Az RSK2 foszforilálja a T-betet a vastagbélrák áttétének és növekedésének csillapítására

Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
Levelezés céljából: zgdong @ hi.umn.edub.li @ louisville.edu

Szerkesztette: Peter K. Vogt, The Scripps Research Institute, La Jolla, Kalifornia, és jóváhagyva 2017. október 20-án (beérkezett felülvizsgálatra 2017. június 14-én)

Jelentőség

Sok vastagbélrákban szenvedő beteg a távoli szervekben, például a májban és a tüdőben található metasztázisok miatt hal meg, nem pedig az elsődleges daganat miatt. A vastagbélrák jobb molekuláris megértése lehetővé tette a betegek jobb prognózisát és precíziós gyógyszer bevezetését az áttétes vastagbélrák kezelésére. Itt bemutatjuk, hogy a riboszomális S6 kináz 2 (RSK2) hiánya drámai módon csökkent IFNy szekréciót eredményezhet az IFNγ expresszió modulátorának, a T-betnek nem megfelelő foszforilációs státusán keresztül. A csökkent IFNγ-szint immunszuppresszióhoz vezethet, felgyorsíthatja a vastagbélrák által közvetített máj- és tüdőáttéteket. Megállapítottuk, hogy a T-bet RSK2-mediált foszforilezésére van szükség a vastagbélrák metasztázisának és növekedésének gátlásához a 498-as és 502-es szerinnél, az RSK2/T-bet/IFNγ jelátvitel pozitív szabályozásával.

Absztrakt

A metasztázis a daganatos betegek fő halálozási oka (1). A májáttétek olyan rákos daganatok, amelyek a test másik részéből átterjedtek a májba. A legtöbb májáttét vastagbél- vagy végbélrákból származik; valójában a vastagbélrákban szenvedő betegek ~ 80% -ánál és 20% -ánál máj- és tüdőmetasztázis alakul ki (2, 3). A rák áttétét immunszuppresszióval gyorsítják fel (4); azonban az immunsejtek és a rákos sejtek közötti kölcsönhatás a metasztázis összefüggésében továbbra sem teljesen ismert.

A riboszomális S6 kináz 2 (RSK2) két katalitikus doménnel rendelkező szerin/treonin kináz, és mindkét adenozin-trifoszfát (ATP) kötő hely egyidejű mutációja megsemmisíti a kináz aktivitását (5). Az RSK család kinázai több sejtfunkciót mutatnak, ha növekedési faktorok, peptid hormonok vagy neurotranszmitterek aktiválják őket (6). A transzkripciós faktorok foszforilezésével tudják szabályozni a génexpressziót (7). Végül az RSK2 funkcióvesztéses mutációi emberben a késleltetett csontkorral, a koponya fontaneljeinek késői bezáródásával és alacsony testalkatával társított mentális retardáció X-kapcsolt formáját okozzák a Coffin – Lowry szindrómát (CLS). . Bár az RSK fehérjecsaládot alaposan tanulmányozták, az immunrendszerben betöltött szerepükről keveset tudni.

A T-bet (amelyet a Tbx21 kódol) az immunsejt-specifikus tagja a transzkripciós faktorok T-box családjának (11). A T-bet posttranszlációs fehérjemodifikációkon megy keresztül, és a célgén expressziójára gyakorolt közvetlen stimuláló vagy közvetett gátló aktivitással meghatározhatja a sejtek sorsát (12). A T-bet közvetlenül szabályozhatja és aktiválhatja az Ifnγ gén transzkripcióját (13). Az IFNy CD4, CD8 és természetes gyilkos (NK) sejtekben termelődik (14). Az IFNy-re válaszul a T-bet indukálódik, és részt vesz az Ifnγ-gén kromatinjának átalakításában és az IFNy-fehérje stabilizálásában (15). A Th1 és CD8 + T sejtek által termelt sok tényező közül az IFNγ a legjelentősebb citokin, amelynek szerepe van a rákos megbetegedések megelőzésében és elnyomásában (16). Ezenkívül a CD4 + és CD8 + T sejtekben termelt IFNγ fontos szerepet játszik a tumorsejtek gátlásában és elpusztításában, valamint a növekedés gátlásában (17).

Ebben a tanulmányban bebizonyítottuk, hogy az RSK2 foszforilálja a T-bet és elősegíti az IFNγ mRNS expressziós szintjeinek T-bet szabályozását. Eredményeink azt mutatják, hogy az RSK2 knockout (KO) egerek az IFNγ-t alacsonyabban szabályozzák, és a vastagbélrák májáttétjei magasabbak a vad típusú (WT) egerekhez képest. Összességében ezek a megállapítások azt sugallják, hogy a T-betet az RSK2 foszforilezi, és hogy a T-bet 498-as és 502-es szerinjeinek foszforilezésére van szükség a vastagbélrák metasztázisának gátlásához és a növekedéshez az RSK2/T-bet/IFNγ jelátvitel pozitív szabályozása révén.

Eredmények

Vastagbélrákos betegek perifériás vérének mononukleáris sejtjeiben spontán csökkent IFNγ szintek a betegség különböző szakaszaiban.

Az IFNγ kritikus citokin a vírusos és bakteriális fertőzésekkel szembeni immunitás, valamint a tumor felügyelet szempontjából (17, 18). A perifériás keringésből származó vérmintákat vastagbélrákos betegektől gyűjtötték a betegség különböző szakaszaiban. Perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC) izoláltunk, köztük 70-90% limfocitákat (azaz T-sejteket, B-sejteket és NK-sejteket) (19). A PBMC-ket phorbol-12-mirisztát-acetáttal (PMA) és ionomicinnel (20) stimuláltuk, az RSK2 mRNS szintjét humán RSK2 primerekkel elemeztük, és a felülúszó frakciókban IFNy szinteket detektáltunk humán IFNγ ELISA kit alkalmazásával. Az eredmények alacsonyabb RSK2 mRNS-expressziót mutattak vastagbélrákos betegeknél, a normál kontroll alanyokhoz képest (S1A ábra). Ezenkívül az IFNy szintje spontán csökkent, ami megfelel az előrehaladott betegség stádiumának (1A. Ábra). A szérum citokin szintjét vastagbélrákos betegeknél és normális, egészséges kontrolloknál is vizsgálták, és nem figyeltek meg szignifikáns különbségeket (S1 B – G ábra). A GM09621 és GM03317 emberi limfoblaszt sejtvonalak, amelyek RSK2 WT (RSK2 +), illetve RSK2 mutáns (RSK2 -) géneket expresszálnak (7). PMA-val és ionomicinnel stimulálva az RSK2 - limfoblasztok csökkent IFNγ mRNS-szintet mutattak az RSK2 + limfoblasztokhoz képest (1B. Ábra).

A különböző stádiumú vastagbélrákos betegek IFM-szintje a PBMC-kben. (A) PBMC-ket stimuláltunk, és IFNy-szekréciót detektáltunk humán IFNy ELISA kit alkalmazásával. (B) Az RSK2 - limfoblasztok alacsonyabb IFNγ mRNS-szintet mutattak az RSK2 + -hoz képest. A GM09621-et (RSK2 +) és a GM03317-et (RSK2-) PMA-val és ionomicinnel kezeltük vagy kezeletlenül kezeltük. Az Ifnγ génexpresszióját PCR-rel elemeztük. Gapdh belső kontrollként szolgált. (C) IFNy-populációk elemzése a WT és RSK2 KO egerek lépében és nyirokcsomóiban. Az IFNy expresszió átlagos fluoreszcens intenzitását áramlási citometriával elemeztük.

RSK2 KO egereket állítottunk elő az agyműködés és a testméret tanulmányozására. Ezeknek az egereknek olyan jellemzői vannak, amelyek összhangban vannak a CLS-ben szenvedő betegek mentális retardációjával és csökkent növekedési jellemzőivel, akiknek hiányoznak a funkcionális RSK2 fehérjék (21), és így hasznos modellt nyújtanak az RSK2 funkció tanulmányozásához. A lép és a nyirokcsomók ismertek az immunrendszer megfelelő működéséhez, amelyek idegen részecskék és rákos sejtek szűrőként működnek. Az egér lépéből és nyirokcsomóiból izolált primer sejteket áramlási citometriával elemeztük. Az eredmények azt mutatták, hogy a CD4 +, CD8 + és NK sejtpopulációk és azok szaporodási sebessége nem különbözött szignifikánsan a WT és RSK2 KO egerek között (S2. Ábra); ezekben a szervekben az IFNγ + -festett sejtpopuláció azonban drámai módon csökkent az RSK2 KO egerekben (1C. ábra).

A vastagbélrák májáttétjeinek aránya jelentősen megnő az RSK2 KO egerekben.

Az IFNγ a metasztatikus karcinómákkal szembeni immunitás kritikus összetevője (22), és eredményeink azt mutatják, hogy az RSK2-hiány az IFNy-szekréció csökkenésével jár (1. ábra B és C). Ez a megfigyelés arra késztetett bennünket, hogy megvizsgáljuk, vajon az RSK2 kimerülése elősegítheti-e a rák áttétes növekedését. Ehhez a metasztázisos vizsgálatokban széles körben alkalmazott egér rákos sejtvonalat, a CT26 vastagbélrák sejteket ültettük be a WT és RSK2 KO egerek lépébe 10–14 napig (23). Boncoláskor azt tapasztaltuk, hogy az RSK2 KO egérmájok teljesen elfoglalták a rákos sejteket a WT egerekhez képest (2A. Ábra). A H & E-vel festett májszövetek szövettani vizsgálata azt mutatta, hogy a máj nagyon nagy területein áttétek voltak (2B. Ábra, balra).

A vastagbélrák májáttétjeinek aránya jelentősen megnő az RSK2 KO egerekben. (A) A WT és RSK2 KO egerek lép- és májmetasztázisainak reprezentatív fényképei (Mets). (B) A tumorszövetek immunhisztokémiai elemzése. A tumorszöveteket H&E-vel vagy PCNA antitesttel festettük. A PCNA + festett sejtek száma szignifikánsan magasabb volt az RSK2 KO csoportban a WT csoporthoz képest. * P +, CD8 + és NK sejtek, mint a metasztatikus daganatnövekedés elleni immunitás kritikus elemei (24, 25). Az IFNy-t CD4 + és CD8 + T-sejtek termelik, és fontos szerepet játszik a tumorsejtek gátlásában és elpusztításában, ezáltal akadályozva a tumor növekedését (17). A májsejteket RSK2 KO és WT egerekből gyűjtöttük, és áramlási citometriával elemeztük. A CD4 + és CD8 + sejtpopulációk szignifikánsan magasabbak voltak az RSK2 KO egerekben a WT kontrollokkal összehasonlítva (S3A ábra). Ezen túlmenően, mivel daganatellenes effektor sejtek alakulnak ki a lefolyó nyirokcsomókban (26), májáttétes egerekből nyirokcsomókat és lépeket gyűjtöttünk. Az elsődleges sejteket izoláltuk és IFNy/CD4, IFNy/CD49b (azaz NK sejt marker) vagy IFNy/CD8 festettük. Az adatok szignifikánsan alacsonyabb IFN-expressziót mutatnak CD4 +, NK és CD8 + sejtekben RSK2 KO egerekben, összehasonlítva a WT egerekkel, még CT26 vastagbéldaganatos sejtekkel szembeni kihívást jelentő körülmények között is (3. és S3B. Ábra).

Az IFNy-t az RSK2 KO egerekben lefelé szabályozzák. (A és B) A WT és RSK2 KO egerek lépéből (A) vagy nyirokcsomóiból (B) izolált elsődleges sejtekben az IFNγ/CD4 + sejtek százalékos arányának áramlási citometriája. (C és D) A WT és RSK2 KO egerek lépéből (C) vagy nyirokcsomóiból (D) izolált primer sejtek IFNγ/CD49b + sejtjeinek százalékos áramlási citometriájának elemzése (* P S498A/S502A) szinte teljesen megszüntette a foszforilezést RSK2 által (4A. ábra, Felső, 4. sáv).

Az RSK2 kötődik és foszforilálja a T-betet. (A) Az RSK2 a T-bet foszforilálja a 498. és az 502-es szerinin. Az Ő – T-betű vad típusú és egy mutáns His – T-bet S498A/S502A fúziós fehérjéket in vitro kinázvizsgálatnak vetették alá aktív RSK2-vel. Az eredményeket autoradiográfiával tettük láthatóvá. (B) A T-bet magasabb foszforilációs szintet mutatott az RSK2 + sejtekben. Az RSK2 + és az RSK2 - kezeletlen vagy PMA-val és ionomicinnel kezelt. T-bet antitesttel végzett immunprecipitáció után p-szerin antitest alkalmazásával foszforilezett T-betet detektáltunk. A panelek az egyes blotokat képviselik. (C) A T-bet és RSK2 kötés megerősítése. Az endogén RSK2-t RSK2 antitesttel lehúztuk, és egyidejűleg koimmunoprecipitált T-betet detektáltunk Jurkat sejtekben. A panelek az egyes blotokat képviselik. (D) Az RSK2 N-terminális kináz doménjének kötődési modellje egy T-bet fragmenssel (490–510. Maradék). Az RSK2 felületi ábrázolásként, a T-bet töredék pedig kartondobozként piros színnel jelenik meg. A kinagyított nézet a T-bet két foszforilációs helyét, a 498. és az 502. szerint mutatja, amelyek botmodellben vannak ábrázolva.

A foszforilációs szintek ex vivo vizsgálatához PMA-val és ionomicinnel stimuláltuk a GM03317 (RSK2 +) és GM03317 (RSK2 -) sejteket. A GM09621 (RSK2 +) sejtekben szignifikánsan magasabb T-bet foszforilációs szintet találtunk a GM03317 (RSK2 -) sejtekhez képest (4B. Ábra). A T-bet és az RSK2 kölcsönhatásának tanulmányozásához lehúztuk az endogén RSK2-t egy RSK2 antitesttel, és szintén kimutattuk az endogén T-betet egy koimmunoprecipitation assay-ben (4C. Ábra). Ezek az eredmények további megerősítést nyújtanak arról, hogy az RSK2 megköti a T-fogadást.

Laboratóriumunk korábban megoldotta az RSK2 (29) N-terminális doménjének kristályszerkezetét, amely kritikus a downstream aktiváció szempontjából (6). Számítási homológiai módszerrel készítettünk egy T-bet fragmenst (490–510. Maradék), amely tartalmazza a 498. és az 502. szerint. Miután az RSK2 N terminállal dokkolt és molekuladinamikát folytatott, a kötési modell azt mutatta, hogy az RSK2 ATP-kötő üreg felismeri a foszforilációs helyeket, a 498. és 502. szerint (4D. ábra). Ezen átfogó eredmények alapján arra a következtetésre jutunk, hogy a T-bet az RSK2 foszforilációs célpontja.

Az RSK2 elősegíti a T-Bet által közvetített IFNγ mRNS expressziót.

A T-bet megköti az Ifnγ promoter régiót és szabályozza az IFNy expressziót (13, 30). Jurkat-sejtek, egy humán T-limfocita sejtvonal segítségével azt tapasztaltuk, hogy a T-bet méhen kívüli túlzott expressziója jelentősen elősegítheti az IFNγ mRNS expresszióját (5A. Ábra). Azt is tapasztaltuk, hogy ezekben a sejtekben az sh-RSK2 lentivírus-expressziója blokkolta az RSK2 fehérje expresszióját (5B. Ábra, balra), és az IFNy mRNS expressziója elnyomódott az sh-mock-transzfektált sejtekkel összehasonlítva (5B. Ábra, jobb). Végül a T-bet S498/S502 foszforiláció funkciójának tisztázása érdekében túlzottan expresszáltuk a T-bet vad típusú vagy mutáns T-bet S498A/S502A tételt (5C. Ábra, balra). Az eredmények azt mutatták, hogy a T-bet vad típusú foszforilezhető RSK2-vel, míg a T-bet mutáns formája nem foszforilezhető (4A. Ábra, 3. és 4. sáv). Ahogy az várható volt, az IFNy expresszió mutáns T-bet S498A/S502A promóciója drámaian csökkent a WT T-betéhez képest (5.C ábra, jobbra). Ezek az adatok azt is megerősítik, hogy az IFNy ex vivo expressziójához a T-bet RSK2 foszforilezése szükséges.

Perifériás vért vettünk ki az egerekből, hogy azonosítsuk a befogadó egerek sikeres helyreállítását. Az adatok azt mutatják, hogy a sry (hímspecifikus) gént (32) az összes női recipiens egér vérmintájában kimutatták (S4A ábra). Vizsgálati modellünkként ezeket az RSK2 KO egereket alkalmaztuk, a T-bet vad típusú vagy a T-bet S498E/S502E túlexpresszáló csontvelő sejtekkel, és CT26-luciferáz egér vastagbélrákos sejteket ültettünk be minden egér lépjébe. A májáttétek egy korábbi vizsgálatához hasonlóan (33), a beültetett CT26-luciferáz sejtek in vivo gyorsan szaporodtak és elfoglalták az egérmájat (lépinjekcióval) vagy a tüdőt (farokvénás injekcióval) (34). A CT26 sejtek biolumineszcenciáját mérő in vivo Xenogen képalkotás (35) feltárta, hogy a tumor beültetését követő 7. napon jelentősen több CT26 sejtet detektáltak RSK2 KO áltranszfektált egerekben, mint RSK2 KO T-bet vad típusú - vagy T-bet S498E/S502E –transzfektált egerek (7. ábra A és B, valamint S4 B és C ábra). Ezenkívül az RSK2 KO T-bet S498E/S502E-transzfektált egereknél szignifikánsan kevesebb volt a CT26 máj- és tüdőáttét, mint az RSK2 KO T-bet vad típusú transzfektált egerekben (7. ábra A – C és S4 B – E ábra).

A T-bet S498/S502 foszforilezése gyengíti a vastagbélrák májáttétjét RSK2 KO egerekben. Az RSK2 KO egereket, amelyek a T-bet vad típusú vagy a T-bet S498E/S502E túlexpresszálják, csontvelő-transzplantációs vizsgálattal állapítottuk meg. A szentjánosbogár luciferázzal jelölt CT26 sejteket (1 × 106) injektáltuk ezen egerek lépébe, és a CT26 sejtek biolumineszcenciáját in vivo Xenogen képalkotással szemléltettük a tumor beültetését követő különböző napokon. (A) Az egyes csoportok (n = 5) reprezentatív képei láthatók. (B) Az adatokat Bruker MI SE szoftver segítségével elemeztük. * P vad típusú - és T-bet S498E/S502E - transzfektált csoportok. Érdekes módon az IFNy szintje magasabb volt a T-bet S498E/S502E –transzfektált egerekben, mint a T-bet vad típusú transzfektált egerekben (7D. Ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a T-bet nem megfelelő foszforilációja felgyorsítja a kolorektális tumor áttétjét és növekedését, mivel az RSK2 hiánya miatt károsodott az immunválasz.

Vita

Az immunitás hiánya ismert módon hozzájárul a rák kialakulásához és progressziójához (36); így a T-sejt aktiváció fokozása és fenntartása hatékony megközelítés lehet a rák kezelésében (37). Minden immunszuppresszív kezelés potenciálisan ronthatja az immunrendszer védekező képességét, ami a rákos megbetegedések fokozott előfordulásához vezethet (38). Noha az RSK-család fehérjéit számos sejtfunkcióban való részvételükre kiterjedten tanulmányozták, in vivo az immunrendszerben betöltött szerepükről kevéssé ismert. Mint arról korábban beszámoltunk, az RSK2 katalitikusan aktiválódik a T-sejt receptor (TCR) stimulációval, és alapvető szerepet játszik a T-sejt aktiválásában. RSK2 KO egerek T, B és NK sejtjei normálisan fejlődnek (27), és hasonló megfigyeléseket tettünk házon belüli RSK2 KO egér tenyésztő telepünkön is. Amikor elsődleges sejteket izoláltunk lépektől és nyirokcsomóktól, és festettük a CD4, CD8 vagy NK sejt marker kimutatására, nem találtunk szignifikáns különbséget a WT és RSK2 KO csoportok között (S2. Ábra). Mind a T, mind a B sejtek képesek felismerni a potenciális tumorantigének sokféleségét, és a normál és a transzformált sejtek közötti kicsi antigén különbségeket is kimutathatják (36). RSK2 KO egereink szignifikánsan megnövekedett májáttétet mutattak vastagbélrákos sejtekkel (2A. Ábra).

Úgy tűnik, hogy az összes fenti hatás a T-bet nem megfelelő foszforilezésének tudható be, ami rontja az immunválaszt (7. és S4. Ábra); további tanulmányozást igényel azonban, hogy az RSK2 miként fokozza a tumorellenes CD8 + T-sejt válaszokat közvetlenül vagy közvetve a CD4 + T sejtek vagy más mechanizmus révén. Klinikailag a hRSK2 gén (RPS6KA3) heterogén funkcióvesztési mutációi okoznak CLS-t, és a diagnosztizált betegek ~ 70-80% -ának nincs családtörténete (9). A CLS modelljeként RSK2-null egeret hoztak létre. A CLS jelenlegi klinikai vizsgálata főként súlyos fejlődési retardációban szenvedő betegekre összpontosít, és az immunhiányok mértéke továbbra sem tisztázott.

Eredményeink összességében azt mutatják, hogy az RSK2 hiány drámai módon csökkent IFNγ szekréciót eredményezhet a T-bet nem megfelelő foszforilációja révén. Ez immunszuppresszióhoz vezethet, ami felgyorsítja a vastagbélrák áttétjét és növekedését. Ezen eredmények klinikai jelentősége további tanulmányokat igényel. Ezenkívül a rákos megbetegedések és az immunfunkció elemzése a CLS-betegeknél értékes információkkal szolgálhat.

Anyagok és metódusok

Az egerek in vivo Xenogen képalkotását az Xtreme Imaging rendszer (CareStream Health) segítségével végeztük, és a biolumineszcenciát számszerűsítettük Bruker MI szoftver segítségével. Az ebben a tanulmányban használt anyagokat és módszereket a SI Anyagok és módszerek részletesen leírják.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Dr. Rebecca Morris és Kelly Johnson segítségét a csontvelő-transzplantációs vizsgálatban, Dr. Dan Li, Xuejiao Liu, Haitao Li, Young Jin Jeon, valamint Do Young Lim és Todd Schuster a kísérletek támogatásáért; Dr. Tia Rai és Nicki Brickman a kéziratok benyújtásával kapcsolatos segítségért. Ezt a munkát a The Hormel Foundation támogatta; Nemzeti Egészségügyi Intézetek (Grant CA166001, CA172457, CA196639 és CA187027, Zigang Dongnak) és a kínai Henan tartomány Nemzeti Tudományos Alapítványa (162300410337 támogatás).

Lábjegyzetek

↵ 1 K.Y., C.P., Yuwen Zhang és T.A.Z. egyformán járult hozzá ehhez a munkához.

A szerző közleményei: K.Y., C.P., Ziming Dong, B.L. és Zigang Dong tervezett kutatás; K.Y., C.P., Yuwen Zhang, T.A.Z., M.-H.L., S.-Y.L., E.R., H.C., J.R., L.W., Yi Zhang, G.G., W.H., W.-Y.M. és K.L. végzett kutatás; K.Y., C.P., T.A.Z. és H.C. elemzett adatok; K.Y., A.M.B. és Zigang Dong írták a lapot.

A szerzők nem jelentenek összeférhetetlenséget.