In vitro és in vivo eredetű Echinacea purpurea növények morfológiai értékelése és antioxidáns aktivitása Akadémiai kutatási cikk a "Biológiai tudományok"

Hasonló témák a biológiai tudományokban, tudományos cikk szerzője - Ely Zayova, Ira Stancheva, Maria Geneva, Maria Petrova, Rumiana Vasilevska-Ivanova

Akadémiai tanulmány a "In vitro és in vivo eredetű Echinacea purpurea növények morfológiai értékelése és antioxidáns aktivitása" témáról

Közép-európai Journal of Biology

Az in vitro és in vivo származó Echinacea morfológiai értékelése és antioxidáns aktivitása

Ely Zayova, Ira Stancheva *, Maria Geneva, Maria Petrova, Rumiana Vasilevska-Ivanova

Növényélettani és Genetikai Intézet, BAS, 1113 Szófia, Bulgária

2011. november 18-án kapott; Elfogadva 2012. április 23

Kivonat: Hatékony in vitro protokollt írtak le az Echinacea purpurea (L.) Moench gyors szöveti kultúrán keresztüli szaporodásához.

Az in vitro szaporítási eljárás négy szakaszból állt: 1) egy kezdeti szakasz - a palánták megszerzése Murashige és Skoog (MS) alap táptalajon, 0,1 mg L-1 6-benzilaminopurin, 0,1 mg L-1 a-naftalin-ecetsav és 0,2 mg alkalmazásával. L-1 gibberellinsav;

2) szaporítási szakasz - hajtásképződés MS táptalajon, önmagában 1 mg L-1-6-benzilaminopurinnal kiegészítve, 9,8 hajtást eredményezett explantánsonként, és 0,1 mg L-1 a-naftalin-ecetsavval kombinálva 16,2 hajtást eredményezett explantánsonként;

3) gyökeresedési szakasz - a hajtás gyökerezése félerősségű MS táptalajon 0,1 mg L-1 indol-3-vajsavval 90% -ban gyökerező mikrotelepeket eredményezett;

4) a növények ex vitro akklimatizációja. A tőzeg és a perlit keveréke volt a legmegfelelőbb ültetési szubsztrátum a keményedéshez, és biztosította a szaporított növények magas túlélési gyakoriságát. Jelentősen magasabb szinteket figyeltek meg a vízben oldódó és lipidben oldódó antioxidáns kapacitások (aszkorbát és a-tokoferol ekvivalenseként kifejezve) és az összes pnenoltartalom tekintetében az Echinaceae virágok in vitro szaporított növényekből származó kivonataiban, amelyek alkalmazkodtak a terepi viszonyokhoz, a hagyományosan termesztett növények.

MS - Murashige és Skoog táptalaj;

PGR - növénynövekedés-szabályozó;

GA3 - gibberellinsav;

AA - aszkorbinsav;

IBA - indol-3-vajsav;

NAA - a-naftalin-ecetsav.

Az Echinacea purpurea L. Moench (Asteraceae) vagy a lila kúpvirág széles körben elterjedt gyógynövény, amelyet növényi termékek különféle választékában alkalmaznak. Bebizonyosodott, hogy az Echinacea az egyik legígéretesebb immunerősítő és -modulátor, számos tudományos tanulmány és gazdag klinikai bizonyíték mellett [1-3]. Az egyre növekvő E. purpurea iránti igény a gyors módszerek kidolgozását igényli

a növények szaporodása és a kívánt tulajdonságokkal rendelkező új fajták gyorsabb bevezetése [4]. Az E. purpurea növények azonban nagyon heterozigóta utódokat hoztak létre a területen [5]. E tekintetben az in vitro szövetkultúrák értékes technikának bizonyultak genetikailag homogén növényi anyagok előállításához. 58 egyedi csírasejt-vonalat azonosítottunk az antioxidáns aktivitás és a kaftársav, klorogénsav, cikorinsav, cinarin és echinakozid koncentrációinak szűrése alapján klonálisan szaporított palántanövényekből [6].

Számos in vitro technikát fejlesztettek ki E. purpurea-ban [3,4,7-9], mivel egyes genotípusok magas in vitro szaporítási együtthatót mutattak [8,10,11]. A biotechnológiai technikák alkalmazása felajánlhatja annak lehetőségét, hogy rövid időn belül nagy mennyiségű egységes, kiváló minőségű növény álljon elő, és korlátozott hely áll rendelkezésre a biomassza biológiai aktív vegyületek forrásaként történő előállításához [3]. Ennek ellenére az in vivo és in vitro tenyésztéssel kapcsolatos számos kérdés továbbra sem megoldott. Bulgáriában az E. purpurea-t korlátozott területen és az információn termesztik

termesztéséről gyenge. A kiváló termésjellemzőkkel rendelkező és az éghajlati viszonyokhoz jobban alkalmazkodó Echinacea fajták használata elengedhetetlen a kiváló minőségű nyersanyagok megszerzéséhez. A gyógyszeriparban használt hatóanyagokat általában a föld feletti növényi részekből vonják ki. Ezen biológiailag aktív anyagok szempontjából a növények levelei és virágzatai nagyon fontosak az elemzéshez [12].

Számos gyógynövény nagy mennyiségben tartalmaz antioxidánsokat, kivéve a C-vitamint, az E-vitamint és a karotinoidokat [13]. Egyre nagyobb az érdeklődés a természetes antioxidánsok iránt, pl. polifenolok, fenilpropanoidok, flavonoidok és fenolsavak, amelyek megtalálhatók a gyógy- és étkezési növényekben, amelyek hozzájárulhatnak az oxidatív károsodások megelőzéséhez. A fenolok antioxidáns aktivitása elsősorban redox tulajdonságaiknak köszönhető, amelyek lehetővé teszik, hogy redukáló szerként vagy hidrogénatom donorként működjenek. Így a természetes antioxidánsok szabad gyökök megkötőjeként és láncmegszakítóként, prooxidáns fémionok komplexképzőjeként és szingulett oxigénképződés csillapítóiként működnek [14]. Az E. purpurea antioxidáns aktivitása a fenolsav, különösen a koffein- és a p-kumarinsav következménye. A gyógyászati és aromás növényfajokban található hasznos vegyületek nagy száma előfeltétele az ökológiai-biológiai kutatásoknak, amelyek célja a természetes antioxidánsok termesztése és új alkalmazási területek keresése.

Jelen tanulmány célja a hagyományos és biotechnológiai módszerekkel előállított E. purpurea növények morfológiai állapotának és antioxidáns aktivitásának értékelése és összehasonlítása volt.

2. Kísérleti eljárások

2.1. Protokoll az E. purpurea in vitro körülmények közötti szaporítására

Az E. purpurea in vitro szaporításának protokollját, szakaszait, tápközegét és a tenyésztési körülményeket röviden az 1. táblázat ismerteti.

2.1.1 Növényi anyag, sterilizálás és magcsírázás

Az E. purpurea magját a Suttons Consumer Products Ltd.-től (Woodview Road, Paignton, Devon TQ4 7NG, Anglia) vásároltuk, és két hétig 4 ° C-on rétegeztük. A felületi sterilizálást 70% (w/v) etanollal végeztük 2 percig, és 15% (w/v) kereskedelmi fehérítő oldatba mártottuk 10 percig. A sterilizált magokat háromszor mossuk steril desztillált vízben a fehérítő eltávolítása céljából. A magokat két alap Murashige és Skoog táptalajon [15] csíráztattuk 30 g L-1 szacharózzal, 6-benzilaminopurin BAP-vel (0,1 mg L1), NAA-val (0,1 mg L-1) és GA3-mal (0,2 vagy 0,4 mg) kiegészítve. L-1). 14 nap elteltével az összes palántát MS bazális táptalajon szubkultúráztuk BAP (0,5 mg L-1), GA3 (0,4 mg L-1) és aszkorbinsav (1,0 mg L-1) jelenlétében 21 alkalommal 21 alkalommal. nap a palánták stabil növényekké történő átalakítására.

2.1.2 A hajtások mikrotenyésztése és a növények gyökeresedése

A hajtások szaporodásához, növekedéséhez és fejlődéséhez kísérletet hajtottunk végre a citokinin BAP (0,5 vagy 1,0 mg L-1) alkalmazásával önmagában vagy auxin NAA-val (0,1 mg L-1) kombinálva MS táptalajban. Ezeket a kiegészítőket számos tesztelt növénynövekedés-szabályozó közül választották, mivel ezek voltak a legalkalmasabbak a hajtások kialakulásához [16]. A hajtásképződés gyakoriságát és a kifejlődött hajtások számát négy hetes inkubálás után határoztuk meg. A szubkultúrát négy hetes időközönként végeztük.

A gyökérindukcióhoz a hajtásokat öt félerősségű MS bazális táptalajon tenyésztettük; egy MSR0 gyökér tápközeg auxin nélkül (kontroll) és más MSR gyökér tápközeg NAA-val vagy IBA-val kiegészítve 0,1 vagy 0,5 mg L-1 koncentrációban. Az adatokat három hetes tenyésztés után rögzítettük, a gyökeres növények százalékos arányát és a gyökerek/hajtások átlagos számát meghatároztuk.

Az összes táptalaj pH-ját 5,8-ra állítottuk, és 0,7% (w/v) agarral megszilárdítottuk, majd autoklávban tartottuk 1,1 kg cm-2 nyomáson 20 percig. A palántákat és

Szakaszok Közepes Tenyésztési körülmények

Magcsírázás MSG1 + 0,1 mg L-1 BAP + 0,1 mg L-1 NAA + 0,2 mg L1 GA3 14 nap 22 ± 2 ° C-on, 16 órás fotoperiódus, 40 pmol m-2 s-1 fényerősség

A hajtások mikroszaporítása MSP2 + 1 mg L-1 BAP MSP4 +1 mg L-1 BAP + 0,1 mg L-1 NAA 28 napig 22 ± 2 ° C-on, 16 órás fotoperiódus, 40 pmol m-2 s-1 fényerősség

A növények gyökeresedése MSR3 + 0,1 mg L-1 IBA 21 nap 22 ± 2 ° C-on, 16 óra fényperiódus, 40 pmol m-2 s-1 fényerősség

A növények exklimatizációja Tőzeg: Perlit (2: 1 v/v) 21 nap 25 ± 1 ° C-on, 16 órás fotoperiódus, 50 pmol m-2 s-1 fényerősség

1. táblázat: Az E. purpurea in vitro körülmények közötti szaporításának protokollja.

MSG - csírázási közeg; MSP - szaporító közeg; MSR - gyökereztető közeg

a hajtáskultúrákat 22 ± 2 ° C hőmérsékleten tartottuk 16/8 óra (világos/sötét) fényperiódus alatt 40 | jmol m-2 s-1 fényerősség mellett a hűvös fehér fénycsövek által biztosított növekedési kamrában.

2.1.3. A növények exklimatizálása ex vitro körülmények között

A gyökeres növényeket kivették a tenyésztőcsövekből, és háromféle keveréket tartalmazó műanyag edényekbe (8 cm átmérőjűek) vitték át: 1) Tőzeg és perlit (2: 1 v/v); 2) Tőzeg, talaj és perlit (2: 1: 1 v/v) és 3) Tőzeg, kókuszrost és perlit (2: 1: 1 v/v). A növényeket 25 ± 1 ° C hőmérsékletre állítottuk, 50 pmol m-2 s-1 fényerősség mellett 16/8 órás fotoperiódust alkalmazva az akklimatizációhoz. A cserepes növényeket átlátszó polietilén membránnal borítottuk be a magas páratartalom biztosítása érdekében. A túlélési arányt három héttel az exklimatikus körülmények közötti akklimatizáció után regisztráltuk, és a növényeket további két hétig bevittük az üvegházba. A kapott növényeket ezután a szántóföldön átültették.

2.2. Az E. purpurea növények hagyományos szaporítása

a növény magasságának (cm), a talajonkénti talajszám, a növényenként a virágok számának, a fő kormányrúdon lévő virágok számának, a növényenként a virágok számának és a virág átmérőjének (cm) rögzítésére használtuk. Az antioxidáns aktivitás elemzéséhez a szántóföldi intenzíven virágzó növényekből gyűjtöttünk sugárvirágmintákat.

2.3 Antioxidáns kapacitás

A vízoldható és lipidoldható antioxidáns kapacitás spektrofotometriás meghatározását, aszkorbát és a-tokoferol ekvivalenseként kifejezve, foszfomolibdén komplex képződésével végeztük

[17]. A vizsgálat alapja a Mo (VI) minta (Mo) (V) redukciója volt a minta-analízissel és az azt követő savas foszfát/Mo (V) savas pH-n történő képződésével. 0,5 g növényi száraz anyagot mozsárral és habarccsal finom por alakúra őrölünk. 3 ml dH2O-t adunk hozzá, és a szuszpenziót homogenizáljuk, csövekbe visszük és 1 órán át szobahőmérsékleten, sötétben rázzuk. A szuszpenziót leszűrjük, és az extrakciót 3 ml dH2O-val megismételjük. A pulettát ismét 2 ml dH2O-val mostuk. A lipidben oldódó antioxidáns kapacitás (a-tokoferolban kifejezve) esetében az eljárás ugyanaz, kivéve, ha az extrakciót hexánnal, mint oldószerrel hajtják végre.

A módszert optimalizálták és jellemezték a linearitási intervallum, az ismétlődés és a reprodukálhatóság, valamint a moláris abszorpciós együtthatók vonatkozásában a vízoldható és lipidben oldódó antioxidáns kapacitások mennyiségi meghatározásához, aszkorbát és a-tokoferol ekvivalenseként kifejezve. [17]. Az abszorpciós együtthatók a következők voltak: (3,4 ± 0,1) x103 M-1 cm-1 aszkorbinsav esetében és (4,0 ± 0,1) x103 M-1 cm-1 a-tokoferol esetében.

Az összes antioxidáns kapacitást (szabad gyökök eltávolító aktivitását) a szabad stabil gyökök (difenil-pyril-hidrazil, DPPH ^) gátlásának lila színű metanolos oldatának fehérítésével mértük Tepe és mtsai.

[18]. A DPPH gyökök stabil gyökök, maximális abszorpcióval 517 nm-nél, amelyek antioxidánssal könnyen redukálódhatnak. A szabad gyök DPPH gátlását százalékban (I%) a következő módon számoltuk:

ahol A. „a kontroll reakció abszorbanciája

(a tesztvegyület kivételével minden reagenst tartalmaz). A minta a tesztvegyület abszorbanciája, azaz szúrt szőlőkivonatok.

A fenolok és flavonoidok száraz levelek mintáinak meghatározásához 1 g-ot őröltünk, és kimerítően extraháltunk 96% (v/v) metanollal. A fenolos vegyületek tartalmát spektrofotometriásan határoztuk meg Folin-Ciocalteu reagens alkalmazásával, és koffeinsav-ekvivalensként számoltuk [19]. A növényi szövetekben található flavonoidokat Zhishen és mtsai. [20] spektrofotometriás módszerrel, a katekin standard görbéjével.

2.4 Statisztikai elemzés

Minden kezeléshez húsz növényt növesztettünk, és az összes kísérletet kétszer megismételtük. Az adatokat egyirányú ANOVA varianciaanalízisnek vetettük alá az átlagok összehasonlítása céljából, és a szignifikáns különbségeket a Fisher LSD teszt alapján 5% -os szinten számítottuk statisztikai szoftvercsomaggal (Statigraphics Plus, 5.1-es verzió Windows-hoz). Az adatokat átlag ± standard hibaként jelentették.

3.1. Az E. purpurea mikrotenyésztése

Az E. purpurea mikrotenyésztésének kidolgozott, négy stádiumot tartalmazó protokollját az 1. táblázatban mutatjuk be az alábbiak szerint: 1) aszeptikus tenyészet megállapítása, 2) szaporodás, 3) Rhizogenezis és 4) akklimatizáció. A beavatási szakaszból kiderült, hogy a felületi sterilizálás sikeres volt a szennyezésmentes magcsírázás biztosításában. Az eredmények azt mutatták, hogy az MSG1 és MSG2 bazális táptalajon a mag csírázása átlagosan 70% -os, illetve 65% -os csírázási arányt eredményezett (2. táblázat, 1a. Ábra). Nyilvánvaló volt, hogy a BAP (0,2 mg L1), a GA3 (0,2 mg L-1) és az aszkorbinsav (1,0 mg L-1) megfelelő kombinációja használható az Echinacea növekedésének fokozására, különösen akkor, ha a palántákat stabil növényekké alakítják. Ebben az időszakban csak a hajtásszaporodás nélküli megnyúlást figyelték meg. A BAP alacsony koncentrációja GA3-mal és AA-val kombinálva pozitívan befolyásolta a hajtások növekedését és fejlődését.

A szaporítási szakaszban a BAP-tal (0,5 vagy 1,0 mg L-1) kiegészített MS táptalaj önmagában vagy alacsony NAA-szinttel (0,1 mg L-1) kombinálva elősegítette a hajtásképződést. Az MSP2 és az MSP4 táptalajon egyaránt magas szaporodási gyakoriságot és többszörös hajtások számát kaptuk (2. táblázat). Megállapították, hogy a BAP 1,0 mg L-1 koncentrációban megfelelő a hajtás indukciójához (1. b ábra). A BAP (1,0 mg L-1) és az alacsony NAA-szint (0,1 mg L-1) kölcsönhatása szintén jelentős hatást gyakorolt a hajtásszám-termelésre. A hajtások szaporodásának százaléka, valamint az egy explantánsra jutó hajtások száma sok átmenet során magas maradt.

Különböző típusú, különböző koncentrációjú auxinek hatását az E. purpurea rhyzogenesisre korábban leírtuk [16]. Ebben a vizsgálatban az IBA vagy NAA auxinok hozzáadása két koncentrációban félerősségű MS táptalajban járulékos gyökerek indukcióját eredményezte (2. táblázat). A gyökérképződést a hajtások bazális végétől a gyökeres közegbe történő átvitel után tíz nappal figyeltük meg. Az auxinok (IBA vagy NAA) jelenlétét félerősségű MS táptalajban hatékonyabbnak találták, mint a kontroll táptalajt az Echinacea növények gyökeresedéséhez. Így az IBA (0,1 mg L-1) elősegítette a gyökerek nagy számát, míg az NAA azonos koncentrációban hosszú gyökereket eredményezett (1c. És 1d. Ábra). A gyökeresedés gyakorisága három hét tenyésztés után elérte a maximumot.

Az in vitro növények ex vitro körülmények közötti akklimatizációjának ideje döntő lépés az új autotróf struktúrák kifejlesztésében, amelyek képesek megbirkózni a normális környezettel. Ebben az értelemben a cserepes szubsztrát egy

№ Növekedésszabályozók, mg L-1 BAP GA3 NAA IBA Magcsírázás,% Hajtásképződés,% Hajtásszám Explant-1 x ± SE Gyökeres növények,% Gyökérszám Plant-1 x ± SE

MSG1 0,1 0,2 0,1 70

MSG2 0,1 0,4 0,1 65

MSP1 0,5 50 3,3 ± 0,2

MSP2 1 85 9,8 ± 0,5

MSP3 0,5 0,1 75 5,7 ± 0,3

MSP4 1 0,1 90 16,2 ± 0,8

MSR0 0 0 35 0,9 ± 0,1

MSR1 0,1 75 2,1 ± 0,2

MSR2 0,5 40 1,5 ± 0,3

MSR3 0,1 100 5,5 ± 0,2

MSR4 0,5 80 3,6 ± 0,4

2. táblázat: Az E. purpurea mikro szaporításának eredményessége.

MSG - csírázási közeg; MSP - szaporító közeg; MSR - gyökereztető közeg

1. ábra: E. purpurea mikrotenyésztése: a) magcsírázás in vitro; b) hajtásszaporítás MS-en + 1,0 mg L-1 BAP; c) gyökeres növény MS-n + 0,1 mg L-1 IBA; d) gyökeres növény MS-n + 0,1 mg L-1 NAA; e) ex vitro akklimatizáció; f) szántóföldi növények (első év) és g) szántóföldi növények (második év).

fontos tényező az akklimatizáció szempontjából. Esetünkben a három vizsgált keverék jótékony hatással volt a növények túlélésére és a növények növekedésére, de a tőzeget és a perlitet találták a legmegfelelőbb keveréknek a keményedéshez, ami biztosítja a szaporított növények magasabb túlélési arányát (1% ábra). A sikeresen adaptált növényeket üvegházba helyezték át, ahol tovább nőnek és fejlődnek. Végül a mezőre ültették őket. Az in vitro növények túlélési aránya a terepen az üvegházban történő akklimatizáció után 90% volt. A fejlődés második évében morfológiailag azonosak voltak a növénymagasság és a virágzat színe szerint (1g. Ábra).

3.2. Az E. purpurea hagyományos szaporítása

Az eredmények azt mutatták, hogy a magok száraz, hideg rétegződése erősen stimulálta a csírázást. Az ugyanazon tápanyag-szubsztrátumon tenyésztett rétegzett és nem rétegzett magok között jelentős különbségeket tapasztaltunk a csírázási arányban. Így a vetőmagok csírázási aránya rétegződés nélkül 65% volt, míg a rétegzett vetőmagoké magasabb és elérte a 90% -ot. Arra a következtetésre jutottak, hogy a rétegződési folyamat növeli a mag csírázását. 12-14 nap múlva látható magcsírázást figyeltünk meg (2a. Ábra). A kis cserepekbe szúrás után a palánták normálisan fejlődtek (2b. Ábra), és 10 héten belül a növények készen álltak a kész állapotra

terepen átültetve. A növények a második évben virágoztak (2c. Ábra, d).

Morfológiai jellemzők Növények in vitro tenyésztésből x ± SE G1 Növények in vivo palántákból G2 G3 Átlag x ± SE

Növénymagasság, cm 65,4 ± 0,8a 54,8 75,2 107,6 79,2 ± 3,2b

Üzemenként permetezőgépek száma 16,0 ± 0,5b 12 6 7 8,3 ± 0,5a

Fő kormányrúd-levél területe, cm2 50,0 ± 1,8a 50 66 78 64,7 ± 3,1b

Virágszám a fő kormányon 6,0 ± 0,5b 4 3 5 4,0 ± 0,4a

Virágszám növényenként 20,0 ± 0,6b 15 18 14 15,7 ± 0,4a

Virágzatátmérő, cm 7,5 ± 0,2a 6,5 8 9 7,8 ± 0,2a

3. táblázat: Az in vitro tenyésztésből és az iktatott tenyészben termesztett in vivo palántákból származó E. purpurea növények morfológiai jellemzői.

Minden kezeléshez húsz növényt választottak ki. Az adatokat átlag ± standard hibaként jelentették. A különböző betűk szignifikáns különbségeket jeleznek a Fisher LSD teszt segítségével (P