Az atipikus neokortikális fejlődés az idézett2 feltételes kiütésnél neurodevelopmentális rendellenességekhez társuló viselkedési hiányokhoz vezet

Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
ORCID rekord Jessica L. MacDonald számára
Levelezés céljából: [email protected]

Absztrakt

Bevezetés

Az idegsejtek fejlődésében és a neokortexben, a magas kognitív és asszociatív funkciókért felelős agyterületen belüli kapcsolódásban bekövetkező kórélettani zavarok több neurodevelopmentális rendellenességnél jelentkeznek. Például a csatlakozás csökkenése (Frazier és Hardan, 2009) és a két agyfélteke közötti szinkronizálás gyakori az autizmus spektrum rendellenességei (ASD) esetében (Dinstein és mtsai, 2011). Ezeket az interhemisphericus kapcsolatokat a callosalis projekciós neuronok (CPN) axonjai hozzák létre, a commissuralis neuronok széles populációja, amelyeket az axon kiterjesztése határoz meg az emlős agyának legnagyobb axonális traktusa, a corpus callosum (CC) felett. a két agyfélteke. A CPN gerjesztő piramidális vetületi idegsejtek, amelyek a neokortikális rétegekben találhatók (~ 80% a II/III. Rétegekben az egérben, 20% az V-ben és kis százalék a VI-ban), de a II./III.

A CPN az interhemiszférikus idegsejtek heterogén populációja; olyan gének egyedülálló kombinációit fejezik ki, amelyek széles populációként definiálják őket, és más gének, amelyek a fejlesztés során a CPN-en belül külön alcsoportokat azonosítanak (Molyneaux et al., 2009; Fame et al., 2011; MacDonald et al., 2013). Például az egyes funkcionális neokortikális területeken belül a CPN-nek külön molekuláris és morfológiai jellemzői vannak (Lomber és mtsai, 1994; Olivares és mtsai, 2001; Grove és Fukuchi-Shimogori, 2003; Benavides-Piccione és mtsai, 2006; O'Leary és mtsai., 2007). A CPN és a kapcsolódási zavarok több neurodevelopmentális rendellenességgel társulnak, beleértve az ASD-t is (Egaas et al., 1995; Piven et al., 1997; Mukaetova-Ladinska et al., 2004; Herbert és Kenet, 2007; Frazier és Hardan, 2009; Srivastava és mtsai, 2012), Rett-szindróma (Belichenko és mtsai, 1994; Armstrong és mtsai, 1995; Kishi és Macklis, 2004, 2010; Wood és mtsai, 2009; Ribeiro és mtsai, 2020), ADHD (Hynd és mtsai, 1991; Roessner és mtsai, 2004; Seidman és mtsai, 2005), valamint a skizofrénia (Swayze és mtsai, 1990; Tibbo és mtsai, 1998; Innocenti és mtsai, 2003; Wolf és mtsai) ., 2008). A CPN tehát kulcsfontosságú, sokrétű szerepet játszik a komplex asszociatív és integratív megismerésben, és fejlődésük zavarai alaposan megváltoztatják a viselkedést.

Kísérleti eljárások

Immunhisztokémia

Az immunhisztokémiát a korábban leírtak szerint hajtottuk végre (Fame et al., 2016). Röviden, az agyakat éjszakán át 4% PFA/PBS-ben 4 ° C-on utólag rögzítettük, majd egy VT1000S rezgő mikrotomán (Leica Microsystems) metszettük. A metszeteket primer antitest-hígításokban inkubáltuk 4 ° C-on egy éjszakán át, és a megfelelő szekunder antitesteket a Molecular Probes Alexa sorozatból (Invitrogen, Carlsbad, CA) választottuk ki. Antigén-visszakeresési módszerekre volt szükség az elsődleges antitestek antigénjeinek feltárásához. A metszeteket 0,1 M citromsavban (pH = 6,0) inkubáltuk 10 percig. 95-98 ° C-on. Az elsődleges antitesteket a következőképpen használtuk: patkány anti-CTIP2 (Abcam Cat # ab18465, RRID: AB_2064130), nyúl anti-β-galaktozidáz (Thermo Fisher Scientific Cat # A-11132, RRID: AB_221539), egér anti-SATB2 (Abcam Cat) # ab51502, RRID: AB_882455), nyúl anti-TBR1 (Abcam Cat # ab31940, RRID: AB_2200219), nyúl anti-BHLHB5 (Abcam ab204791), egér anti-NeuN (Millipore Cat # MAB377, RRID: AB_2298772). Másodlagos antitestek az Invitrogen Alexa sorozatból (Invitrogen).

A neokortikális hossz és vastagság számszerűsítése

Valamennyi hossz- és vastagságmérést egyeztetett 50 μm-es szagittális szakaszok képeivel végeztük ImageJ segítségével a neocorticalis felület görbületének nyomon követésére. A szomatoszenzoros területet a Bhlhb5 expressziójával azonosítottuk a II/III. Rétegekben. A mély rétegeket (V-VI) azonosították olyan rétegekként, amelyek magukban foglalják a magas CTIP2 szintet és mélyebben expresszáló sejteket. A felszínes rétegeket (II-IV) azonosítottuk felületi vagy magas szintű CTIP2 expresszióval.

Viselkedés

Az összes viselkedési teszt esetében az egereket 30 percen át hagyták, hogy hozzászokjanak a vizsgálati helyiséghez. Mindegyik tesztet a nap azonos időpontjában futtatta az összes alom számára ugyanaz a kísérleti kísérlet, amely vak volt a genotípusra. Naponta csak egy vizsgálatot végeztek el, kezdve, amikor az egerek elérték a 10 hetes kort. Az egyes tesztekre vonatkozó specifikusabb módszerek a következők:

Ultrahangos hangosítások

Akklimatizálás után a kölyköket izolálták gátjukból egy előmelegített ketrecbe. Ezután a kölyköket külön-külön egy hangcsillapító kamrába helyezték, és az USV-ket ultrahangos mikrofonnal (Patterson M500-384) rögzítették öt perc alatt. Ezen öt perces időszak után az újszülötteket visszatették az előmelegített ketrecükbe. A hívások számát, a hívások átlagos időtartamát és a hívások csúcsfrekvenciáját a Noldus UltraVox XT szoftverrel mértük. Az egyedi USV-ket megszámoltuk, ha megfelelnek a következő kritériumoknak; a frekvencia 30 kHz és 125 kHz között volt, az időtartam 5 ms és 500 ms között volt, ≥6 ms rés mellett, és az amplitúdó nagyobb volt, mint 250a.u. háttér felett. Fontos megjegyezni, hogy a kölykök méretében nincs megfigyelhető különbség a genotípus alapján. Mivel ez egy előagyspecifikus cKO, az újszülötteknél várhatóan nincs különbség a tüdő kapacitásában vagy a hívás kezdeményezésének fizikai képességében.

Nyílt mező labirintus

Fotósugár-felvevő rendszert (SD Instrument) használó nyílt terepi labirintust alkalmaztunk aktivitás rögzítésére egy új, tiszta dobozban (40 cm × 40 cm) 30 percig, fehér háttérzajjal ~ 70 dB és fényerősséggel 1000 lux. Az egér utazási távolságát, utazási sebességét, a pihenéssel töltött időt és a nevelést a SanDiego PAS Reporter szoftverével rögzítettük és számszerűsítettük.

Világos-sötét doboz

Az idézett2 cKO állatok a WT-hez hasonlóan teljesítenek olyan vizsgálatokat, amelyek mérik a szorongásszerű viselkedést, beleértve a klasszikus Elevated-Plus labirintust és a Light-Dark Box-ot. (A), Az 5 perces Elevated Plus teszt során a Cited2 cKO egerek a WT-hez hasonlóan viselkedtek, mivel több időt töltöttek a zárt karban, mint a nyitott. (B), Az idézett2 WT, HET és cKO egerek hasonló időt töltöttek a Világos-Sötét doboz világos részében, jelezve, hogy nincs változás a szorongásszerű viselkedésben. Mindhárom genotípus összehasonlítható számú átmenetet mutatott a doboz világos és sötét része között, ami hasonló általános aktivitási szinteket jelzett. (C), A Cited2 cKO egerek hasonló szociabilitást mutattak, mint a WT a háromkamrás szociális preferencia tesztben, és mindhárom genotípus több időt töltött egy új egérrel, amelyet az oszlopdiagramon számszerűsítettek, és a WT és a Cited2 cKO hímek reprezentatív hőtérképével vizualizálták. M, újszerű egér; O, regénytárgy. N = 8-14 egér genotípusonként és nemenként. A nőstényeket és a férfiakat piros, illetve kék pontok képviselik. A statisztikai szignifikancia meghatározásához egyirányú ANOVA-t és Tukey utópróbáját használtuk.

Sok neurodevelopmentális rendellenesség harmadik gyakori fenotípusa a társadalmi interakciók hiánya. Egérmodellekben a társas interakciókat gyakran háromkamrás társadalmi preferencia teszt alkalmazásával értékelik (Yang et al., 2011). Ezt a vizsgálatot a Cited2 funkcióvesztés miatti társadalmi interakciók lehetséges különbségeinek feltárására használtuk. Érdekes módon a Cited2 cKO és HET egerek a WT-hez hasonlóan teljesítenek, több időt töltenek az új egérrel, mint az új tárgy, ami azt jelzi, hogy a társadalmi preferenciák nem változtak (4C. Ábra).

Az idézett2 feltételes kiütés jelentős zavart okoz a hallási megrázkódtatásban]

(A), A megdöbbentő válasz, a pulzus előtti gátlás és a szoktatás/szenzibilizáció értékeléséhez háromblokkos vizsgálatot alkalmaztunk a San Diego SR laboratóriumi berendezés segítségével. Az első és a harmadik blokk egy 120dB-os akusztikus hangból állt, amelyet 12-szer megismételtek a megdöbbentő válasz és a megszokás/szenzibilizáció mérésére, a második hat különböző típusú ingerből állt, amelyek ál-véletlenszerű sorrendben kerültek bemutatásra az impulzus előtti gátlás értékelésére. (B), A női idézett2 HET és cKO egerek nem mutattak különbségeket a pulzus előtti gátlásban (PPI) a WT-khez képest, míg a hímek (C) a csökkenő PPI felé mutató tendenciákat alacsonyabb pulzus előtti szinttel; a tendenciák azonban statisztikailag nem szignifikánsak. (D), Az átlagos megdöbbentő válaszra azonban nem figyeltünk meg genotípust vagy nemi különbséget (E) Az idézett 2 cKO egér mindkét nemnél a teljes teszt során csökkent szoktatást mutatott. Átlagban a 3. blokk akusztikus ingerére adott válaszuk nagyobb volt, mint az 1. blokkban adott válaszuk, ami arra utal, hogy a teszt előrehaladtával érzékenyebbek lettek az akusztikus megriadásra. N = 8-15 nemenként és genotípusonként. A nőstényeket és a férfiakat piros, illetve kék pontok képviselik. * p ↵