Határok az endokrinológiában

Elhízottság

Szerkesztette
Tuomas Kilpeläinen

Novo Nordisk Alapanyagcsere Kutatóközpont, Koppenhágai Egyetem, Dánia

Felülvizsgálta
Melkam A. Kebede

Sydney Egyetem, Ausztrália

Bruno Ramos-Molina

Murcia Orvosbiológiai Kutatóintézet (IMIB), Spanyolország

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

zsírszövet

  • Cikk letöltése
    • PDF letöltése
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Kiegészítő
      Anyag
  • Exportálás
    • EndNote
    • Referencia menedzser
    • Egyszerű TEXT fájl
    • BibTex
OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

  • 1 Endokrinológiai Kutatóközpont, Moszkva, Oroszország
  • 2 Szövetségi Kutatási és Klinikai Központ, Oroszország Szövetségi Orvosi-Biológiai Ügynöksége, Moszkva, Oroszország
  • 3 Pulmonológiai Kutatóintézet, Oroszország Szövetségi Orvosi-Biológiai Ügynöksége, Moszkva, Oroszország
  • 4 Nemzeti Kardiológiai Orvosi Kutatóközpont, Moszkva, Oroszország
  • 5 Engelhardt Molekuláris Biológiai Intézet, Orosz Tudományos Akadémia, Moszkva, Oroszország
  • 6 Központi Klinikai Kórház és Poliklinika, Moszkva, Oroszország
  • 7 Plasztikai Sebészeti és Kozmetológiai Intézet, Moszkva, Oroszország
  • 8 Endoszebészeti és Litotripsziai Központ, Moszkva, Oroszország

A génexpresszió legfeljebb 60% -át lehet szabályozni mikroRNS-ekkel (miR) (9). A MiR-ek endogén, rövid, nem kódoló molekulák, 20-25 nukleotid hosszúságúak, amelyek képesek megkötni az mRNS komplementer szekvenciáját és gátolni a transzlációt. Az egyre növekvő számú publikáció azt sugallja, hogy a miR-ek kulcsszerepet játszanak a zsírszövetben azáltal, hogy az adipociták anyagcseréjét és az inzulinszignálást célozzák (9). Jordan és mtsai. kimutatta, hogy a miR-143 az emberi adipocita differenciálódás pozitív szabályozója volt, ERK5 jelzéssel hatva (10). Más vizsgálatok azt mutatták, hogy a miR-27a és miR-130a gátolta az adipocita differenciálódást a PPARγ downreguláció révén (11, 12). Thomou és mtsai. a közelmúltban a zsírszövetet a keringő exoszomális miR-ek elsődleges forrásaként írták le (13). A zsírból származó keringő exoszomális miR-ek az egész test anyagcseréjének és az mRNS transzlációjának szabályozói lehetnek más szövetekben (14–16). A zsírszövet miR profiljának meghatározása a betegeknél nemcsak diagnosztikai célokra, hanem terápiás stratégiában is segítséget nyújt. Ez a stratégia magában foglalhatja bizonyos miR-ek gátlását, valamint a miR-szint növelését miR-utánzatokkal (9, 17).

Jelen vizsgálat célja a miR és mRNS expresszióbeli különbségek azonosítása volt a T2D + és a T2D– elhízott betegek között. MiR-ek RNAseq elemzéséből indultunk ki; ezután csak azokat az mRNS-eket elemeztük, amelyek az első lépéstől kezdve jelentős miR-eknek tűntek fel.

Tantárgyak és módszerek

Betegek

A tanulmányt az Endokrinológiai Kutatóközpont etikai bizottsága jóváhagyta (9. sz. Jegyzőkönyv, 2017.09.10.). Az összes önkéntes írásos tájékoztatáson alapuló beleegyezését kapta.

Hetven beteg vett részt (35 a T2D– csoportban és 35 a T2D + csoportban). Valamennyi betegnek hosszú ideig (> 15 év) volt kóros elhízása (BMI> 35 kg/m 2). Tantárgyak I n s u l i n r e s i s t a n c e = FI × G/22. 5.,

ahol FI = éhomi inzulin μIU/ml. G = éhomi glükóz (mmol/l).

RNAseq elemzés

A betegek szövetmintáit azonnal lízispufferbe helyeztük (50–80 mg 1 ml QIAzol Lysis Reagensben (Qiagen, Németország), majd TissueLyser LT-vel (Qiagen, Németország) homogenizáltuk. A zsírszövet teljes RNS-izolálását egy Rneasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen, Németország) az automatikus QIAcube állomáson a gyártó protokollja szerint. A lebomlás megelőzése érdekében 1 μl RNS-oldathoz 1 egység RiboLock Rnase Inhibitort (Thermo Fisher Scientific, USA) adtunk. a vizes oldatban található teljes RNS-t NanoVue Plus spektrofotométerrel (GE Healthcare, USA) értékeltük.

A MiRs expresszióját ezután az Illumina NextSeq 500 (Illumina, USA) szekvenálásával elemeztük. A könyvtárakat az Illumina TruSeq Small RNS Library Prep Kit készítette elő a gyártó szabványos protokolljainak betartásával. Szál-specifikus szekvenálást végeztünk összesen 72 mintán (31 minta T2D– elhízott betegek és 31 minta T2D + elhízott betegek esetében). A bioinformatikai feldolgozás a következő volt: az adaptereket Cutadapt-tal vágtuk le; a kapott FASTQ fájlokat ezután lekötötték az emberi genomra (GRCh37 összeállítás). A FastQC-t eszközként alkalmazták a különböző minőség-ellenőrzési mérések megjelenítésére.

Az egyes mintákhoz a szekvenciákat annotáltuk humán pre-miRNS és érett miRNS adatbázisok segítségével, amelyeket a miRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/) biztosított a SeqBuster-ben. A kapott számlálási adatokat DESeq2-ben elemeztük, hogy differenciálisan expresszált miRNS-eket kapjunk. Csak log2-szeres változások vannak beállítva o-0,10 értéket tekintettünk szignifikánsnak. A szekvencia alapú cél előrejelzéshez TargetScan, Diana-TarBase v8 és mirPath v.3 programokat használtunk.

A szál-specifikus mRNS-szekvenálást az Illumina NextSeq 500 végezte. A könyvtárakat az Illumina TruSeq RNS Library Prep Kit segítségével készítettük, a gyártó szabványos protokolljainak megfelelően. A szekvenálást összesen 48 mintán végeztük (24 minta elhízott T2D-betegekből és 24 minta elhízott T2D + betegekből). A bioinformatikai feldolgozás a következő volt: az adaptereket Cutadapt-tal vágtuk le; a kapott FASTQ fájlokat ezután feltérképeztük az emberi genomra (GRCh37 összeállítás) a STAR segítségével. HTSeq-t alkalmaztunk az olvasások számának megszámolására, és a kapott számlálási adatokat elemeztük a edgeR-ben, hogy differenciálisan expresszált mRNS-eket kapjunk.

A miRNet platformot használták a miR-ek és célgénjeik integrálására.

A hőtérkép diagramhoz Pheatmap-ot (R csomag) használtunk; csak log2-szeres változás állítható be o-0,10 értéket tekintettünk szignifikánsnak.

RT-PCR adatok elemzése

A miR-ek fordított transzkripciós-kvantitatív PCR-jét (RT-qPCR) 70 mintában TaqMan Advanced miRNS cDNS szintézis készlettel (Thermo Fisher Scientific, USA) és TaqMan Advanced miRNS Assay-vel (Thermo Fisher Scientific, USA) végeztük 96 üreges lemezeket a StepOnePlus PCR rendszeren (Applied Biosystems, USA), a gyártó protokolljainak megfelelően. Valamennyi mintát normalizáltuk a hsa-miR-191 szintre, és betoltuk a kontroll cel-miR-39-3p-t. RT-qPCR vizsgálatokat végeztünk a DESeq2 differenciál expressziós eredmények validálására miRNS-eknél, normalizált számuk átlaga> 100.

Az mRNS kétlépcsős qRT-PCR-jét 70 mintában nagy kapacitású RNS-cDNS készlet (Thermo Fisher Scientific, USA) és Custom TaqMan Array 48 Plus lemezek (Thermo Fisher Scientific, USA) felhasználásával végeztük 96-ban. kútlemezek a StepOnePlus PCR rendszeren (Applied Biosystems, USA), a gyártó protokollja szerint. Valamennyi mintát GUSB-re normalizáltuk, és a GAPDH szintjei, a HPRT szolgált másodlagos belső kontrollként.

Az adatok elemzését SDS szoftverrel végeztük (2.3-as verzió. Applied Biosystems). A P 10. érték).

Az RNAseq adatok eredményei lehetővé tették a fel- és lefelé szabályozott gének felosztását elhízott T2D + és T2D– betegeknél. De ezekben a csoportokban nem találtak specifikus mintázatot: a betegek mindkét csoportjában a gyulladásos folyamatokhoz és a sejtproliferációhoz kapcsolódó gének felfelé fordultak (S1. Ábra).

Az RNS-seq átlagosan 47 millió egyoldali leolvasást generált mintánként, összesen 552 mRNS gén mutatkozott DE-nek, szignifikancia küszöbértékkel igazítva o-érték ≤ 0,05 és hajtásváltozás ≥ 2,0. A későbbi RNAseq elemzéshez olyan géneket választottunk ki, amelyek kereszteződtek a korábban szignifikáns miR-ekkel. A qPCR-analízissel végzett validálás csak hat olyan gént igazolt, amelyek expressziója szignifikáns különbséget mutatott: MMP9, MMP2, MMP26, MMP11, SMAD4, RUNX2 (3. táblázat, S3. Táblázat). Ezeket a géneket szabályozták elhízott T2D-betegeknél. Úgy tűnt, hogy a legtöbb gén az extracelluláris mátrix lebontásában részt vevő cink-metalloproteináz család tagjai: MMP9, MMP2, MMP26, MMP11. A gének fennmaradó része a TGFβ/BMP jelátviteli útvonalhoz tartozott: SMAD4 és RUNX2.

3. táblázat. A szignifikáns validált mRNS-ek differenciális expressziója (összehasonlító elhízott T2D– vs. elhízott T2D + csoportok, kiigazítva o-10. érték).

S3. Táblázat. Differenciál expressziós mRNS-ek (MHO és MAO összehasonlítás, kiigazítva o-érték Kulcsszavak: metabolikusan egészséges elhízás, mikroRNS, RNAseq, metalloproteinázok, SMAD4, RUNX2, 2-es típusú cukorbetegség

Idézet: Brovkina O, Nikitin A, Khodyrev D, Shestakova E, Sklyanik I, Panevina A, Stafeev I, Menshikov M, Kobelyatskaya A, Yurasov A, Fedenko V, Yashkov Y és Shestakova M (2019) MicroRNA-k szerepe a Szubkután fehér zsírszövet elhízással és 2. típusú cukorbetegséggel nem rendelkező személyeknél. Elülső. Endokrinol. 10: 840. doi: 10.3389/fendo.2019.00840

Beérkezett: 2019. szeptember 10 .; Elfogadva: 2019. november 19 .;
Publikálva: 2019. december 05.

Tuomas Kilpeläinen, Koppenhágai Egyetem, Dánia

Bruno Ramos-Molina, Málagai Egyetem, Spanyolország
Melkam Alamerew Kebede, Sydney Egyetem, Ausztrália