Az étrend modulálja a vakbél bakteriális sokféleségét és a fiziológiai fenotípusokat a BXD egér genetikai referenciapopulációjában

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, hivatalos elemzés, módszertan, vizualizáció, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Társadalmi Klinika, John Hopkins Egyetem Orvostudományi Kar, Baltimore, Maryland, Amerikai Egyesült Államok, Mezőgazdasági, Élelmiszer- és táplálkozástudományi tanszék, Alberta Egyetem, Edmonton, Alberta, Kanada

Szerepek Konceptualizálás, adatgondozás, formális elemzés, vizsgálat, módszertan

Társulás Állattudományi Tanszék, Nebraskai Egyetem, Lincoln, Nebraska, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Konceptualizálás, adatgondozás, vizsgálat, módszertan, vizualizáció, írás - áttekintés és szerkesztés

Integrációs Rendszerélettani Hatósági Laboratórium, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Svájc

Szerepek konceptualizáció, finanszírozás megszerzése, módszertan, projekt adminisztráció, források, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

Integrációs Rendszerélettani Hatósági Laboratórium, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Svájc

Szerepek konceptualizálás, finanszírozás megszerzése, vizsgálat, módszertan, erőforrások, szoftver, vizualizáció

Tennessee Egyetem Egészségtudományi Központ Genetikai, Genomikai és Informatikai Tanszék, Memphis, Tennessee, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Konceptualizálás, adatgondozás, formális elemzés, vizsgálat, módszertan, projekt adminisztráció

John Hopkins Egyetem Orvostudományi Egyetem Patológiai Osztálya, Baltimore, Maryland, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, hivatalos elemzés, finanszírozás megszerzése, vizsgálat, módszertan, projekt adminisztráció, erőforrások, felügyelet, validálás, vizualizáció, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Társulás Állattudományi Tanszék, Nebraskai Egyetem, Lincoln, Nebraska, Amerikai Egyesült Államok

Maria Elisa Perez-Munoz,
M. McKnite ősz,
Evan G. Williams,
Johan Auwerx,
Robert W. Williams,
Daniel A. Peterson,
Daniel C. Ciobanu

Ábrák

Absztrakt

A BXD család az egyik kiemelkedő genetikai referenciapopulációvá vált a fenotípusos variációk genetikai és környezeti kontrolljának megértésében. Itt értékeljük az étrendben a zsír különböző szintjeire adott válaszokat, mind a chow étrend (CD, 13–18% zsír), mind a magas zsírtartalmú étrend (HFD, 45–60% zsír) felhasználásával. Vizsgáltuk a BXD törzsek kohorszait, mindkét beltenyésztett szülő C57BL/6J és DBA/2J (közismerten B6, illetve D2 néven), valamint a B6D2 és D2B6 reciprok F1 hibrideket. A genetikai és étrendi tényezők összehasonlító hatását számos fenotípus profilozásával elemeztük, amelyek közül a legjelentősebb a vakbaktériumok összetétele. A BXD-k és az F1-hibridek szülei korlátozott különbségeket fejeznek ki a súly és a testzsír-növekedés tekintetében a CD-n. Ezzel szemben a HFD törzskülönbségei jelentősek a testzsír százalékában, a DBA/2J 12,5% -kal több zsírt halmoz fel, mint a C57BL/6J (P 0,20), amikor CD-t kapnak, míg a HFD-nek kitett törzsek között jelentős különbségeket fedeztek fel (P 1. ábra A testzsírösszetétel (12 hetes életkor) (A) és az átlagos testtömeg (g) változásának aránya az étrendi kísérlet kezdetéhez (5 hetes életkor) (B) viszonyítva C57BL/6J, DBA/2J és kölcsönös F1 hibrid törzseik CD-nek és HFD-nek vannak kitéve.

A BXD szülői törzsek egyedi vakbél mikrobiális profilokkal rendelkeznek

A cecum mikrobiota vizsgálata a C57BL/6J és a DBA/2J törzsek közötti mikrobiális közösségek teljes eltérését mutatja (2A. És 2B. Ábra). A DBA/2J egerek alacsonyabb fokú inter-individualitással rendelkeznek (P = 0,0042; 2C-top ábra), míg a C57BL/6J egerek bélmikrobiómái gazdagabbak és nagyobb számban vagy ritka fajokat tartalmaznak, mint a DBA/2J egerek (P = 0,0221, a 2C ábra alján) (S1 táblázat). A C57BL/6J és a DBA/2J bél mikrobiotáját a Firmicutes uralta, 62% -kal, illetve 88% -kal járul hozzá (2D. Ábra). Az aktinobaktériumok és a Bacteroidetes kevésbé képviseltették magukat a DBA/2J-ben, ezek 9% -ot, illetve 1% -ot tettek ki, szemben a C57BL/6J-vel, ahol ezeket a phylákat 18, illetve 16% -kal képviselték. Nemzetségi szinten mindkét törzsben a Lactobacillus volt a leggyakoribb nemzetség, bár DBA/2J-ben magasabb, mint a C57BL/6J-ben (49%, illetve 21%). A Bifidobacterium és a Turicibacter a következő két legelterjedtebb nemzetség a C57BL/6J-ben (15% és 7%), míg DBA/2J-ben való mennyiségük marginális volt (2. ábra. A szülői törzsek bélmikrobiómájának összetétele.

A minták csoportosítása a Bray Curtis-féle különbségek (A) NMDS-jével és a súlyozatlan Unifrac távolságok (B) dendrogramja azt mutatja, hogy a C57BL/6J egerek mikrobiális közösségei különböznek a DBA/2J egerekétől. A Bray Curtis-féle eltérés (C-top) mint a β-diverzitás mérése azt mutatja, hogy a DBA/2J egerek alacsonyabb inter-individualitásúak, míg a Chao 1 index (C-bottom) α-diverzitás elemzése azt mutatja, hogy a bél A C57BL/6J egerek mikrobiómái gazdagabbak és nagyobb számú vagy ritka fajt tartalmaznak, mint a DBA/2J egerek. A kördiagramok és a grafikon mindkét törzsben jelen lévő taxonok relatív bőségét (D) mutatják a törzs, a család és a nemzetség szintjén. Azokat a taxonokat, amelyeknek a bősége alacsonyabb volt, mint 1%, a kördiagramon csoportosítottuk. A jobb oldali grafikonon csak statisztikailag szignifikáns taxonok láthatók. Statisztika: Mann-Whitney t-teszt vagy többszörös t-teszt, a vonalak és oszlopok az átlagot és a szórást jelentik.

A nem és az anyai ketrec hatása részben összezavarodott, és közvetlenül nem becsülhető meg. Ha a modellbe (kortárs csoportként) együttesen alkalmazzuk a törzset, a törzsekkel együtt továbbra is megfigyelhetők a különbségek. Ezenkívül a nemi/anyai ketrec együttes hatásait figyelték meg a Clostridia, Bacilli, Bacteroidia és Deltaproteobacteria osztályokban (P 3. ábra. A magas zsírtartalmú étrend elmozdulásokat okoz a BXD bél mikrobiómáiban.

A minták csoportosítása az NMDS segítségével a súlyozatlan és súlyozott Unifrac távolságok (B) Bray Curtis diszpararitásának (A) és a fő koordinátanalízisnek (PCoA) (B) azt mutatja, hogy a BXD egerekben a bél mikrobaközösségei eltolódtak, amit a HFD okozott. A β-diverzitás mutatóinak elemzése statisztikailag szignifikáns különbségeket mutat az étrendi kezelések között (C). A kördiagramok és a grafikon mindkét törzsben jelen lévő taxonok relatív bőségét (D) mutatják a törzs és a nemzetség szintjén. Azokat a taxonokat, amelyeknek a bősége alacsonyabb volt, mint 1%, a kördiagramba csoportosítottuk. Csak statisztikailag szignifikáns taxonok (p. 4. ábra. Cecal sIgA CD és HFD-nek kitett BXD törzsekben.

A HFD a cecalis sIgA növekedését indukálta, a válasz a BXD törzsek között változó volt.

HFD esetén szignifikáns összefüggéseket (P ≤ 0,0001) figyeltek meg a taxonómiai egységek és a máj metabolitjai között a phylában, Firmicutes, Bacteroidetes és Proteobacteriumokban. Például a Firmicutes mennyisége negatívan összefügg a troxerutin szintjével (r = -0,70), amely flavonoid ismert potenciális antioxidáns tulajdonságokkal. A Lactococcus, a Firmicutes tagja, összefüggésben állt a krotonoil-CoA szintjével (r = 0,72), amely számos metabolikus út fontos összetevője, beleértve a zsírsavcserét is. Negatív összefüggéseket figyeltünk meg a Parabacteroides, a Bacteroidetes nemzetség és a molibdopterin-AMP (r = -0,73), valamint a pozitív kapcsolatok (r = 0,72) és a karbamoil-foszfát között. Végül, a Biophila, a Proteobacteria nemzetség, társult a p-krezol-glükuroniddal (r = 0,71), amely metabolit anaerob bélbaktériumok által végzett tirozin biotranszformáció eredményeként jött létre.

Beszélgetések

Ez a tanulmány további bizonyítékokat szolgáltat a metabolikus szindrómához kapcsolódó tulajdonságok fontos fenotípusos és genetikai variációiról a két legfontosabb egérgenetikai vonalban, a C57BL/6J és DBA/2J, valamint a hozzájuk kapcsolódó BXD RI erőforrás populációban. A HFD bemutatása rögzítette a különbségeket a BXD szülői vonalak és az F1 hibridek között, amelyeket a kontroll CD nem látott. Pontosabban, a DBA/2J és F1 hibridek, amelyek a DBA/2J gátakból származnak, több testzsírt halmoztak fel, mint a C57BL/6J és F1 hibridek, amelyek a C57BL/6J gátakból születtek, amikor HFD-nek voltak kitéve, ami nagyobb elhízásra való hajlamot mutat a DBA/2J-ben.

Azt is megállapítottuk, hogy a BXD szülői törzsek egyedi vakbél mikrobiális profilokkal rendelkeznek. A törzs szintjén, míg mindkét törzset a Firmicutes uralta, a C57BL/6J-t a nagyobb változatosság jellemzi, amely jelentősen hozzájárul a többi fő phylához, az Actinobacteriumokhoz és a Bacteroidetes-ekhez. Míg a szülői törzsek közötti mikrobiális profilbeli különbségek némelyike összekeveredhetett az anyai ketrec hatásával, az azonos filogenetikai csoportba tartozó 3 különböző alom által generált összes C57BL/6J minta csoportosulása arra utal, hogy a gazdi genetika szerepet játszik a vakbél mikrobiális profiljának modulációjában. (2A. És 2B. Ábra). Ezenkívül a HFD BXD-be történő bevezetése környezeti szuppresszorként szolgált, növelve a cecalis sIgA szintet, csökkentve a vakbél mikrobiota sokféleségét, megzavarva a gazda genetika szerepét a bél mikrobiota összetételében, és kihatva a bél mikrobiota és a máj kapcsolatára is. metabolitok.

Az IgA a mikrobiális kórokozókkal szembeni adaptív immunválasz fontos alkotóeleme, és befolyásolhatja a bél mikrobiális flórájának összetételét [15]. Egy nemrégiben készült jelentés azt találta, hogy az egerek rövid távú HFD-expozíciója (2 hét) növelte a Firmicutes mennyiségét és befolyásolta a gyulladásgátló gén expressziós profilt, növelve a gazdaszervezet hajlamát a Listeria monocytogenes fertőzésre [17].

A cecum microbiota variációjához való gazda genetikai hozzájárulásának potenciális bizonyítékát CD-n mutatták be az Oscillibacter/Oscillospira (Chr 3-hoz feltérképezve) és a Bifidobacterium/Bifidobacterium pseudolongum (Chr 6-hoz feltérképezve) esetében. A HFD bevezetése a BXD-be környezeti szuppresszorként szolgált ezeknek a QTL-eknek, valószínűleg ezen nemzetségek BXD vakbélben való hozzájárulásának csökkenése miatt. A QTL-effektusokhoz kapcsolódó potenciális gének közé tartozik a Pde7a (Chr 3) és a Txnrd3 (Chr 6). A Pde7a-hoz kapcsolódó ontológiák magukban foglalják a fémion-kötést. Az esszenciális fémionok kritikus fontosságúak a mikrobiális fajok fontos sejtes folyamataiban [18]. Két expressziós elemzés a Pde7a és az ismert gének között modulokban/utakban, két béltranszkriptóma adatkészlet (GSE59054 és GSE6065, n> 80) alapján a Genebridge (www.systems-genetics.org/) segítségével feltárta a Pde7a javasolt szerepét a bélrendszerrel immunhálózat az IgA termeléséhez (Score> 840; KEGG 04672). Figyelembe véve a Pde7a javasolt szerepét az Oscillospira arányának modulálásában, feltételeztük, hogy szignifikáns kapcsolat van e faj és az sIgA között. A várakozásoknak megfelelően az sIgA szintje korrelált az Oscillospirával a CD-ben (r = -0,41, P 0,14), megerősítve a Pde7a javasolt szerepét a bél IgA-termeléssel társult expressziós hálózatokban.

A Txnrd3, a Bifidobacterium pseudolongum (Bifidobacterium) QTL-jéhez kapcsolódó potenciális jelölt gén, a szelenociszteint tartalmazó fehérjék (szelenoproteinek) családjának tagja, amely fontos szerepet játszik a redox homeosztázisban [19]. A Txnrd3 expressziója csökkent volt az egér RAW264.7 makrofág sejtvonalában lipopoliszacharid (LPS) kezelést követően [20]. A szelénkezelés megmentette a Txnrd3 expresszióját és csökkentette az LPS-hez kapcsolódó immunológiai stresszt. Az étrendi szelénbevitel befolyásolja a gazda szelenoproteinek expresszióját, de a bél mikrobiota sokféleségét is [21]. A bél mikrobiota kivonja az étrendből a szelént. Korlátozott szelénbevitel esetén verseny alakulhat ki a mikrobiota és a gazda között. Ez az állapot a szelenoproteinek expressziójának csökkenéséhez és az antioxidatív aktivitáshoz vezethet [22]. A bifidobaktériumok képesek felhalmozni és biotranszformálni a szervetlen szelént, szerves szelénforrást biztosítva a gazdának.

A cecalis sIgA általános növekedése a HFD-ben nem volt összefüggésben a máj metabolitjainak változásával. Mindazonáltal negatív kapcsolatot figyeltünk meg CD-n az sIgA szintje és a szfingolipid anyagcserével összefüggő vegyület, a galaktozil-szfingozin (r = -0,73) között. A szfingolipidek fontos tényezők az sIgA válaszok modulálásában [26]. Az étkezési palmitinsav szfingolipidekké metabolizálódik, mint például a szfingozin (szintén a galaktozil-szfingozin szubsztrátja), amely felszívódik a bélszövetbe, és ezt követően szfingozin-1-foszfáttá metabolizálódik, amelyről ismert, hogy modulálja a sejtcsempészetet és az orális antigénekre adott sIgA válaszokat.

Összefoglalva, ennek a tanulmánynak az eredményei bemutatják a környezeti/étrendi manipuláció fontos szerepét a gazda genetikája, az immunológiai paraméterek és a gyomor-bélrendszer mikrobiota közötti kölcsönhatásokban, valamint azok hatását a metabolitokra, amelyek az egészségi állapot indikátoraként szolgálhatnak. Ezeknek a finom kapcsolatoknak a mély megértése nyújthat olyan ismereteket, amelyek segíthetnek az anyagcsere-rendellenességek ok-okozati forrásainak dekonstrukciójában.

Anyagok és metódusok

C57BL/6J, DBA/2J és kölcsönös F1 étrendi kísérlet

A cecal microbiome kiindulási sokféleségének meghatározása céljából a BXD szülői törzsekben cecum mintákat gyűjtöttünk naiv férfiaktól és nőktől C57BL/6J és DBA/2J-ből, átlagos életkoruk 11 hét volt. A kísérleti egerek három (C57BL/6J, n = 7, átlagos életkor 72 d) és négy (DBA/2J, n = 6, átlagéletkor 87 d) alomból származnak. Az egereket specifikus kórokozóktól mentes környezetben, 20–24 ° C-on tartottuk, 14/10 órás világos/sötét ciklus mellett, ad libitum hozzáféréssel a vízhez és az élelemhez a Tennessee Egyetem Egészségügyi Tudományos Központjában (UTHSC). A hím és nőstény alomtársakat külön ketrecekben helyezték el. Az egereket normál chow-étrendnek vetették alá (CD, Harlan Teklan 22/5; 17% kalória zsírból, 54% kalória szénhidrátból, 29% kalória fehérjéből). Valamennyi állatot az NIH laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutatójának és az UTHSC Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottságának (IACUC) előírásainak megfelelően tartották. Az UTHSC IACUC-ja kifejezetten jóváhagyta a vizsgálatot (680. engedély).

A magas zsírtartalmú étrend (HFD) testtömegre és testösszetételre gyakorolt hatását úgy vizsgáltuk, hogy a C57BL/6J, DBA/2J és a kölcsönös F1 hibrideket két diétás kezelésnek vetettük alá 8 héten át, 5 hetes kortól kezdve. Ebben a kísérletben 4–8 hím egeret/törzset/étrendet alkalmaztak, vagy normál chow étrendnek (CD, Harlan 7001; 13% kalória zsírból, 53% kalória szénhidrátból, 34% kalória fehérjéből) vagy magas zsírtartalmú étrendnek (HFD)., Harlan TD.06415; 45% kalória zsírból, 36% kalória szénhidrátból, 19% kalória fehérjéből). Az egereket egy specifikus kórokozótól mentes környezetben, 20–24 ° C-on tartottuk, 14/10 órás világos/sötét ciklus mellett, és ad libitum hozzáféréssel a vízhez és az élelemhez a Nebraska-Lincolni Egyetemen (UNL). Az egyéni súlyt és a ketrecben lévő táplálékfelvételt hetente rögzítették az 5. és a 12. hét között. A testösszetételt, beleértve a csont ásványi sűrűségét, a sovány és zsírszövet arányát, 12. héten rögzítettük 4-5 egér/törzs/diéta alkalmazásával PIXImus DEXA alkalmazásával. Ezt a vizsgálatot az UNL IACUC hagyta jóvá (422. számú engedély).

BXD diétás kísérlet

Cecumot gyűjtöttünk 29 hetes 32 BXD-törzs hímtől, akiket két étrend, CD és HFD-nek tettek ki, beleértve az egyes étrendekhez tartozó 3-5 állatot/törzset. A CD-diétában 30 BXD törzs volt jelen (Harlan 2018; 18% kalória zsírból, 58% kalória szénhidrátból, 24% kalória fehérjéből), míg 29 BXD törzs képviseltette magát a HFD étrendben (Harlan 06414; 60% zsír kalória, 21% kalória szénhidrátból, 18% kalória fehérjéből). A HFD-t 8 héttől kezdve vezettük be a HFD kohorszba, és a 29. héten tartott szövetgyűjtésig tartottuk. Az egyes BXD törzseket és étrendet képviselő egereket ugyanabban a ketrecben helyeztük el a 23. hétig, majd ezt követően egyedi tartást végeztük, amíg a szövetek összegyűjtésre kerültek a 29. héten egy éjszakai böjt után.

Az eutanáziát izoflurán érzéstelenítéssel hajtottuk végre, amelyet a vena cava teljes vérvételével és foszfáttal pufferolt sóoldattal történő perfúzióval végeztünk, Williams és mtsai. (2016) leírása szerint. A vakbélt, beleértve a vakbéltartalmat, és a májszöveteket folyékony nitrogénben lefagyasztották, majd -80 ° C-on tárolták mRNS, fehérje, metabolit analízis és mikrobiota (vakbéltartalom esetén) céljából. A kutatási protokollokat a svájci kantoni állat-egészségügyi hatóságok (2257.0 és 2257.1 engedélyek) hagyták jóvá.

A máj metabolitprofiljait repülés közbeni tömegspektrometriával (ToF-MS) nyertük egy Agilent 6550 QTOF-en negatív üzemmódban, 4 GHz-en, 50–1000 Da közötti jellemzők szkennelésére Fuhrer és mtsai. (2011) [27].

979 egyedi metabolit tulajdonságot azonosítottak. Ezek közül 699-et egy specifikus metabolithoz térképeztek fel a Human Metabolome Database (HMDB) annotációi alapján, míg a fennmaradó 280-at több lehetséges enantiomerre térképezték fel, az alábbiak szerint [1]. Az adatkészlet a GeneNetwork.org adatbázisban érhető el (EPFL/LISP BXD Liver Polar Metabolites CD/HFD, június 14.).

A cecum-specifikus mikrobiális DNS következő generációs szekvenálása

Cecum szekréciós immunglobulin A (sIgA) ELISA

Statisztikai analízis

Az étrendi kezelések BXD szülői vonalak, C57BL/6J és DBA/2J, valamint ezek kölcsönös F1 hibridjeinek testtömegére és testzsír% -ára gyakorolt hatását lineáris kevert modell segítségével tesztelték a JMP Pro 13.1-ben, törzs, étrend és törzs x étrend alkalmazásával. rögzített effektek és ketrec véletlenszerű.

A normális eloszlású mikrobiom adatok normalitásának elérése érdekében az értékeket log 10 transzformációnak vetettük alá. Két csoport összehasonlításához (CD-HFD összehasonlítás) a Student t tesztjeit Welch korrekciójával hajtották végre, míg Kruskal-Wallis teszteket, majd Dunn többszörös összehasonlítását alkalmazták több mint két csoport (törzsminták) összehasonlítására. A statisztikai elemzéseket a Graph Pad Prism 7-es verziójával (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornia, USA) és az R statisztikai szoftver 3.3.1-es verziójával (https://www.r-project.org/) végeztük.

Az azonos szülői törzseket képviselő férfiak és nők (C57BL/6J és DBA/2J) nem közös anyai ketrecekből származnak, és a törzsen belül a nem nem volt teljes mértékben képviselve több ketrecben. A zavaró hatások miatt a nemet és az anyai ketrecet kortárs csoport (CG) hatásként kombinálták lineáris modellben (törzs rögzített hatás és törzsbe ágyazott CG).

Az étrendnek a BXD vakbél mikrobiális profiljára gyakorolt hatását lineáris keverék modell alkalmazásával is teszteltük, a diétát fix hatásként és a törzsgenetikát véletlenszerűen alkalmazva. Az életkor és az áldozat sorrendjének hatását kovariátorként tesztelték, és a többszörös teszteléshez igazítva nem volt szignifikáns.

A cecum baktérium-összetétel phyla és nemzetség szintjén, a fentiek szerint, és a máj metabolitjainak fenotípusos összefüggéseit Spearman rang korrelációkkal becsültük meg.