Az étrend és a sejtméret egyaránt befolyásolja a királynő és a dolgozó közötti differenciálódást a méhek DNS-metilációja révén (Apis mellifera, Apidae)

Családi méhkutató intézet, Jiangxi Mezőgazdasági Egyetem, Nanchang, Jiangxi, Kína

sejtméret

Michigan Állami Egyetem, Entomológiai Tanszék, East Lansing, Michigan, Amerikai Egyesült Államok, Ökológia, evolúciós biológia és magatartás program, Michigan State University, East Lansing, Michigan, Amerikai Egyesült Államok

Családi méhkutató intézet, Jiangxi Mezőgazdasági Egyetem, Nanchang, Jiangxi, Kína

Családi méhkutató intézet, Jiangxi Mezőgazdasági Egyetem, Nanchang, Jiangxi, Kína

Családi méhkutató intézet, Jiangxi Mezőgazdasági Egyetem, Nanchang, Jiangxi, Kína

Családi méhkutató intézet, Jiangxi Mezőgazdasági Egyetem, Nanchang, Jiangxi, Kína

  • Yuan Yuan Shi,
  • Zachary Y. Huang,
  • Zhi Jiang Zeng,
  • Zi Long Wang,
  • Xiao Bo Wu,
  • Wei Yu Yan

Ábrák

Absztrakt

Háttér

A mézelő méh (Apis mellifera) fiatal lárvái totipotensek; válhatnak királynőkká (reproduktív anyagok) vagy munkásokká (nagyrészt steril segítőként). Kimutatták, hogy a DNS-metiláció fontos szerepet játszik ebben a differenciálódásban. Ebben a tanulmányban megvizsgáljuk az étrend és a sejtméret hozzájárulását a kaszt differenciálásához.

Módszertan/fő megállapítások

Megmértük a metilációban részt vevő kulcsfontosságú enzim, a Dnmt3 aktivitását és génexpresszióját; a metiláció sebessége a p62 géndaktinban; valamint a kifejlett méhek morfológiai jellemzői, amelyeket vagy munkakocsonyával vagy méhpempővel táplált lárvákból fejlesztettek ki; és akár a királynő, akár a munkássejtekben nevelt lárvák. Megmutatjuk, hogy mind az étrend típusa, mind a sejtméret hozzájárult a királynő és a munkavállaló differenciálódásához, és hogy a két tényező ugyanazon gén-dinaktin p62 különböző metilációs helyeit érintette.

Következtetések/jelentőség

Megerősítjük azokat a korábbi megállapításokat, amelyek szerint a Dnmt3 kritikus szerepet játszik a mézelő méh kaszt differenciálásában. Ezenkívül először mutatjuk be, hogy a sejtszint is szerepet játszik a lárvák fejlődésének befolyásolásában, ha az étrend változatlan.

Idézet: Shi YY, Huang ZY, Zeng ZJ, Wang ZL, Wu XB, Yan WY (2011) Az étrend és a sejtméret egyaránt befolyásolja a méhek (Apis mellifera, Apidae) DNS-metilációja révén a királynő és a munkavállaló differenciálódását. PLoS ONE 6 (4): e18808. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0018808

Szerkesztő: Michael Freitag, Oregoni Állami Egyetem, Amerikai Egyesült Államok

Fogadott: 2010. november 3 .; Elfogadott: 2011. március 12 .; Közzétett: 2011. április 26

Finanszírozás: Ezt a munkát a Kínai Mezőgazdasági Kutatórendszer (CARS-45. Sz.), A Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (31060327. sz.), A Kínai Oktatási Minisztérium Doktori Alapja (20103603110003 sz.) És Michigan Michigan mezőgazdasági kísérleti állomása támogatta. Állami Egyetem. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A mézelő méh (Apis mellifera) rendkívül euzociális rovar, amelyet a kifinomult munkamegosztás, az erőforrások hatékony felhasználása érdekében táncos kommunikáció és a magas szintű kohézió jellemez, amely „szuperorganizmusként” működik [1]. A normál mézelő méhcsalád egyetlen szaporodókirálynőből áll, néhány-néhány ezer haploid drónból (az évszaktól függően), és több tízezer nem reproduktív női dolgozóból. Annak ellenére, hogy mind a királynő, mind a dolgozói genetikailag azonosak, a királynő a reproduktív tag és a petefészkeit röviddel a párzás után aktiválja, míg a dolgozóknak nagyon alacsony a petefészkei száma, és csak korlátozott számú petét képesek előállítani, ha aktiválódnak (királynő nélküli körülmények között) ). Az ovariole száma mellett a királynők és a dolgozók morfológiájában, viselkedésében, fiziológiájában és hosszú élettartamában óriási különbségeket mutatnak [2] - [4].

A legfrissebb felfedezés az, hogy a DNS-metiláció részt vesz a kaszt meghatározásában. Wang és mtsai. [11] először megállapította, hogy a mézelő méheknek DNS-metilációs rendszere van a gerinces DNS-metiltranszferázok két aktív ortológjával, a Dnmt1 és a Dnmt3 [11]. Ezután kimutatták, hogy a Dnmt3 részt vesz a mézelő méhek kaszt meghatározásában [12]. Ennek a génnek az elcsendesítése az újonnan kikelt lárvákban csökkent metilezési sebességet eredményez, ami a királynők jelentősen nagyobb arányához vezet. A csökkent metiláció tehát a méhpempő (RJ) hatását utánozza. Kucharski és mtsai. [12] meghatározta a metiláció százalékát 10 CpG helyen a dynactin p62-ben, egy génben, amely reagál az étrendi változásokra a Drosophila-ban. Ismételten a kettős szálú Dnmt3 RNS injektálása a metiláció sebességének csökkenését eredményezte a dynactin p62-ben, ha a 10 CpG helyet együttesen vesszük figyelembe. Ez utánozza a magas metilációs arányokat a dolgozó lárvákban és az alacsony metilációs arányokat a királyi lárvákban, ha telepeken belül nevelik.

Míg a táplálkozás kasztmeghatározásra gyakorolt ​​hatását jól tanulmányozták [10], [12], [13], [14], nem egyértelmű, hogy a munkás és a királynő sejtek közötti méretbeli különbség is hozzájárul-e a kaszt meghatározásához. Ebben a tanulmányban beszámolunk mind a táplálkozás, mind a sejtméret Dnmt3 aktivitásra, annak génexpressziójára és a felnőtt méhek ebből eredő fenotípusára gyakorolt ​​hatásáról. Megvizsgáltuk azt a hipotézist is, hogy a táplálkozás és a sejtméret befolyásolja a különböző CpG helyek metilációját a dynactin p62-ben.

Eredmények

Az 1. ábrán a p62 géndinaktin szinte összes exonja között elosztott egyedi CpG-helyeket mutatjuk be. Két helyen (CpG9 és 13) nem észleltünk metilációt, és az 1. táblázatban nem mutatjuk be őket., 14) két CpG-hely túl közel volt ahhoz, hogy el lehessen választani egymástól, és ezeket az 1. táblázatban egyetlen helyként tüntettük fel.

A polimeráz láncreakció primereket úgy tervezték, hogy lefedjék a legtöbb CpG helyet, kivéve a 6. és 9. exonban találhatókat. Az 1–14. Számok a CpG helyek helyére utalnak, és az aláhúzás kiemeli azokat az egységeket, amelyekben egyszerre két CpG helyet teszteltek. A CpG 9 és 13 esetében nem észleltünk metilációt, és az 1. táblázatban nem szerepeltek.

Az étrend hatása a kaszt differenciálódására

A különböző időtartamú méhpempővel táplált lárvák sokféle élettani változást eredményeztek. Az RJ-vel hosszabb ideig táplált lárvák szignifikánsan alacsonyabb Dnmt3 aktivitást eredményeztek (2A. Ábra), szignifikánsan alacsonyabb Dnmt3 mRNS expressziót (2B. Ábra) és szignifikánsan alacsonyabb metilációs sebességet eredményeztek a p62 gén-dynactin esetében (2C. Ábra) (P 2. ábra A lárvák 3, 4 vagy 5 napos méhpempővel történő táplálásának hatása.

Megjelennek a Dnmt3 enzimaktivitás mmol/perc (A), a Dnmt génexpresszió (B) egy referencia gén kalmodulinhoz viszonyítva, valamint a metiláció százaléka a p62 (C) géndinaktinban 6 napos lárvákban és a felnőttek százaléka királynők, intercastes vagy munkások (D). A sávok tetején található különböző betűk szignifikáns különbséget jeleznek (P 2 (P 3. ábra. A sejtméret hatása a mézelő méhlárvákra).

Megjelenik a Dnmt3 enzimaktivitás mmol/percben (A, D), a Dnmt3 génexpresszió (B, E) egy referencia gén kalmodulinhoz viszonyítva, a metiláció százaléka a p62 (C, F) géndinaktinban 3 napos (balra) és 5 napos lárvák (jobbra), és a felnőttek százaléka jelent meg munkavállalóként (G). Az itt nem dolgozó munkavállalók (a királyné sejtjeinek 19% -a) mind közvetítettek voltak. Az adatok elemzése és transzformálása megegyezett a 2. ábrával.

Vita

E vizsgálat eredményei azt mutatják, hogy 1). A méhpempő időtartamának növelése fokozott választ eredményezett a csökkent metiltranszferáz enzimaktivitásban, csökkent a metiltranszferáz gén expresszióban és csökkent a metiláció a p62 géndinaktinban, ami viszont a királynők jelentős növekedését és a dolgozók vagy az intercastes csökkenését eredményezte; 2). A sejtméret is hozzájárult a kaszt differenciálódásához; a nagyobb királynősejtek alacsonyabb metiltranszferáz enzimaktivitást, alacsonyabb metiltranszferáz gén expressziót és alacsonyabb metiláció százalékot eredményeztek a p62 géndinaktinban, ami a termelt dolgozók lényegesen alacsonyabb százalékát eredményezte és 3). Az étrend típusa és a sejtméret, bár mind a metiltranszferáz aktivitás modulálásával, másrészt a gén expressziója és a dynactin p62 metilációjának sebessége révén befolyásolja a kaszt differenciálódását, a különböző CpG metilációs helyekre hatott. Ezek az eredmények arra engednek következtetni, hogy a sejtek nagysága, amely egy korábban jórészt figyelmen kívül hagyott tényező, szintén hozzájárul a kaszt differenciálódásához.

Köztudott, hogy a 3 napos munkanövény lárvák még mindig képesek nagyrészt királynő fenotípussá fejlődni [5]. Ezért arra számítottunk, hogy nem észlelünk különbséget a 3 napos lárvák két csoportja között, amelyek különböző méretű sejtekben nevelkedtek, mivel mindkettő ugyanazt az étrendet kapta. Ehelyett azt figyeltük meg, hogy 3 napos lárvákban az összes mért válasz (Dnmt3 aktivitás, expresszió és a metiláció százaléka) szignifikánsan különbözött a queen-cup és a munkássejt által nevelt lárvák között (3. ábra A – C). Ez arra utalt, hogy még a 3 napos korban is a lárvák valahogyan észlelték a nevelési környezetükben mutatkozó különbségeket, annak ellenére, hogy a lárvák még mindig viszonylag kicsiek (a munkássejtek méretéhez képest). Ezek a különbségek nem lettek feltűnően nagyobbak, amikor a lárvák 5 naposak voltak (3D – F ábra). A térkorlátozás az egyetlen magyarázat a megfigyelt különbségekre, mert a gravitációs faktort (a telepen a királyné sejtjei eltérően orientálódnak a dolgozó sejtektől) eltávolítottuk a laboratóriumi lárvák nevelési környezetében.

A Dnmt3 expresszióján és a metiláció sebességén kívül a p62 géndaktinban mértük a Dnmt3 enzimaktivitását is (2A., 3A. És 3D. Ábra). A 2A. Ábra és a 2B. Ábra vizuális összehasonlítása azt sugallja, hogy a Dnmt3 enzimaktivitás érzékenyebb vizsgálatot jelent a Dnmt3 expresszióhoz képest, mivel a 3 és 5 „Napi méhpempővel táplált napok” közötti különbségek szembetűnőbbek voltak a Dnmt3 enzimaktivitásban, mint a Dnmt3 expresszióban szintek. A két mérés azonban hasonlóvá válik a sejttípusú kísérletben (3A, B és D, E ábra). Ezek az eredmények arra engednek következtetni, hogy a két tényező (az étrend típusa és a sejtméret) eltérően befolyásolja a Dnmt3 aktivitását és gén expresszióját.

Az 1. táblázat eredményei azt sugallják, hogy az étrend típusa és a sejtméret befolyásolta a különböző CpG helyeket. Az étrend típusa jelentősen befolyásolta a dynactin p62 metilációs sebességét a 4., 5., 8. és 14. helyen, míg a sejtméret érintett 1/2, 3., 4., 7., 8. és 10. helyen. Csak a 4. és 8. helyet érintette mindkettő faktorokat és a 6. helyet, valamint a 11/12/helyet egyik sem befolyásolta. Ez azt sugallja, hogy a két tényező két különböző útvonalon működhet. E két tényező manipulálásával a megkülönböztető gének eltérő módon metilálódhatnak, de ehhez további kísérleti megerősítésre van szükség.

A 2D. Ábra eredményei azt mutatják, hogy a lárva diéta 3 napos RJ-ről 5 napos RJ-re történő megváltoztatása 57% -ról 0% -ra csökkentette a munkavállalókat, ami az étrendi manipuláció miatti teljes átállásra utal. A 3G. Ábra azt mutatja, hogy a dolgozó sejtekben lakó lárvák 100% -a vált munkássá, míg 81% -a nővé vált, amikor királynői csészékben tartózkodott. A másik 19% intercastes volt, nem állítottak elő királynőt. A dolgozók arányának változása kizárólag a sejtméret-különbség miatt következett be, mivel mindkét csoportot azonos étrenddel táplálták (3 napos lárvákból gyűjtött WJ). Ez a dolgozók 19% -os csökkenését jelenti, ami az étrendi hatás hatásának mintegy ötöde (vagyis ha figyelmen kívül hagyjuk azt a tényt, hogy az intercastes nem királynő). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy bár a sejtméret befolyásolhatja a kaszt differenciálódását, hatása gyengébb az étrendi hatáshoz képest.

A DNS-metiláció a mézelő méhek kutatásának fő témájává vált [12], [15], [16] a rendszerben való kezdeti felfedezése után [11]. Vizsgálatunk először mérte a metiltranszferáz Dnmt3 aktivitását, és bizonyítékot szolgáltat arra vonatkozóan, hogy a sejttípusok is befolyásolják a DNS metilációját, ami a királynő és a munkavállaló fejlődésében eltéréseket eredményez. További vizsgálatokra van szükség annak megértéséhez, hogy a sejtméret-különbségről szóló információ hogyan alakul át fiziológiai változásokká a két kasztban.

Anyagok és metódusok

A nyugati mézelő méhecskét, az Apis mellifera-t használták ebben a vizsgálatban. A mézelő méhcsaládokat a méhészeti kutatóintézetben, Jiangxi Mezőgazdasági Egyetemen, Nanchang, Kína (28,46 ° É, 115,49 ° K) tartották fenn, a szokásos méhészeti technikáknak megfelelően. Az összes kísérletet egyetlen telepen végeztük, hogy biztosítsuk a genetikai hasonlóságot az alkalmazott lárvák között.

Az étrend hatása a kaszt differenciálódására

A méhlárvákat az első három napban a telep belsejében található műanyag csészékben nevelték. Ezeknek a lárváknak nem volt szükségük oltásra, mert a tojásokat közvetlenül a királynői csészékbe helyezték úgy, hogy a királynőt egy speciális ketrecbe zárták. Ezeket a királynő csészéket ezután leválaszthatják és felhasználhatják méhpempő (RJ) előállításához [17]. Az első három nap után a lárvákat három csoportra osztottuk, és ugyanazokban a királynő csészékben neveltük inkubátorban (35 ° C és 78 ± 7% relatív páratartalom). A három csoport vagy újonnan betakarított RJ-t kapott (ugyanazon a telepen ugyanazon a telepen szüretelték) 2 napig (5 napos RJ), vagy RJ-t az első napig, majd frissen gyűjtött munkakocsonyát öreg lárvákból (WJ) (4 napos RJ), vagy WJ csak 2 napig (3 nap RJ). A lárvákat 12 óránként új étellel (200 µl/csésze) átvittük a királynő csészékbe. A 6. napon négy mintát vettünk az enzimaktivitás, a Dnmt3 génexpressziójának és a metiláció sebességének meghatározására, mindegyik minta 10 lárvafejet tartalmazott. A kísérletet két külön kísérletben (kísérletenként 1060 lárva) megismételtük, csoportonként 8 mintát (egyenként 10 lárvafejet) kapva.

A sejtméret hatása a kaszt differenciálódására

A mézelő méhlárvákat műanyag anyakupákban vagy munkássejtekben nevelték inkubátorban (35 ° C, 78 ± 7% relatív páratartalom) az első naptól (a lárvák kikelésétől számított 24 órán belül). Mindegyik sejtet 200 µl frissen összegyűjtött WJ-vel alapoztuk (aznap háromnapos munkáslárváktól gyűjtöttük be), mielőtt a lárvát áthelyeztük volna. A Queen csészék ugyanolyan típusúak voltak, mint az első kísérlet. A munkasejtek természetes méhviaszfésű darabokon voltak (mindegyik kb. 398 × 152 mm). A lárvákat 8 óránként új étellel a királynői csészékbe vagy a dolgozó cellákba helyezték át. A lárvákból a 3. napon (teljes lárvák) és az 5. napon (csak a fejek) vettünk mintát ugyanazon három paraméter mellett, mint az első kísérlet, mindegyik paraméterhez N = 8 mintát (Dnmt3 aktivitás, génexpresszió és metilációs sebesség). 10 lárvát vagy fejet tartalmaz. A 6. napon az érett lárvákat 6 sejtes szövetkultúra lemezekre (Costar, NY, USA) vittük át, amelyeket Kimwipe darabdal béleltünk, és inkubátorban (35 ° C és 78 ± 7% relatív páratartalom) tartottuk bábozás céljából [18]. Az összes megjelenési arány (1 napos lárvák felnőtteknek) 56,6% volt. Csoportonként 80 felnőtt méhből vettünk mintát morfológiai jellemzőik értékeléséhez. Minden kísérlethez 1400 lárvát neveltünk, és a kísérletet két különböző kísérletben ismételtük meg.

Kísérleti részletek

RJ és WJ betakarítása.

Az RJ-t a kínai szokásos gyakorlat szerint állították elő [19]. Röviden, a királynőt egy királynő választotta el a telep többi részétől, a fedélzet kivételével. A fiatal (egy napos) lárvákkal rendelkező királynői csészéket bevitték a telepbe, és a dolgozók 2 napig etették őket. Ezután a lárvákat eltávolítottuk, és a friss RJ-t egy spatulával eltávolítottuk, és felhasználásig 4 ° C-on tároltuk. Ahhoz, hogy régi lárvákból munkás zselét szerezzünk, először gondosan eltávolítottunk egy 3 napos lárvát oltóeszköz vagy pár fogó segítségével, majd egy spatulával eltávolítottuk a WJ-t. Az 1. kísérletben mind RJ, mind WJ ugyanabból a telepből származott, mint a kísérleti lárvák.

DNS-metil-transzferáz-3 aktivitás mérése.

A lárvák nukleáris kivonatát az EpiQuik ™ Nuclear Extraction Kit (Epigentek, Brooklyn, NY, USA) protokolljának megfelelően készítettük el. A Dnmt3 aktivitást az EpiQuik ™ DNS metiltranszferáz aktivitás/gátlás vizsgálati készlet (Epigentek, Brooklyn, NY, USA) eljárása szerint teszteltük. A 450 nm-es abszorbanciát egy Multiskan MK3 mikrolemez-olvasón (Thermo Fisher Scientific Shanghai Instruments Co Ltd, Sanghaj, Kína) olvastuk le.

A DNS-metiltranszferáz 3 gén expressziójának mérése.

A teljes RNS-t Trizol/QIAGEN RNeasy eljárással (QiaGen, USA) izoláltuk. A cDNS szintézisét Revertra Ace (Toyobo, Japán) alkalmazásával hajtottuk végre a gyártó utasításai szerint. A méh méh calodulin génjét használtuk referenciaként. A Dnmt3 és a kalmodulin primerei Ying et al. [11] és Kucharski et al. [12], ill. A ciklus paraméterei a következők voltak: 94 ° C, 2 perc, 40x (95 ° C, 10 sec, 60 ° C, 15 sec, 72 ° C, 15 sec) és 72 ° C, 10 perc. A kvantitatív adatok kinyeréséhez RotorGene v6.0 szoftvert (Corbett Research, Ausztrália) használtunk.

A p62 dinamin metilációs állapotának mérése.

Az összes DNS-t a PUEX Animal Genomic DNA Extraction Kit (Cat. No. 3625031 PUEX, Peking, Kína) protokolljának megfelelően izoláltuk. A megtisztított DNS-t (mintánként> 50 ng) ezután a CapitalBio-hoz (Peking, Kína) küldték kvantitatív metilációs elemzés céljából, protokolljukat Wang et al. [20]. Röviden, a globális metilációs sebességeket a Methylamp Global DNS Methylation Quantification Ultra Kit (Epigentek, New York, NY, USA) segítségével határoztuk meg. Az egyedi metilációs hely meghatározásához a genomi DNS-t először biszulfittal kezeltük a Methylamp DNS Modification Kit (Epidgentek) segítségével. Ezután a kvantitatív metilációs analízist a Sequenom MassRARRAY Platform (CapitalBio, Peking, Kína) végezte el. A rendszer mátrix-segített lézeres deszorpciós/ionizációs repülési idő (MALDI-TOF) tömegspektrometriát alkalmaz, RNS-alapú specifikus hasítással kombinálva (MassCLEAVE).

Az alábbiakban a dynactin p62-hez használt három primer szekvenciáját mutatjuk be (XP_001121083):

  1. dynactin_1-10F: aggaagagagGAAGATTTATTTTTGTAGGTATTGTT
    dynactin_1-T7R: cagtaatacgactcactatagggagaaggctTTACTCTTAAAAATACATATCCAACTC
    dynactin_2-10F: aggaagagagAATTAGTTATAGGAGGTTGGTTTGAA
    dynactin_2-T7R: cagtaatacgactcactatagggagaaggctAATTCCTCTACTTCTATACTAACAACAA
    dynactin_3-10F: aggaagagagATTAGAAGTAAGGATTGTTATTTGTGAA
    dynactin_3-T7R: cagtaatacgactcactatagggagaaggctTCATCATATTCAACAACATCATCTCT

A morfometria mérése.

A felnőttkori felbukkanás után minden egyént megmérettünk a kilépési súlyuk alapján (1 mg pontossággal). Az egyéb morfológiai jellemzőket egy Panasonic színes CCTV kamera (WV-GP240, Suzhou Co Ltd) és számítógépes grafikus elemző rendszer (T20080324-X0690-Z, Peking TianHong Precision Instrument Technology Co. Ltd., Kína) segítségével mértük. Ide tartoztak a test hossza, a hátsó szárny hossza és szélessége, a fogak hossza és a harmadik tergum hossza. A királynői, a királynőszerű és a munkásméhek petesejtjeit boncolgatták és boncolták Li és Hsziao szerint [21]. Megjegyeztük a corbicula jelenlétét vagy hiányát is minden felnőtt méh hátsó lábán. A munkavállalókat, az intercastes-eket és a királynőket a petefészkenként levő petefészkek száma és a corbicula jelenléte/hiánya alapján azonosították, a korábban leírtak szerint [12].

Adatelemzés.