007; Diano és mtsai, 2011).

Meghatároztuk a PSA-t a POMC neuronok étrend által kiváltott újracsatlakozásához szükséges downstream szereplőként. A poliszialiláció mindenütt megtalálható mechanizmus, amely számos hipotalamusz folyamatban megtalálható, és amelyek a sejtek kölcsönhatásainak módosulásaival járnak (Theodosis et al., 1991). Ezért valószínűleg nem specifikus az íves POMC neuronok étrendfüggő szinaptikus plaszticitására. Sokkal inkább megengedő folyamatnak tekinthető, amely felvehető ezen idegsejtek más, korábban leírt hormonfüggő újravezetése során (Pinto et al., 2004; Gao et al., 2007; Gyengesi et al., 2010; Yang et al. ., 2011). Ezenkívül a transzkripptikus vizsgálat szerint a dinamikus sejt interakciók és a szinaptogenezis más szabályozói is részt vehetnek az étrend által kiváltott hipotalamusz plaszticitásban. A szindekán-3 és a szinaptotagmin-4 valóban ígéretes célpont az elhízás és a kapcsolódó betegségek kezelésében (Strader és mtsai, 2004; Zhang és mtsai, 2011).

Az étrend által kiváltott hipotalamusz plaszticitást elősegítő biológiai mediátorokat ebben a tanulmányban nem vizsgálták, de könnyen spekulálhatunk arra, hogy ebben a fiziológiai mechanizmusban szerepet játszhatnak olyan metabolikus hormonok, amelyek neurotróf tulajdonságaik révén hatnak az energia-anyagcserére (Pinto és mtsai., 2004; Abizaid és mtsai, 2006; Coppola és mtsai, 2007; Andrews és mtsai, 2008; Chiu és Cline, 2010; Yang és mtsai, 2011). A Leptin az egyik feltételezett jelölt. A vér leptinszintje gyorsan emelkedett 3 d HFD után (Wang et al., 2001). Ez összhangban áll a modellünkben kimutatott zsírtömeg-bővüléssel. Ezért a leptin elősegítheti a POMC idegsejtek szinaptikus újjászerveződését, hogy gátolja a táplálékfelvételt, a POMC neuronaktivitásra gyakorolt közvetlen stimuláló hatása mellett. Figyelembe kell venni maguknak a tápanyagoknak és/vagy metabolitjaiknak a hozzájárulását is ebben a folyamatban. Például az étkezési zsírból származó endokannabinoidok a bél-agy tengely fő alkotóelemei, és szinaptikus változásokat idézhetnek elő az agyban (Crosby et al., 2011; Lafourcade et al., 2011; Bermudez-Silva et al., 2012). Másrészt úgy tűnik, hogy a stresszhez kapcsolódó jelek nem vesznek részt az étrend által kiváltott hipotalamusz plaszticitásban, mert az ismert körülmények, mint például a HFD-nek való újbóli expozíció, még mindig a PSA plaszticitási marker felfelé történő szabályozását eredményezték, míg az élelmiszer-újdonság nem volt elegendő e válasz kiváltására.

Mivel a hipotalamusz plaszticitása széles körben konzervált folyamatnak tűnik (Peinado és mtsai, 2002; Pinto és mtsai, 2004; Ebling és Barrett, 2008; Appelbaum és mtsai, 2010; Baroncini és mtsai, 2010), az étrend által kiváltott hipotalamusz a plaszticitás az embereknél is jelen lehet. Az agy plaszticitásának tipikus megengedő tényezője, a BDNF haploinsufficiency-je valóban összefügg a gyermekkori elhízással (Han és mtsai, 2008). Ezenkívül két legutóbbi, nagy emberi kohorszok egész genomra kiterjedő asszociációs vizsgálata erős kapcsolatról számolt be a magas testtömeg-index és a polimorf lókuszok között, amelyek szomszédos génjei magasan expresszálódnak az agyban, és úgy tűnik, hogy részt vesznek a neuronok fejlődésében és/vagy aktivitásában ( Thorleifsson és mtsai, 2009; Willer és mtsai, 2009). Így ezek a tanulmányok kiemelik azt a döntő szerepet, amelyet az agyi plaszticitás játszhat az ételbevitel és az energia homeosztázis szabályozásában az emberekben is.

Összegzésként megállapításaink új betekintést engednek az ételbevitel szabályozásába. Megmutatjuk, hogy a melanokortin rendszer gyorsan alkalmazkodik a bevitt ételhez. A POMC neuronok étrend által kiváltott újbóli bekötése hatással van az energiafogyasztásra. A táplálkozás által kiváltott hipotalamusz plaszticitás megkezdésének képtelensége obesogén, ezért új tényező lehet a metabolikus betegségek etiológiájában.