Az α tumor nekrózis faktor kulcsfontosságú szerepet játszik a plazminogén aktivátor inhibitor 1 elhízással összefüggő emelkedésében.

Szerkesztette Anthony Cerami, The Kenneth S. Warren Laboratories, Tarrytown, NY, és jóváhagyta 1999. április 16-án (felülvizsgálatra kapott 1999. február 11-én)

Absztrakt

Az elhízás gyorsan növekszik a nyugati társadalmakban, és ezzel együtt folyamatosan növekszik az elhízással kapcsolatos rendellenességek (X szindróma; 1. és 2. hivatkozás), beleértve a szív- és érrendszeri betegségeket is (3, 4). A probléma nagysága és költsége ellenére az elhízás molekuláris változásai, amelyek elősegítik ezeket a körülményeket, még meghatározatlanok. Az α tumor nekrózisfaktor (TNF-α) krónikusan megemelkedik az elhízott rágcsálók és emberek zsírszöveteiben (5–8), és fontos kapcsolatot jelenthet az elhízás és az inzulinrezisztencia között (5, 9, 10). Azonban még nem világos, hogy ez a citokin hozzájárul-e más, az elhízással kapcsolatos patológiákhoz is. Ennek a lehetőségnek a kísérleti támogatása segítene tisztázni a TNF-α szerepét az elhízással járó különféle anyagcsere- és kardiovaszkuláris rendellenességekben.

A szív- és érrendszeri megbetegedések megnövekedett előfordulása (3, 4) összefüggésben lehet az elhízott betegek plazmájában megfigyelt hemosztatikus faktorok, például a fibrinogén, a VII-es faktor és az 1 plazminogén-aktivátor inhibitor (PAI-1) emelkedett szintjével (11–14). A PAI-1 a plazminogén aktiváció elsődleges inhibitora in vivo, és a megnövekedett plazma PAI-1 veszélyezteti a normál fibrin clearance mechanizmusokat és elősegíti a trombózist (15, 16), beleértve a miokardiális infarktust (16, 17). Bár a PAI-1 drámai módon fel van szabályozva az emberi elhízásban (11–14), ennek a plazma-inhibitornak az elhízásban való eredetéről vagy a bioszintézisét szabályozó jelekről keveset lehet tudni. A legújabb bizonyítékok arra utalnak, hogy maga a zsírszövet is hozzájárulhat a PAI-1 fokozott expressziójához az elhízásban. Például viszonylag magas PAI-1 mRNS-szintet detektáltak az egér zsírszövetében (18), és elhízott betegek klinikai tanulmányai azt mutatják, hogy a plazma PAI-1 szintje súlycsökkenés után műtét vagy étrendi beavatkozás miatt csökken (2, 3, 19 –21). Sőt, genetikailag elhízott (ob/ob) egerekben az adipocita PAI-1 expressziója és a plazma PAI-1 szintje jelentősen megemelkedik (22). A PAI-1 mRNS szignifikáns expresszióját a tenyésztett 3T3-L1 adipocitákban (23), a zsigeri és az s.c. elhízott patkányok zsírja (24) és emberi alanyok zsírszövetei (25).

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Állatok.

Felnőtt hím elhízott egereket (C57BL/6J ob/ob) és sovány társaikat (C57BL/6J + /?) A The Jackson Laboratory cégtől szereztük be. Mindkét TNFR-ben hiányos ob/ob egerek (p55 -/- p75 -/-) az ob/ob egerekhez ezekben a receptorokban hiányos sovány egerek keresztezésével és vissza keresztezésével keletkeztek az ismertetett módon (28), és genotipizálva voltak PCR-alapú vizsgálatok alkalmazásával (28) Egyes kísérletek során elhízott egereket injektáltak i.p. vagy semlegesítő hörcsög mAb-nek az egér TNFa (Genzyme) IgG-frakciójának 25 μg-jával, vagy kontrollként egyenértékű mennyiségű normál hörcsög IgG-vel. Hat órával később az egereket metofán (Pitman – Moore, Mundelein, IL) belégzésével altattuk, vérüket 20 mM (végső koncentráció) EDTA-ba (pH 8,0) gyűjtöttük össze, és zsírszöveteiket gyorsan eltávolítottuk és folyadékban azonnal lefagyasztottuk nitrogén a teljes RNS előállításához (23). Más kísérletekben vad típusú sovány egereket (C57BL/6J), valamint olyan sovány egereket injektáltak i.p., amelyekben hiányzott a p55 TNFR, a p75 TNFR vagy mindkettő. rekombináns egér TNF-α-val, egérenként 4 μg 100 μl steril sóoldatban (Richard Ulevitch, a Scripps Kutatóintézet szíves ajándéka). A kontrollállatokat 100 μl egyedül sóoldattal injektáltuk. Három órával később a vért összegyűjtötték, a zsírszöveteket eltávolították és feldolgozták in situ hibridizációhoz (alább) vagy a teljes RNS előállításához.

A PAI-1, inzulin és TGF-β szintek meghatározása a plazmában.

A plazmában lévő aktív PAI-1 antigént a leírt t-PA kötési assay alkalmazásával határoztuk meg (29). Az eredményeket összehasonlítottuk egy standard görbével, amelyet rekombináns PAI-1 egér alkalmazásával állítottunk elő. A plazma inzulinszinteket a patkány inzulin ELISA vizsgálatával határoztuk meg a Crystal Chem-től (Chicago), egér inzulin standarddal együtt, a gyártó utasításai szerint. A teljes plazma TGF-β szintet a Genzyme PREDICTA TGF-β1 készletével mértük, a gyártó utasításainak megfelelően.

RNS elemzés.

A szövetekben a PAI-1 és TGF-β mRNS koncentrációját kvantitatív reverz transzkripció-PCR-rel határoztuk meg, a PAI-1, TGF-β és β-aktin (belső kontroll) upstream és downstream primereit tartalmazó versenytárs cRNS alkalmazásával, a leírtak szerint. (22, 23). Fordított transzkripció és PCR-amplifikáció után 32 P végjelölt 5'-primerek jelenlétében a PCR-termékeket 1,8% -os agarózgéleken elektroforézissel hajtottuk végre. A belső standard cRNS-terméknek és a megcélzott mRNS-terméknek megfelelő sávokat kivágtuk a gélből, és a beépített radioaktivitást szcintillációs számláló segítségével meghatároztuk. A belső kontroll cRNS standard görbéjét szerkesztettük és használtuk a cél mRNS specifikus aktivitásának meghatározására a leírt módon (22., 23., 27.). A minta terhelésének változásait a β-aktin mRNS-sel végzett közvetlen összehasonlítással értékeltük. Parafinba ágyazott szövetszelvényeken (3-5 μ) végzett in situ hibridizációt 35 S-jelzett antiszensz vagy sens ribopróbák alkalmazásával (30) végeztük. A tárgylemezeket sötétben, 4 ° C-on 4–8 hétig tesszük ki. A tárgylemezek kifejlesztése után hematoxilinnal és eozinnal festették őket.

Statisztikai analízis.

Az eredmények statisztikai összehasonlítását a nem párosított Student t teszt alkalmazásával végeztük.

EREDMÉNYEK

Az ob/ob egerek PAI-1 expressziójának változásai semlegesítő antitest egér TNF-α-val történő injektálása után.

Az ob/ob egerek PAI-1 expressziójának változásai a TNF-a semlegesítő ellenanyagának injekciója után. Elhízott (ob/ob) hím egereket (négy-négy, 14 hetes) injektáltunk i.p. kontroll hörcsög IgG-vel (fekete sávok) vagy semlegesítő hörcsög mAb-vel egér TNF-a-val szemben (szürke sávok). Hat órával később a plazmát (A) vagy a zsírszövetet (B) összegyűjtöttük és PAI-1 antigén (A) vagy mRNS (B) elemzésére elemeztük, az Anyagok és módszerek szerint. A PAI-1 antigén szintje a plazmában (A) vagy a PAI-1 mRNS (B) az életkorhoz illeszkedő sovány egerekben (n = 4) szintén látható (üres oszlopok). A hibasávok az átlag ± SD értéket képviselik.

A TNFR-ek törlésének hatása a PAI-1 expresszióra ob/ob egerekben.

Mindkét TNFR törlésének hatása a PAI-1 expresszióra ob/ob egerekben. A plazmát és a zsírszövetet 20–24 hetes hím és nőstény ob/ob egerekből és ob/ob egerekből gyűjtötték, amelyekből mindkét TNFR hiányzott (p55 -/-, p75 -/-). A plazma PAI-1 antigént (A) vagy a zsírszövet PAI-1 mRNS-t (B) elemeztük az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint. (A) n = 6 minden csoportra; oszlopok az átlag ± SD értéket képviselik. Ob/ob és ob/ob p55 -/-, p75 -/- összehasonlítása: P -/-, p75 -/-: P A táblázat megtekintése:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

Azoknál az egereknél, amelyeknél mindkét TNFR nincs, csökkent a plazma inzulin antigén és a zsírszövet TGF-β mRNS szintje

Az exogén TNF-α kezelés hatása a PAI-1 expresszióra vad típusú és TNFR-hiányos sovány egerekben.

Az exogén TNF-α hatása a PAI-1 expresszióra sovány vad típusú és TNFR-hiányos sovány egerekben. Sovány egereket vagy TNFR-hiányos sovány egereket (négy-négy, 20–24 hetesek) injektáltunk i.p. 4 μg egér rekombináns TNF-α-val (nyitott rudak) vagy sóoldattal (töltött rudak). Három órával később a plazmát (A) vagy a zsírszövetet (B) összegyűjtöttük és PAI-1 antigént (A) vagy mRNS-t (B) elemeztük az anyagok és módszerek szerint. A hibasávok az átlag ± SD értéket képviselik.

A TNF-α hatása a PAI-1 mRNS sejt lokalizációjára vad típusú és TNFR-hiányos egerekben. In situ hibridizációt végeztek a vad típusú kezeletlen egerek (A) és a TNF-α-val kezelt vad típusú (B), p55, p75 TNF-hiányos (C), p55 TNFR-hiányos (D) zsírszövetek paraffin metszetein. és p75 TNFR-hiányos (E) egerek. A tárgylemezeket 4 hétig 4 ° C-on tettük ki, majd hematoxilinnal és eozinnal festettük. a, adipociták. A nyilak pozitív jeleket jeleznek a zsírban lévő PAI-1 mRNS-re (B, D és E). Nagyítás: × 400 minden szakaszhoz.

Az exogén TNF-α kezelés hatása a TGF-β expressziójára vad típusú és TNFR-hiányos sovány egerekben.

Az exogén TNF-α kezelés hatása a TGF-β mRNS expressziójára sovány vad típusú és sovány TNFR-hiányos egerekben. Lean vad típusú egereket vagy TNFR-hiányos sovány egereket (20–24 hetesek) injektáltunk i.p. 4 μg egér rekombináns TNF-α-val (nyitott rudak) vagy sóoldattal (töltött rudak). Három órával később a zsírszöveteket összegyűjtöttük és elemeztük a TGF-β mRNS szintjét, az Anyagok és módszerek leírás szerint. n = 3, a hibasávok ± SD-t jelentenek.

Ezeket az eredményeket in situ hibridizációs analízissel is megerősítettük (6. ábra). Gyenge, de következetes jelet mutattak ki a TGF-β mRNS számára a sejttípusokban a kezeletlen egerek zsírjában (6. ábra A és B). Ez a szignál megnőtt a vad típusú egerek TNF-a kezelése után (6C. Ábra), és olyan egereknél, amelyekből csak a p75 TNFR hiányzott (6F. Ábra). Mindazonáltal a TGF-β mRNS szignálja nem nőtt az egerek kezelése után, amelyeknek mindkét TNFR-je (6D. Ábra) vagy p55 TNFR (6E. Ábra) hiányzott.

A TNF-α hatása a TGF-β mRNS sejt lokalizációjára vad típusú és TNFR-hiányos egerekben. In situ hibridizációt végeztek a vad típusú kezeletlen egerek (A és B) és a TNF-a-val kezelt vad típusú (C), p55, p75 TNFR-hiányos (D), p55 TNFR-hiányos zsírszövetek paraffin metszetein ( E) és p75 TNFR-hiányos (E) egerek. A tárgylemezeket 8 hétig 4 ° C-on tettük ki, és hematoxilinnal és eozinnal festettük. a, adipociták. A nyilak pozitív jeleket jeleznek a zsírban lévő TGF-β mRNS számára. Nagyítás: × 400 minden szakaszhoz.

Ábrákon bemutatott eredmények ellenére. Az 5. és 6. ábrán nem tudtuk kimutatni a plazma TGF-β szignifikáns növekedését a TNF-α hatására (nem látható). Így a zsírszövetben a megnövekedett TGF-β mRNS-szint nem tükröződik a megnövekedett TGF-β antigénként a plazmában, ami arra utal, hogy vagy további poszttranszkripciós mechanizmusok vesznek részt, vagy hogy a zsírban lévő TGF-β lokálisabb autokrin vagy parakrin funkciót játszhat.

VITA

A TNF-α és a szív- és érrendszeri betegségek elhízás esetén. A TNF-a krónikusan megemelkedik a zsírszövetben az elhízásban, és hozzájárul az ehhez az állapothoz kapcsolódó inzulinrezisztenciához/hiperinsulinémiához és megemelkedett TGF-β-hoz. A TNF-α, az inzulin és a TGF-β viszont megemelkedett PAI-1, szöveti faktorhoz és esetleg más hemosztatikus génekhez vezethet, amelyek elősegíthetik a kardiovaszkuláris kockázatot.

Köszönetnyilvánítás

Köszönetet mondunk Dr. J. Peschonnak (Immunex Research and Development Corp.) a TNFR-hiányos egerekért. Köszönjük továbbá T. Thinnesnek a technikai segítséget, Laurence Hervio-nak a grafikával kapcsolatos segítséget és M. McRae-nek a szakértői titkárnői képességeket. Ezt a munkát részben az Országos Egészségügyi Intézet (HL 47819) és a Novartis a D.J.L. részben pedig az Országos Egészségügyi Intézet DK 52539-01A1 támogatásával G.S.H. Ez a Scripps Research Institute 11248-VB sz. Kézirata.

Lábjegyzetek

↵ ‡ Kinek kell címezni az újranyomtatási kérelmeket. e-mail: loskutofscripps.edu .

Ezt a dokumentumot közvetlenül (II. Szám) nyújtották be az eljárási irodához.