Az oxidáló kálium-permanganát hatása a kopoltyúk metallotionein mRNS expressziójára és kapcsolata a szubletális egész állati végpontokkal a csatorna harcsa során

Daniel Schlenk, William C. Colley, Abir El-Alfy, Richard Kirby, Billy R. Griffin, Az Oxidáns kálium-permanganát hatása a kopoltyú metallotionein mRNS expressziójára és kapcsolata a szublethális egész állati végpontokkal a Csatorna Harcsában, Toxikológiai Tudományok, kötet 54. szám, 2000. március 1., 177–182. Oldal, https://doi.org/10.1093/toxsci/54.1.177

Absztrakt

A PM-ből származó permanganát-ion, MnO4 –2 erős oxidálószer, és a PM-t általános biocidként alkalmazzák 4 mg/l-ig ajánlott koncentrációban, különböző akvakultúra-környezetben. Vízi növények, akváriumok, versenyutak, tavak és vízellátók halkeltetőiben fertőtlenítőszerként is használják; halparaziták eltávolítására; a betegségek csökkentése vagy megelőzése, különösen a halak sebén; halmérgezők, például rotenon és antimycin méregtelenítésére; gomba és algák elleni védekezésre; valamint az átmeneti oxigénhiányos problémák orvoslására a tavak tenyésztésében (Duncan, 1978; Tucker, 1984). A PM toxicitása nyilvánvalóan a kopoltyúkat célozza meg, mivel az ozmoregulációs funkció megszakadását figyelték meg a lazac sós vízbe költözésében a PM kezelés után (Brouck és Johnson 1979). Mivel az MnO4 2 erős oxidálószer, a toxicitás mechanizmusa oxidatív stressz útján közvetíthető, ami akkor következhet be, ha a mangán (Mn) jelentős koncentrációja felszívódik a sejtbe. A halsejtekben az oxidatív stressz elleni védekezés egyik lehetséges mechanizmusa a szulfhidrilt tartalmazó polipeptid metallotionein (MT) indukciója (Waalkes és Klaassen 1985).

A metallotioneinok (MT) kis molekulatömegű fehérjék, amelyek számos organizmusban védelmet nyújtanak a fém toxicitása és az oxidatív stressz ellen (Kagi és Schaffer 1988). Jóllehet a filogenitás során erős szerkezeti homológiával rendelkezik, úgy tűnik, hogy jelentős különbségek vannak az MT expressziójában a fajok között, különösen a halfajokban (Olsson 1993, 1996). Az MT szabályozásának mechanizmusait feltáró legújabb tanulmányok a válaszelemek különbségeit jelezték, amelyek fontosak az MT gének transzkripciójának elindításában (Kille et al., 1991). A csatornás harcsa (Ictalurus punctatus) meglehetősen ellenálló számos vegyi anyaggal szemben, beleértve számos szerves növényvédőszert és fémet (Perkins és Schlenk, sajtóban; Zhang és Schlenk, 1995). Korábbi vizsgálatok a glutation és az antioxidáns enzimek viszonylag nagy intracelluláris koncentrációit jelezték (Hasspieler és mtsai, 1994). Kevéssé ismert azonban az MT szerepe a csatorna harcsa oxidatívan aktív vegyi anyagokkal szembeni ellenálló képességében.

Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a máj MT expresszióját számos fém indukálja a csatornaharcsában, beleértve a kadmiumot (Zhang és Schlenk 1995), a rézet (Perkins et al., 1996), a cinket (Schlenk et al., 1997a) és az arzént (Schlenk et a). al., 1997b). Bár kimutatták, hogy az Mn in vivo máj MT-t indukál rágcsálókban (Waalkes és Klaassen 1985), nyilvánvalóan közvetett mechanizmus révén teszi ezt, mivel az izolált hepatociták MT-szintjét az Mn-kezelés valóban csökkentette a sejtek életképességének változása nélkül (Bracken és munkatársai). Klaassen 1987).

Az MT expresszió mérhető a fehérje szintjén (Schlenk és mtsai., 1997b), valamint az mRNS szintjén (Schlenk és mtsai., 1997a; Zhang és Schlenk, 1995). A közelmúltban kvantitatív reverz-transzkriptáz-polimeráz láncreakciót (RT-PCR) alkalmaztak az MT mRNS expressziójának mérésére több fémnek kitett csatornaharcsában (Schlenk et al., 1997a). Sajnos az amplikon pontos nukleotidszekvenciáját ezen vizsgálatok egyikében sem sikerült azonosítani. Így ennek a vizsgálatnak az volt a célja, hogy klónozzon és szekvenáljon egy korábban azonosított, több fém által indukált, RT-PCR-rel nyert cDNS-t, valamint meghatározza a transzkriptum expressziója és a szubletális egész állati végpont expresszióját, jelezve a toxicitást a csatornaharcsában.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Csatornaharcsákat állítottak elő a vizsgálathoz, az előzőekben leírtak szerint (Griffin et al., 1999). A halakat beltéri, átfolyó tartályokban nevelték kútvízzel, hogy elkerüljék a mangánt tartalmazó földtavakban való kitettséget. A halak számára elérhető egyetlen mangánforrás, a vizsgálat során hozzáadottakon kívül, a táplálék- és vízellátás volt. A víz minőségi jellemzői a vizsgálat során a következők voltak: hőmérséklet 21,5 ± 0,5 ° C; pH = 7,6 ± 0,2; oxigén 7,7 ± 0,2 mg/l; lúgosság 184 ± 3 mg/l (CaCO3-ban); összes ammónia 0,91 ± 0,04 mg/l; és egyesített ammónia 0,03 ± 0,01 mg/l.

A halaknak napi harcsatakarmányt kínáltak a testtömeg 2% -ával, és az el nem fogyasztott takarmányt 1 órán belül eltávolították. A felhasznált takarmány mangántartalma 231 ± 18 mg/kg volt (n = 7 vizsgált minta). A tanulmányhoz használt technikai minőségű kálium-permanganátot a Carus Chemical Company (Ottawa, IL) biztosította; a tisztaságot 97% -ra értékelték.

Hat harcsát (3 hímet és 3 nőstényt) vettünk ki minden csoportból mintavétel céljából a mangán-expozíció megkezdése előtt, és két hetes időközönként a vizsgálat végéig. A nemet a külső nemi szervek szemrevételezéses vizsgálatával határoztuk meg. A halakat a fejbe mért ütés megdöbbentette, a gerincvelőt pedig az első nyaki csigolyánál levágták. Az egyes halakból kopoltyúkat gyűjtöttünk, külön-külön mangánmentes mintatartókba csomagoltuk, indexeltük, és –MC mRNS elemzéséig –85 ° C-on tároltuk. A testtömeg, a testhossz, a májtömeg, az állapotfaktor ((testtömeg (testtömeg (testtömeg) × 100/ttkg 3) és az LSI (májtömeg/[testtömeg/testtömeg [májhósúly])) mérését a szubletális toxicitás mértékeként rögzítettük.

Az RT-PCR vizsgálatokhoz 100–155 g tömegű fiatalkorú csatornás harcsákat (6 hónapos) intraperitoneálisan 10 mg/kg kadmium-kloriddal injektáltunk, amint azt korábban leírtuk (Schlenk et al., 1997a). 24 óra múlva az állatokat eutanizáljuk, majd a májat boncoljuk. Mindegyik szövetet folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, és –80 ° C-on tároltuk, amíg RNS-re feldolgoztuk.

RNS izolálás és Northern Blotting

A teljes RNS-t körülbelül 100 mg hal-kopoltyúból extraháltuk Tri reagenssel (Molecular Research Center, Inc., Cincinnnati, OH). A végső RNS-pelletet feloldottuk DEPC-vel kezelt vízben, és a koncentrációt Hitachi U-2000 spektrofotométerrel mértük 260 nm-en. Az RNS integritását agarózgél-elektroforézissel ellenőriztük 28S, 18S és 5.8S riboszomális és transzfer RNS sávok megfigyelésével. A Northern-blotot korábban leírt standard eljárások alkalmazásával hajtottuk végre (Schlenk et al., 1997a, b; Zhang és Schlenk, 1995). A sávokat kvantitatívan meghatároztuk denzitometriával, NIH Image szoftverrel (1.61 verzió).

RT-PCR

A cDNS szintézisét az 1. szálú cDNS szintézis készlet (Boehringer Manheim, Indianopolis, IN) alkalmazásával hajtottuk végre, amint azt korábban leírtuk (Schlenk és mtsai., 1997a). Az első szál cDNS szintézisének megkezdéséhez a RACE-T primert (5`-CCGAA TTCTC GAGAT CGATT TTTTT TTTTT TT-3`) használtuk. PCR-amplifikációhoz a RACE primer (5'CCGAA TTCTC GAGAT CGA-3`) és egy degenerált, univerzális MT-primer (5`-ATGGA TCCNT GCGAA TG-3`), a piscine MT gének 6 N-terminális kodonja alapján ( Chan 1994). A primereket a National Biosciences, Inc.-től (Plymouth MN) szereztük be. Az RT-reakcióhoz 1,0 μg RNS-t használtunk 50 μl teljes reakciótérfogatban, amely 1x reakciópuffert, 5 mM MgCl2-t, 1 mM DNTP-keveréket, 50 egység RNáz-gátlót, 20 egység AMV reverz transzkriptázt és 10 ng-ot tartalmaz. RACE-T primer. A reakcióelegyet 1 órán át 42 ° C-on inkubáltuk, majd 150 μl vízzel hígítottuk 200 μl teljes térfogatra.

A PCR-mesterkeverék 2,5 egység Taq DNS-polimerázt tartalmazott 20 mM Tris-HCl-ben, 100 mM KCl-ban, 3 mM MgCl2-ban, 0,01% Brij r 35 (v/v), dNTP-keverékben (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), mindegyik 0,4 mM, pH 8,3 (20 ° C) 50 μl végtérfogatban. A fentiek szerint a metallotionein expressziójára specifikus láncindítókat használtunk. A PCR-t 25 cikluson keresztül hajtottuk végre, 3 3 94 ° C-os szegmensből 1 percig; 50 ° C-on 2 percig; és 72 ° C-on 3 percig, majd végső meghosszabbítással 70 ° C-on 5 percig. A hőmérséklet-beállításokat, a ciklusszámot és az RNS-tartalmat kalibráltuk és optimalizáltuk a korábban leírtak szerint (Schlenk et al., 1997a).

Klónozás és szekvenálás

RT-PCR termékeket izoláltunk agaróz gélekből Millipore DNS extrakciós készletekkel (Millipore, Bedford, MA), és klónoztuk a TA klónozó rendszer pCR-2.1 vektorába (Invitrogen, Carlsbad, CA). A plazmid DNS-t 10 kapott baktériumtelepből állítottuk elő Qiagen Plasmid Mini-prep kit segítségével (Qiagen, Valencia, Kalifornia). Megfelelő méretű inszertek jelenlétét restrikciós enzimek emésztésével igazoltuk EcoRI-vel (Promega, Madison WI). Hat egymástól függetlenül izolált klónt szekvenáltunk Themo Sequenase fluoreszcensen jelölt primer ciklus szekvenáló készlet (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway NJ) és IRD 700 T7 vagy IRD 800 jelzett M13 reverz szekvenáló primerek (LI-COR, Inc., Lincoln) alkalmazásával. NE). A szekvenálási reakciókat LI-COR 4200-L2 Sequencer készüléken (LI-COR Inc.) futtattuk, és az így kapott képeket a gyártó szoftverével elemeztük.

A nukleotidszekvenciát koncepcionálisan lefordították az ORF Finder program segítségével, amelyet a Nemzeti Biotechnológiai Információs Központ (NCBI) weboldala (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) tart fenn, és a feltételezett ORF egy 60 aminosav fehérjét kódol. a harcsát képviselő MT-t azonosították. A nukleotid- és aminosavszekvenciákat BLAST-kutatásnak vetették alá az NCBI webhelyén, hogy azonosítsák a korábban klónozott, rokon géneket és fehérjéket. Az MT származtatott aminosavszekvenciáit összehasonlítottuk egy maximális parsimony fával, amelyet egy elágazás és sáv keresési algoritmussal készítettünk PAUP (3.1) szoftverrel (Champaign, IL).

Statisztika

A csoportok közötti különbségeket egyutas ANOVA-val (α = 0,05) határoztuk meg, majd a szignifikancia szempontjából a Student-Newman-Kuels tesztet vagy Bonferroni Multiple tartományát. Az idő- és dózisfüggő különbségeket egyidejűleg értékelték kétutas ANOVA-val (Statview 5.1). A korrelációs elemzést egyszerű lineáris korrelációval hajtottuk végre (α = 0,05).

EREDMÉNYEK

Kadmiummal kezelt csatornás harcsa májból 464 bp RT-PCR terméket nyertünk, amely 180 bp nyitott leolvasási keretet tartalmaz (1. ábra). A nyitott leolvasási keret egy 60 aminosavú peptidet kódolt, amelyet a poliadenilezési helyet megelőző, lefelé irányuló szekvencia 269 bp szakasza követett. Az előre diktált 60 aminosav-szekvencia 21 cisztein-maradékot tartalmazott klasszikus C-X-C és CC-XX-CC motívumban. Csak egyetlen metionin, hisztidin és aromás aminosavmaradék nem volt. A harcsa MT levezetett aminosav-szekvenciája leginkább a stoneloach MT-hez volt hasonló (86,7%), és legkevésbé hasonlított a tilápiához (78,3%) (2. ábra). Az ORF nukleotid szekvenciák összehasonlítása a teleost halak között azt is kimutatta, hogy a stoneloach szekvencia homológiája a harcsával volt a legtöbb (80,5%). A legkevésbé homológ ORF nukleotidszekvencia az A pisztráng volt, homológiája 76,7% és 42 szubsztitúció volt. A harcsa MT ORF egyedi nukleotidjai közé tartoztak az 57., 76., 79., 135., 141., 156., 157. és 173. életkorban levők.

Az MT cDNS szekvenálása után ezt követően próbaként használtuk az MT mRNS expressziójának mérésére az Mn-vel kezelt állatok kopoltyúiban. Az Mn kezelést követően a 2,0 mg/l koncentrációjú kezelés során 8 hétig nem figyeltek meg szignifikáns változásokat a kopoltyú MT mRNS expressziójában (3. és 4. ábra). Ezenkívül nem figyeltünk meg szignifikáns összefüggést a kopoltyúban lévő MT mRNS-expresszió és a növekedés, a hossz, az LSI vagy a CI között (az adatokat nem mutatjuk be).

A kezelési csoportok egyikében sem figyeltek meg mortalitást a Mn-expozíció 8 hete alatt. Bár jelentős súlycsökkenést figyeltek meg a 0,5 mg/l PM-vel kezelt hímeknél 2 hét és 4 hét elteltével, a súlyok visszatértek a kontrollértékekhez, és nem függtek össze a dózissal (az adatokat nem közöltük). A kezelés után nem figyeltek meg szignifikáns különbségeket vagy hosszúsági trendeket (az adatokat nem közöltük).

A kezelés jelentősen befolyásolta a máj szomatikus (LSI) és az állapotindexeket (CI). A hím CI szignifikánsan csökkent 4, 6 és 8 hetes 2,0 mg/l PM-kezelés után (5. ábra). A csökkenés azonban nem volt összefüggésben az expozíció idejével, mivel nem figyeltek meg szignifikáns különbségeket a CI-ben a 4., 6. és 8. héten mintát vett állatok között. Az LSI 6 hét után minden dózisban csökkent a nőknél, de ezután 8 héttel helyreállt (6. ábra). Hasonló tendenciát figyeltek meg a hímeknél is, ahol az LSI csökkenését 4 hét után figyelték meg, majd 6 hét után visszaálltak a kontrollszintre, kivéve az 1,0 mg/l-es állatokat, ahol az LSI kevesebb volt, mint a kontrollok 8 hét után (7. ábra).

VITA

Mivel a PM erős oxidálószer, a halakra gyakorolt feltételezett toxicitás a bőrt vagy a kopoltyút káros hatással közvetítené (Brouck és Johnson, 1979). A kopoltyú szubletális károsodásának felmérése érdekében a metallotionein stresszfehérje expresszióját PM-nek kitett állatokból nyert kopoltyúkban vizsgálták. Rágcsálókban az Mn injekció a máj MT jelentős indukcióját okozta (Waalkes és Klaassen, 1985), amelyet nem az Mn kötődése a fém szabályozó transzkripciós faktorokhoz okoz (Bracken és Klaassen 1987). Harcsában azonban nem észleltek szignifikáns növekedést a kopoltyú MT mRNS-ben a PM-hez való 8 hetes expozíciót követően. Valójában szignifikáns csökkenést figyeltek meg a 2,0 mg PM/L koncentrációban. Számos tanulmány kimutatta, hogy a piscine MT-t más oxidánsok, például hidrogén-peroxid indukálja (Kling et al., 1996; Schlenk és Rice 1998). Az MT indukciójának hiánya a kopoltyún és a harcsa nem képes felhalmozni az Mn-t a szövetekben arra utal, hogy az Mn, ha kálium-permanganát formájában van, nem könnyen felszívódik, és nem is biológiailag elérhető a harcsa számára.

Az MT expresszió mérése érdekében MT cDNS próbát izoláltunk egy kadmiummal kezelt csatorna harcsa májból. A cDNS jellemzői az I. osztályú MT szekvenciákra utalnak (Kagi és Schaffer 1988). 4 aminosavmaradék volt, amely egyedülálló volt a harcsa MT-vel, összehasonlítva más teleosztatokkal (alanin-26; cisztein 27; D-52; K-57). Az összes hal MT szekvenciában, amelyet eddig azonosítottak, konzerválódott a ciszteinek száma és helyzete. Valamennyi hal-MT 60 aminosavval rendelkezik, a Trout MT-A kivételével, amelynek további alaninja van a második és a harmadik intron találkozásánál, ami meghatározza a határt a fehérje alfa- és béta-doménjei között,

A 21 legtöbb parsimonikus fából származtatott 50% -os többségű uralkodó konszenzusfa összhangban áll a korábbi jelentésekkel, amelyek szerint az MT erős szekvenciahomológiája van a teleosztikus rendek között (Olsson 1996). A csatorna harcsa az Ictaluridae családba tartozik és a Cypriniformes rendbe tartozik. Csak két parsimonyfában nem sikerült a harcsa MT-t más Cyprinids Stoneloach/Goldfish-szel (az adatokat nem ábrázolták) csoportosítani, így a téli lepényhal, a sima lepényhal, a tőkehal, a Tilapia, a Stoneloach és az Goldfish csoportot alkották.

A kadmiummal kezelt csatornás harcsa korábbi vizsgálatai két mRNS-átiratot mutattak, amelyek korreláltak két MT-fehérjével, amelyeket a kadmiummal kezelt halak májjából tisztítottak meg (Zhang és Schlenk 1995). Csak egy RT-PCR termék azonosítása azt sugallja, hogy a harcsák MT mRNS-jében többszörös splice-hely is jelen lehet, ezáltal változó hosszúságú transzkriptumok képződhetnek. A többszörös izoformák jelenléte magyarázható a transzlált termék transzláció utáni módosításával (azaz acetilezésével) is, amely más MT-kben bizonyítottan előfordul (Roesijadi 1992). Egy másik lehetőség az, hogy több MT gén is létezhet. Ez azonban valószínűtlennek tűnik, mivel a kezdeti északi elemzés során téli lepényhal-cDNS-próbát használtak, amely hasonló szekvencia-homológiára utal (Zhang és Schlenk 1995). Ha a harcsában van még egy egyedi MT gén, akkor a kezdeti 18 nukleotidnak drasztikusan különböznie kell minden más teleost MT-től, mivel az első 6 aminosav szekvenciahomológiája a halakban annyira konzervált (Chan 1994) (Olsson 1996).

Összefoglalva, az oxidálószer, a kálium-permanganát, 8 hetes időszakos expozíciót követően nem okozott mortalitást a csatornaharcsában. 4 hetes expozíciót követően jelentős időbeli hatásokat figyeltek meg a kombinált növekedésre, hosszúságra és májtömegre, de 8 hétre visszatértek a kiindulási értékre. Nem figyeltek meg összefüggést az oxidáns-stressz protein metallotionein (MT), a dózis vagy az egész állat mérése között. Az MT mérések elvégzéséhez egyetlen cDNS-t izoláltunk 3`RACE RT-PCR-rel a csatorna harcsa kadmiummal kezelt májából, és jellemeztük. A termék szerkezeti azonosítása megerősíti a korábbi vizsgálatokat RT-PCR alkalmazásával a harcsa MT-expressziójának mérésére válogatott fémekkel végzett kezelést követően.

A teleost MT cDNS-ekből származó nyitott olvasási keretek összehangolása. * A bázis megőrzését képviseli az összes szekvencia között. A szekvenciák hozzáférési száma: TroutA 127414; PisztrángB 127433; Csuka 103852; Stoneloach 1346601; Cod 471773; Harcsa 219393; Lepényhal 345578; Tilapia 1072468; Aranyhal 1072469; és lepényhal (Chan et al., 1989).