Bizonyíték a zsírszövet biológiájának és működésének korai változásairól, valamint annak összefüggése az elhízással összefüggő gyulladással és inzulinrezisztenciával a gyermekeknél

K.L. és D.R. hozzájárult ehhez a tanulmányhoz.

Absztrakt

Bevezetés

Az elhízást a zsírtömeg felhalmozódása jellemzi, és gyakran társul a zsírszövet (AT) diszfunkciójával (1). A klinikai adatok azt mutatják, hogy az elhízás már kora gyermekkorban kialakul 2 és 6 éves kor között (2). Az AT kiterjesztése elérhető hiperpláziával (az adipocita szám növekedése) vagy hipertrófiával (az adipocita méretének növekedése) vagy mindkettő kombinációjával (3). Korai tanulmányok azt sugallták, hogy az adipocytaszámot gyermekkorban határozzák meg, és felnőttkorukban viszonylag állandó marad, ami azt sugallja, hogy az AT-tömeg (felnőtt) elhízásban az adipociták hipertrófiáján keresztül növekszik (4,5). Másrészt a sejtmegújulás képessége, amelyet a preadipocyták érett adipocitákká történő differenciálásával érnek el, az egész életen át fennmarad (6). Az, hogy az AT elhízás kialakulásának növekedése elsősorban hiperpláziával vagy hipertrófiával történik-e, és az AT-diszfunkció megjelenésének időpontja még mindig vita tárgya.

A pusztán a zsírtömeg felhalmozódása mellett az elhízás gyakran társul az AT biológiájának és funkciójának változásaihoz, ideértve az adipocita sejtek pusztulását, autofágia, hipoxia, megváltozott adipokin profil, az extracelluláris mátrix átalakulása és gyulladás (7). Feltételezések szerint ez az AT-diszfunkció jelentősen hozzájárul az elhízás klinikailag észlelt káros anyagcsere- és kardiovaszkuláris következményeihez (8). Különösen úgy tűnik, hogy az AT-be történő makrofág infiltráció és az azt követő orchestrated gyulladásos válasz szerepet játszik az elhízással összefüggő inzulinrezisztencia és a szív- és érrendszeri betegségek kialakulásában (9,10). Figyelemre méltó, az elhízással kapcsolatos társbetegségek, beleértve az inzulinrezisztenciát, a magas vérnyomást és a diszlipidémiát, már nyilvánvalóak gyermekeknél és serdülőknél (2,11).

Eddig az elhízással kapcsolatos AT-diszfunkcióra összpontosító legtöbb tanulmányt felnőtteknél végezték. Figyelembe véve azt a tényt, hogy az elhízás és az első kapcsolódó társbetegségek előfordulása már gyermekkorban kialakul (2), a gyermekekkel végzett vizsgálatok jobb betekintést engednek a normális fejlődéssel és az elhízás AT szintjén történő előrehaladásával járó korai folyamatokba. Ezen túlmenően a gyermekek általában a betegség korábbi szakaszait képviselik, és a mögöttes mechanizmusok tanulmányozása kevésbé elfogult a már meglévő társbetegségek és kezelésük miatt.

Ennek a munkának az volt a célja, hogy értékelje az elhízással összefüggő változásokat a gyermekek AT biológiájában, és értékelje a klinikai paraméterekkel való összefüggésüket. Különösen azt a hipotézist akartuk tesztelni, hogy az AT akkumuláció a gyermekkori elhízásban elsősorban az adipocita hipertrófiájához kapcsolódik és AT gyulladáshoz vezet-e, és hogy ezek a változások összefüggenek-e a gyermekek klinikai társbetegségének korai megjelenésével.

Kutatási tervezés és módszerek

Témák és minták (lipcsei gyermekkori kohorsz)

Szubkután AT-mintákat nyertünk 171 kaukázusi gyermekből (0–18 év), akiket elektív ortopédiai műtéten (n = 98), herniotomián/orchidopexián (n = 54) vagy más műtéten (n = 19) végeztek. A kapott szövetminták súlya 0,04-16,4 g. A gyermekek mentesek voltak súlyos betegségektől és az AT biológiáját potenciálisan befolyásoló gyógyszerektől. A következő kizárási kritériumokat alkalmazták: cukorbetegség, generalizált gyulladás, rosszindulatú betegség, genetikai szindrómák vagy tartósan immobilizált gyermekek. Az összes szülő írásos tájékozott beleegyezést kapott. A tanulmányt a helyi etikai bizottság jóváhagyta (265–08, 265–08-ff), és bejegyezték az Országos Klinikai Próbák adatbázisába (NCT02208141).

A BMI-adatokat az életkor- és nemspecifikus német referenciaadatok alapján standardizáltuk, és BMI SD-pontszámként (SDS) adtuk meg. Az 1,28 és az 1,88 SDS határértéke meghatározta a gyermekek túlsúlyát és elhízását (12). A skinfoldokat Harpenden féknyereggel (Holtain Ltd., Crosswell, Crymych, Egyesült Királyság) mértük. A testzsír és a teljes test AT tömegének százalékos becsléseit tricepszből és subcapularis bőrhajlatokból számoltuk ki Slaughter et al. (13).

A műtét előtt éhomi vérmintákat nyertek. Az adiponektin, a leptin, a hs-CRP, a tumor nekrózis faktor-a (TNF-a), az interleukin-6 (IL-6), a glükóz és az inzulin szintjét hitelesített laboratórium mértük. Az inzulinrezisztencia HOMA-ját (HOMA-IR) kiszámítottuk az inzulinrezisztencia értékelésére (14). A valószínűtlen értékeket kizártuk az elemzésből (leptin ≤0,2 ng/ml).

Az adipociták és a stromális vaszkuláris frakció sejtjeinek izolálása emberi AT mintákból

A műtét alatti kivágást követően a szubkután AT-mintákat háromszor mostuk PBS-ben. Körülbelül 100 mg AT-t azonnal lefagyasztottak folyékony nitrogénben az RNS izolálásához, és 50 mg-ot 4% paraformaldehidben rögzítettek a szövettani elemzésekhez. A minta maradékát lemérjük és ledaráljuk, az adipocitákat és a stromalis vaszkuláris frakció (SVF) sejteket kollagenáz emésztéssel (1 mg/ml) választjuk el. Az SVF sejteket folyékony nitrogénben lefagyasztottuk RNS izolálás céljából, vagy proliferációs és differenciálódási vizsgálatoknak vetettük alá. Az adipocitákat közvetlenül lipolíziskísérleteknek vetették alá, vagy ozmium-tetroxidban rögzítették a sejtméret-eloszlás és szám elemzéséhez Coulter-számlálóval (Multisizer III; Beckmann Coulter, Krefeld, Németország) 560 µm-es nyílással (15,16). Az elemzett sejtméretek effektív tartománya 50–250 μm volt. Minden résztvevő esetében az adipociták csúcsátmérőjét (az átmérőt, amelynél az adipociták frekvenciája eléri a maximumot) lekérdeztük a Multisizer grafikonról McLaughlin és mtsai. (17) Ezt a megközelítést úgy döntöttük, hogy módszertani összehasonlítást végzünk a manuális módszerrel (Kiegészítő adatok). A teljes adipocita számot úgy becsültük meg, hogy elosztottuk az egy gramm mintára jutó adipocita számot a test teljes AT tömegével.

Elterjedési és differenciálási kapacitás

Az SVF sejteket előzetes passzálás nélkül beoltottuk 10 000 sejt/cm2-re a proliferációhoz, vagy 33 000 sejt/cm2-t a differenciálódási elemzéshez 96 vagy 48 lyukú lemezeken, és tenyésztő táptalajban inkubáltuk (DMEM/F-12, 10% FBS, 100 egység penicillin, 0,1 mg/ml sztreptomicin) 37 ° C-on és 5% CO2-nál. A sejtproliferációt Hoechst 33342 (Sigma) festett sejtmagok számlálásával értékeltük a 2., 4., 6., 8. és 10. napon a fluoreszcens mikroszkóppal történő beoltás után. Az adipocita differenciálást a Poietics humán zsírszármazékból származó őssejt – adipogenezis protokoll szerint végeztük (Lonza, Köln, Németország). A differenciálási hatékonyságot a Nile-vörös/Hoechst kettős festésű sejtek százalékában adják meg a Hoechst-pozitív sejtek teljes számából, és olajvörös O-abszorbanciaként 540 nm-en (FLUOstar OPTIMA; BMG LABTECH, Offenburg, Németország) lyukanként a 8. napon. Adiponectin a differenciálódott sejtek felülúszóiban ELISA módszerrel határoztuk meg (Mediagnost, Reutlingen, Németország).

Az izolált adipociták lipolitikus kapacitása

A frissen izolált adipocitákat (50 µl) hígítottuk 250 μl szérummentes táptalajban (DMEM/F-12, 0,8% BSA) 20 µmol/l izoproterenollal vagy anélkül 20 órán át (18,19). A táptalajba felszabaduló glicerin mennyiségét szabad glicerin reagenssel (Sigma) határoztuk meg. A lipolitikus aktivitást a Coulter-számláló módszerrel meghatározott adipocita számra normalizáltuk, és glicerin felszabadulásaként adtuk meg ng/ml/1000 adipocita mennyiségben.

Immunhisztokémiai elemzések

A szövetmintákat 4% paraformaldehidben rögzítettük, paraffinba ágyazva és metszve (12 µm). Az immunhisztokémiai festéseket monoklonális CD68 antitesttel (1: 500; M0718, DAKO) végeztük a DAKO REAL APAAP Immunocomplex rendszerrel a gyártó protokollja szerint.

RNS izolálás és mRNS expressziós elemzések

Az RNS izolálást és a kvantitatív valós idejű PCR-t teljes AT mintákból vagy izolált SVF sejtekből a korábban leírtak szerint hajtottuk végre (15). Az alapozó és a próba szekvenciákat az 1. kiegészítő táblázat tartalmazza.

Statisztikai elemzések

Az adatokat, amelyek nem tapadtak a Gauss-eloszláshoz, log-transzformálták az elemzések előtt. Paraméteres teszteket (Pearson-korreláció-analízis, Student t-teszt, egyirányú ANOVA Dunnett post hoc teszttel) kvantitatív tulajdonságokra, χ 2-t pedig kategorikus változókra alkalmaztunk. A TNF-α és IL-6 mRNS és IL-6 szérumszintek esetén a log-transzformáció nem eredményezett Gauss-eloszlást, és nemparametrikus teszteket (Spearman-korrelációs elemzés, Mann-Whitney U-teszt) alkalmaztunk. Az elhízás csoportosulásában a túlsúlyos és az elhízott betegeket kombinálták. Többszörös regressziós analízishez a lépésenkénti előre modellt alkalmazták. A statisztikai elemzést a Statistica 7.1 (StatSoft, Tulsa, OK) alkalmazásával végeztük.

Eredmények

A betegek általános jellemzőit és a lipcsei gyermekkori AT kohorszunk mintáit az 1. táblázat foglalja össze. A sovány és elhízott alcsoportok résztvevői nem különböztek a nemi megoszlás és a pubertás stádium tekintetében, bár az elhízott gyermekek idősebbek voltak, mint a sovány gyermekek (1. táblázat).

A lipcsei gyermekkori AT kohort jellemzői (n = 171)

Az adipocita mérete és száma összefügg az AT felhalmozódásával a gyermekeknél

Azzal a vitatott kérdéssel foglalkoztunk, hogy a zsírfelhalmozódás hipertrófia és/vagy hiperplázia eredménye-e, az adipocita méret és a teljes adipocita szám és az AT felhalmozódás lehetséges összefüggéseinek értékelésével (5,20,21). A sovány kontrollokhoz képest az elhízott gyermekeknél az adipocita mérete és az összes adipocyta száma szignifikánsan, 17,2, illetve 164% -kal nőtt (1. táblázat), és korreláltak az elhízással kapcsolatos paraméterekkel, például a BMI SDS-vel (1A és B ábra) és az AT tömegével (1C. És D. Ábra). Mind az adipocita mérete, mind az összes adipocyta száma az életkor előrehaladtával nőtt a sovány alcsoportban (1E és F ábra). Az adipocita mérete, de nem az adipocyta száma, szintén korrelál az elhízott alcsoport életkorával (1E és F ábra).

Az adipocita sejtek méretének és számának összefüggése az életkorral és a zsírtömeggel. A zsírsejtek átlagos átmérője és az adipociták teljes száma a BMI SDS (A és B) és az AT tömeg (C és D) függvényében nő. Az zsírsejtek átmérője pozitív összefüggésben volt a karcsú és elhízott gyermekek életkorával (E), míg csak a sovány gyermekeknél mutatkozott pozitív összefüggés az összes adipocita szám és az életkor (F) között. Mind az adipocita sejtméret (G), mind az adipocyta szám (H) megnövekszik az elhízottaknál, összehasonlítva a sovány gyermekekkel, minden korosztályban gyermekkortól (6–8 év) a korai felnőttkorig (16–19 év). A Pearson-féle korrelációs együttható R és P értéke meg van adva az egyes szórási diagramokban. Jelentős P értékek (P A táblázat megtekintése:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

Többszörös regresszióanalízis az antropometriai paraméterek megállapítására az egész lipcsei gyermekkori AT kohortban

Az elhízott gyermekeknél fokozódik az SVF sejtek szaporodása, de nem differenciálódása

Az adipocita szám megfigyelt növekedése az adipogén progenitor sejtek fokozott szaporodásából és az azt követő érett adipocitákba történő differenciálódásból származhat. Ezért in vitro megvizsgáltuk az AT mintákból izolált SVF adherens sejtjeinek proliferációját és differenciálódási potenciálját. A kapott SVF sejtek hozama összehasonlítható volt a sovány és elhízott gyermekek között (9,7 ± 1,0 vs. 9,9 ± 1,4 × 104 SVF sejt/g AT; P = 0,680), mint a tapadó SVF sejtek százalékos aránya (23,6 ± 6,6 vs. 21,2) ± 5,6%; P = 0,570).

A sejttenyészetben a sejtszám növekedésének meredeksége meredekebbnek tűnt az elhízottaknál a sovány gyermekeknél, ami ötször magasabb sejtszámhoz vezet az elhízott gyermekek utáni vetés utáni 10. napon (2A. Ábra). Ennek megfelelően az elhízott gyermekeknél felgyorsult az SVF-sejtek duplázódási ideje (1. táblázat), és negatívan korrelált a BMI SDS-vel (2B. Ábra). Nem volt összefüggés az SVF-sejtek megduplázódási idejével az életkorral az egész kohorszban (2. ábra C) vagy csak sovány gyermekeknél (R = 0,157; P = 0,547). Ezenkívül az SVF sejtek megduplázódási ideje nem volt összefüggésben az adipocita méretével (2D. Ábra és 3. táblázat).

Funkcionális paraméterek elemzése rétegződés után az adipocita átmérőjű tertilisekben

A differenciálódott SVF sejtek százalékos aránya nem volt különbözõ elhízottnál a sovány gyermekeknél (1. táblázat és 2E. Ábra) vagy a kis adipociták mintáiban a nagy adipocitákkal összehasonlítva (3. táblázat), amint azt az olajvörös O abszorbancia hasonló szintjei dokumentálják (1. ábra). 2F) és az adiponektin koncentrációja a differenciált sejtek felülúszóiban (2G. Ábra). A karcsú és elhízott gyermek differenciált sejtjeinek reprezentatív képeit a 2H. Ábra és a 2. kiegészítő ábra mutatja.

Fokozott makrofág infiltráció az elhízott gyermekek AT-jában

A gyermekek AT gyulladásának felmérése érdekében megvizsgáltuk a makrofágok AT-be való behatolását és az adipocita méretével való összefüggést. A elhízott gyermekeknél a CD68 + makrofágok száma megduplázódott a sovány gyermekeknél (1. táblázat), és gyenge, de szignifikáns pozitív korreláció volt a BMI SDS-vel (3A. Ábra) és az életkorral (3B. Ábra). Amikor csak a sovány gyermekekre korlátoztuk a korrelációs elemzéseket, a makrofágok száma és az életkor közötti kapcsolat elveszett (R = 0,177; P = 0,100). Hasonló eredményeket kaptunk a CD68 expresszióval kapcsolatban (1. táblázat). Mivel feltételezzük, hogy az adipocita hipertrófiája a makrofágok beszivárgását okozza (10,20), elemeztük az adipocita méret és a CD68 + makrofágok száma közötti kapcsolatot, és pozitív asszociációt igazoltunk (3C. Ábra). Amikor az AT-mintákat tercilekben adipocita méret szerint rétegeztük, a nagy adipocitákat tartalmazó mintákban a makrofágok számának háromszoros növekedését figyeltük meg a kis adipocitákat tartalmazó mintákhoz képest (3. táblázat).

A makrofágok beszivárgása elhízással és az adipocita átmérővel jár. Az AT makrofágok száma pozitívan korrelált a BMI SDS-vel (A), az életkorral (B) és az adipociták sejtméretével (C). A Pearson-féle korrelációs együttható R és P értéke minden egyes szórási diagramban megjelenik. Jelentős P értékek (egy adipocitát körülvevő P + makrofágok) (3D. Ábra), amelyeket az elhízott gyermekek majdnem felénél, de a sovány gyermekek kevesebb mint 10% -ánál találtunk (1. táblázat). Ezenkívül a CLS jelenléte az adipocita méretével együtt növekedett (3. táblázat).

Ezután elemeztük a makrofág infiltráció kapcsolatát az AT-ben olyan gyulladásos markerekkel, mint a hs-CRP, a TNF-a vagy az IL-6. Jelentősen megnövekedett hs-CRP szérumszintet kövéreknél a sovány gyermekeknél (1. táblázat). Az elhízott gyermekek azonban nem mutattak megnövekedett TNF-a vagy IL-6 szérumszintet, sem TNF-a vagy IL-6 expressziót AT-ban (1. táblázat). Korrelációs elemzések során a makrofágok száma nem volt egyértelműen társítva a hs-CRP-hez (R = 0,165; P = 0,085), a TNF-α-hoz (R = -0,097; P = 0,312) vagy az IL-6-hoz (R = -0,001; P = 0,990) szérumszint vagy TNF-a (R = 0,015; P = 0,860) és IL-6 (R = -0,067; P = 0,440) expresszió. Csak a hs-CRP szérumszintek mutattak szignifikáns növekedést az adipocita méret növekedésével (3. táblázat).

Az elhízott gyermekek zsírsejtjeiben csökken a bazális lipolízis

Ezt követően az izolált adipociták lipolitikus aktivitásának értékelésével jellemeztük az adipociták metabolikus funkcióját. Az elhízottaknál a bazális lipolitikus aktivitás szignifikáns csökkenését figyeltük meg a sovány gyermekeknél (1. táblázat és 4A. Ábra). A β-agonista izoproterenollal történő stimulálás a lipolitikus aktivitás jelentős növekedéséhez vezetett mind a sovány, mind az elhízott gyermekek zsírsejtjeiben (4A. Ábra). A két csoport között azonban nem volt szignifikáns különbség az izoproterenollal stimulált lipolitikus aktivitás nagyságában (1. táblázat). A bazális lipolitikus aktivitás (4B. Ábra), de nem izoproterenol-stimulált lipolízis (R = -0,184; P = 0,424) negatívan társult a BMI SDS-hez. Ezenkívül a bazális lipolízis negatívan korrelált az adipocita méretével (4C. Ábra és 3. táblázat), amely azonban elveszett a BMI SDS-hez való igazítás után (R = −0,11; P = 0,643). Sem a bazális, sem a stimulált lipolitikus aktivitás nem változott az életkorral az egész kohortban (4D. Ábra) vagy a sovány alcsoportban (R = −0,059; P = 0,863).