Az inzulin csökkentése a feltételes részleges géneltávolítással felnőtteknél megfordítja az étrend által kiváltott súlygyarapodást

Sejt- és Élettani Tudományok Tanszék, Cukorbetegség Kutatócsoport, Élettudományi Intézet, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Kanada

Institute of Sciences de la Vie, Universite Catholique de Louvain, Louvain-la-Neuve, Belgium

Sejt- és Élettani Tudományok Tanszék, Cukorbetegség Kutatócsoport, Élettudományi Intézet, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Kanada

Sejt- és Élettani Tudományok Tanszék, Cukorbetegség Kutatócsoport, Élettudományi Intézet, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Kanada

Gyógyszerésztudományok, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada

Sejt- és Élettani Tudományok Tanszék, Cukorbetegség Kutatócsoport, Élettudományi Intézet, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Kanada

Sejt- és Élettani Tudományok Tanszék, Cukorbetegség Kutatócsoport, Élettudományi Intézet, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Kanada

Sejt- és Élettani Tudományok Tanszék, Cukorbetegség Kutatócsoport, Élettudományi Intézet, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Kanada

Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l & Universite de Montreal (CRCHUM), Montreali Egyetem, Montreal, QC, Kanada

Sejt- és Élettani Tudományok Tanszék, Cukorbetegség Kutatócsoport, Élettudományi Intézet, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Kanada

Gyógyszerésztudományok, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada

Gyógyszerésztudományok, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada

Gyógyszerésztudományok, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada

Gyógyszerésztudományok, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada

Sejt- és Élettani Tanszék, Cukorbetegség Kutatócsoport, Élettudományi Intézet, British Columbia Egyetem, Vancouver, British Columbia, Kanada

Levelezés: British Columbia Egyetem, Vancouver, BC V6T 1Z3, Kanada. E-mail: [email protected] További cikkek keresése a szerzőtől

Sejt- és Élettani Tudományok Tanszék, Cukorbetegség Kutatócsoport, Élettudományi Intézet, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Kanada

Institute of Sciences de la Vie, Universite Catholique de Louvain, Louvain-la-Neuve, Belgium

Sejt- és Élettani Tanszék, Cukorbetegség Kutatócsoport, Élettudományi Intézet, British Columbia Egyetem, Vancouver, British Columbia, Kanada

Sejt- és Élettani Tudományok Tanszék, Cukorbetegség Kutatócsoport, Élettudományi Intézet, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Kanada

Gyógyszerésztudományok, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada

Sejt- és Élettani Tudományok Tanszék, Cukorbetegség Kutatócsoport, Élettudományi Intézet, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Kanada

Sejt- és Élettani Tudományok Tanszék, Cukorbetegség Kutatócsoport, Élettudományi Intézet, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Kanada

Sejt- és Élettani Tudományok Tanszék, Cukorbetegség Kutatócsoport, Élettudományi Intézet, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Kanada

Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l & Universite de Montreal (CRCHUM), Montreali Egyetem, Montreal, QC, Kanada

Sejt- és Élettani Tanszék, Cukorbetegség Kutatócsoport, Élettudományi Intézet, British Columbia Egyetem, Vancouver, British Columbia, Kanada

Gyógyszerésztudományok, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada

Gyógyszerésztudományok, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada

Gyógyszerésztudományok, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada

Gyógyszerésztudományok, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada

Sejt- és Élettani Tanszék, Cukorbetegség Kutatócsoport, Élettudományi Intézet, British Columbia Egyetem, Vancouver, British Columbia, Kanada

Levelezés: British Columbia Egyetem, Vancouver, BC V6T 1Z3, Kanada. E-mail: [email protected] További cikkek keresése a szerzőtől

Absztrakt

RÖVIDÍTÉSEK:

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Állatok és in vivo fiziológia

Fluoreszcens mikroszkópia

A PBS-perfundált egerekből származó Pancreata-t összegyűjtöttük, és 4% paraformaldehidben rögzítettük 24 órán át, mostuk és 70% -os etanolban tároltuk, mielőtt a paraffinba ágyazódtunk volna. A metszeteket (5 μm) a hasnyálmirigy legalább 3 különböző régiójából vettük, egymástól 100 μm-re. A metszeteket paraffinmentesítettük, csökkenő koncentrációjú etanollal hidratáltuk és PBS-ben öblítettük, majd 15 percig hőindukált epitóp-visszanyerésnek tettük ki őket 95 ° C-on 10 mM citrátpufferrel (pH 6,0). A metszeteket blokkoltuk és primer anti-inzulinnal (ab7842; Abcam, Cambridge, MA, USA) és zöldellenes fluoreszcens fehérjével (GFP) (A11122; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) inkubáltuk egy éjszakán át nedves kamrában 4 ° C-on. ° C. Az elsődleges antitesteket az AlexaFluor 488, 555, 594 vagy 647-hez konjugált szekunder antitestekkel történő inkubálás után szemléltettük, szükség szerint (1: 1000; Thermo Fisher Scientific). Az ivarsejteket és a perirenalis zsírszöveteket 4 órán át táplálatlanul hagyott egerekből gyűjtöttük, és a szöveteket 4% paraformaldehidben rögzítettük. Az adipocita méretét 5 μm vastag metszetekben perilipin festésével mértük (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Az összes kép ImageXpress micro készüléken készült, × 10 magas (NA 0,3) objektívvel.

Immunblot elemzések és fehérje detektálás

Western blot-analízisekben 30-40 μg fehérjét alkalmaztunk az I polimeráz és a transzkriptum felszabadulási faktor szondázására (PTRF; ab48824; Abcam); a foszfo-caveolin ‐ 1 (3251) és az összes caveolin ‐ 1 (3267, klatrrin (4796), inzulinreceptor (3020), a foszfohormon-érzékeny lipáz (Hsl; 4139) és az összes Hsl (4107) aránya foszfo-Akt (4060) és teljes Akt (9272), valamint a foszfo-p44/42 MAPK (4370) és az összes p44/42 MAPK (4695; mind a Cell Signaling Technology cégtől) és a lipoprotein lipáz (Lpl; sc-32885) aránya; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) egyik napról a másikra táplálék nélküli egerek ivarmirigyében, 15 perc inzulinstimuláció (2 U/testtömeg-kg) alatt. Actin (NB600-501; Novusbio, Littleton, CO (USA) és vinculint (13901; Cell Signaling Technology) használtunk betöltési referenciaként.

Sziget szigetelése, tenyésztése és perifúziója

A hasnyálmirigy-szigeteket kollagenáz, szűrés és kézi szedés alkalmazásával izoláltuk (18). A szigeteket egy éjszakán át (37 ° C, 5% CO2) tenyésztettük RPMI 1640 táptalajban (Thermo Fisher Scientific) 11 mM glükózzal (Millipore-Sigma), 100 U/ml penicillinnel, 100 μg/ml sztreptomicinnel (Thermo Fisher Scientific) és 10% szarvasmarha magzati szérum (Thermo Fisher Scientific). In vitro az inzulin szekréciót perifúzióval és radioimmun vizsgálattal mértük (19).

RNS izolálás, valós idejű kvantitatív PCR és transzkriptóm elemzés

Mikrokomputertomográfia és kettős energiájú röntgensugaras abszorpciós módszer

A vizsgálatokat TriFoil Micro-Computed Tomography (CT) szkennerrel (Northridge Tri-Modality Imaging, Inc., Chatsworth, CA, USA) végeztük a következő beállításokkal: felbontás, 50 μm; beolvasási idő,

4 perc. Minden egeret 1 héttel korábban, majd 5 hét múlva átvizsgáltak a tamoxifen injekciók után. Az egereket a szkenner hátán egyenes gerinccel, a gerinc és a combcsont között legalább 90 ° -os szöggel helyezték el, amit egy cserkészvizsgálat is megerősített. Az állatokat érzéstelenítés közben (O2 1,0 l/perc; 5% izoflurán) pásztáztuk. A beolvasott képek elemzését az Amira 6.0.1 szoftverrel (FEI, Hillsboro, OR, USA) végeztük. Az első, a medencét mutató transzszekciós pásztázást minden egér referencia pásztázásaként beállítottuk. A hasfal belső rétegeit alkalmaztuk a zsigeri és a szubkután zsírraktár térfogatának megkülönböztetésére (μm 3). Meghatároztuk a sovány tömeget in vivo kettős energiájú röntgenabszorpciós módszerrel (Lunar Piximus; már nem gyártják) a denzitométert 5-7 hét egerekben tamoxifen után (15 kontroll és 12 kísérleti egérből).

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± ± félértékben fejezzük ki, hacsak másként nem jelezzük. Az eredményeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük a P

Eredmények és vita

Indukálható, részleges Ins2 gén deléció mint kísérleti modell az inzulintermelés csökkentésére

A hiperinsulinémia elhízásra és súlycsökkenésre gyakorolt ​​tartós hatásainak közvetlen értékeléséhez létrehoztunk egy egérmodellt, amelyben az inzulin gén dózisát csökkenteni lehet egy indukálható Cre-loxP rendszer használatával (Ábra. 1A). 6 hetes korukban az egereket három diéta egyikével etették; alacsony zsírtartalmú (10%), mérsékelt zsírtartalmú (25%) vagy magas zsírtartalmú (58%). Miután 12 hétig elfogyasztotta ezeket a diétákat, az alomtárs ellenőrzése (Ins1 -/-: Ins2 f /+: mTmG) és kísérleti (Ins1 -/-: Ins2 f/+: Pdx1Cre ERT: mTmG) hím egereket intraperitoneálisan injektáltunk tamoxifennel, ami szinte teljes rekombinációt eredményezett ezen a genetikai háttéren (1. ábraB) (20).

feltételes

Indukálható részleges veszteség Ins2 nem befolyásolja a mérsékelt vagy alacsony zsírtartalmú étrendet fogyasztó egerek súlyát

A Ins2 a közepes zsírtartalmú étrenddel táplált kísérleti egerekben a gén dózisa nem befolyásolta szignifikánsan a szigetek inzulinszintjét (1. ábraC), és ez a manipuláció sem vezetett statisztikailag szignifikáns változáshoz az inzulin keringésében kísérleti egerekben a vizsgálat során (1. ábraD). Ezekkel a megállapításokkal összhangban a kísérleti egerekben a glükóz tolerancia, az inzulinérzékenység és a glükóz által stimulált inzulin szekréció nem károsodott, összehasonlítva a kontroll alomtársakkal ebben az étrendben (1. ábraPÉLDÁUL). Csökkentése Ins2 a hím egerek géndózisa nem befolyásolta a közepes zsírtartalmú étrendet fogyasztó egerek testtömegét (1. ábraH). Hasonlóképpen a testtömeg változatlan volt a test csökkentése után Ins2 géndózis alacsony zsírtartalmú étrendet tápláló kísérleti egerekben (1. ábraén). Ezek az eredmények összhangban vannak más genetikai manipulációk korábbi bizonyítékaival, amelyek nem befolyásolják az alacsony vagy közepes zsírtartalmú étrendet tápláló egerek testtömegét (21).

Az indukálható Ins2 génredukció szerényen csökkenti a szigetecske inzulin szekrécióját HFD-vel táplált egerekben

Az indukálható inzulincsökkentés súlyvesztést okoz a HFD-vel táplált egerekben

Annak a hipotézisünknek a tesztelésére, hogy az elhízás visszafordítható az inzulin akut elnyomásával, megvizsgáltuk a HFD-vel táplált kontroll alomtársak és a kísérleti egerek testtömegét 5 héttel a tamoxifen injekciók után. Egy kísérleti tanulmány során azt tapasztaltuk, hogy a tamoxifen injekció a testtömeg enyhe csökkenését eredményezte a hordozóval kezelt egerekéhez képest (S1. Kiegészítő ábra). Konzervatív jellegűnek éreztük a legmegfelelőbbnek az egerek csoportjainak összehasonlítását, amelyekbe mind tamoxifent injektáltunk. Ezt a konzervatív megközelítést alkalmazva azt tapasztaltuk, hogy a Ins2 gén dózist eredményezett

A lipid mobilizáció markerei megváltoznak az indukált inzulin redukció után

Az indukálható inzulin redukció az immunprofil megváltozásával jár a zsírszövetben

Gén funkció FDR
Vér mikrorészecske 4.24E - 09
Lipid transzporter aktivitás 1.73E - 02
Lipidszállítás 2.62E - 02
Szteroidkötés 2.62E - 02
Trigliceridekben gazdag lipoprotein részecske 4.78E - 02
Nagyon alacsony sűrűségű lipoproteinek részecske 4.78E - 02
Semleges lipid anyagcsere folyamat 6.20E - 02
Válasz vírusra 6.20E - 02
Extracelluláris mátrix 6.20E - 02
Ciklin-függő protein-kináz-holoenzim-komplex 6.20E - 02
Acilglicerin metabolikus folyamat 6.20E - 02
Lipid lokalizáció 6.20E - 02
Plazma lipoprotein részecske 6.51E - 02
Foszfolipidkötés 6.97E - 02
Fehérje – lipid komplex 7.08E - 02
Bélfelszívódás 7.74E - 02
Adenililtrasnferáz aktivitás 7.74E - 02
A lipoprotein részecskereceptor kötődése 8.96E - 02

Adataink az első molekuláris genetikai bizonyítékot szolgáltatják arra, hogy az elhízás visszafordítható önmagában az inzulintermelés akut és szerény csökkentésével. Ennek a kezelési tanulmánynak az eredményei, a korábbi prevenciós vizsgálatainkkal (11, 12) kombinálva, egyértelműen bemutatják az elhízás okozati okozati kontrollját hiperinzulinémia révén egy genetikailag kezelhető emlős rendszerben. A jelenlegi vizsgálatunkban elért inzulin gén dózis csökkentésének nagysága (

30%) nem okoz változásokat a glükóz homeosztázisban, és megelőző intézkedésként vagy súlycsökkentő stratégiaként elérhető az emberi populációkban. Például az időszakos és folyamatos energia-korlátozás egy 6 hónapos időszak alatt hasonló csökkenést eredményezett a keringő inzulinban elhízott betegeknél, 5-10% -os testsúlycsökkenéssel párosulva (48). Bár az ilyen étrendi korlátozási beavatkozások gyakran a magas lemorzsolódási arányokkal járnak (49), a napi fruktóz bevitel izokalorikus 28 és 10% közötti korlátozása alternatív megközelítés, amely mérsékelheti a magas lemorzsolódási arányokat, és sikeresen bebizonyosodott, hogy hasonló csökkenést ér el a keringő inzulin és súlycsökkenés elhízott serdülőknél (50). Vizsgálatunkban a súlycsökkenés nagysága összefüggésbe hozható a szív- és érrendszeri betegségekkel összefüggő kockázati tényezők javulásával, valamint a 2-es típusú cukorbetegség kialakulásának kockázatának több mint 50% -os csökkenésével (51).

KÖVETKEZTETÉSEK

Eredményeink mélyen kihatnak a táplálkozási irányelvekre, valamint az elhízás és társbetegségei leküzdésére irányuló terápiás erőfeszítésekre. Megállapításaink alátámasztják azt a koncepciót, miszerint az egyén hiperinzulinémia státusza kell, hogy legyen a cél az életmód-módosítások, a makrotápanyagok étrendi összetétele és a gyógyszerek fejlesztése szempontjából a fogyás céljából. Az egyénre szabott táplálkozási válaszok értékelése (52) és mechanikusan meghatározott tanulmányok hasznosak lehetnek a személyre szabott táplálkozási stratégiák kialakításához. Az inzulinszint fiziológiailag moduláló megközelítései a fogyáson túl terápiás haszonnal is járhatnak, ideértve az inzulinérzékenység javítását, és talán még a hosszú élettartamot is (53).

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

A szerzők köszönetet mondanak Farnaz Taghizadeh-nak és Xiaoke (Betty) Hu-nak [mindketten a British Columbia Egyetemmel (UBC)] a szigetek elkülönítésében, a perifúzióban és az állatmunkában nyújtott segítségért; az RNS szekvenáláshoz szükséges UBC szekvenáló és bioinformatikai konzorcium; az UBC nagy áteresztőképességű fenogenomikai központja a mikro-CT képalkotáshoz; John Schipilow és Dr. Nancy Ford (UBC) technikai támogatásért és segítségért. A központot a Kanadai Innovációs Alapítvány, a British Columbia Tudásfejlesztési Alapítvány és az UBC Fogorvostudományi Kar támogatja. Pénzügyi támogatást a kanadai egészségügyi kutatóintézetek működési támogatása nyújtott; Kanadai Diabetes Szövetség posztdoktori ösztöndíjak (M.M.P. és M.S.); Kanadai Diabetes Szövetség Doktorandusz Kutatási Díj (A.P.C.-nek); egy Benzon Alapítványi ösztöndíj (S.S.-nek); valamint a Juvenile Diabetes Research Foundation és a Michael Smith Foundation for Health Research Postdoctoral Fellowship Awards (G.E.L.-nek). A szerzők nem jelentenek összeférhetetlenséget.

A SZERZŐ HOZZÁJÁRULÁSAI

M. M. Page kísérleteket tervezett és hajtott végre, elemezte az eredményeket és megírta a kéziratot; S. Skovsø mikro-CT vizsgálatokat és elemzéseket végzett; H. Cen, A. P. Chiu és G. E. Lim Western-blot elemzéseket végeztek; D. A. Dionne és D. F. Hutchinson kísérleteket hajtott végre; M. Szabat képalkotó kísérleteket és elemzéseket végzett; S. Flibotte RNS szekvenálási elemzést végzett; S. Sinha RNS szekvenálást végzett; és J. D. Johnson kísérleteket tervezett, elemezte az eredményeket, szerkesztette a kéziratot, és garancia erre a munkára; és az összes többi szerző áttekintette és szerkesztette a kéziratot.

Fájlnév Leírás
fsb2fj201700518r-sup-0001.docxapplication/docx, 71 KB Kiegészítő anyag

Kérjük, vegye figyelembe: A kiadó nem felelős a szerzők által szolgáltatott bármilyen kiegészítő információ tartalmáért vagy működéséért. Bármilyen kérdést (a hiányzó tartalom kivételével) a cikk megfelelő szerzőjéhez kell irányítani.