Diklór-difenil-diklór-etilén (DDE) és metallotionein szintnek való kitettség normokalóros vagy magas zsírtartalmú étrenddel etetett patkányokban: áttekintés

Vincenzo Migliaccio

1 Kémiai és Biológiai Tanszék „Adolfo Zambelli”, Salernói Egyetem, 84084 Fisciano (Sa), Olaszország; ti.asinu@oiccailgimv (V.M.); ti.asinu@ittenoill (L.L.)

Lillà Lionetti

1 Kémiai és Biológiai Tanszék „Adolfo Zambelli”, Salernói Egyetem, 84084 Fisciano (Sa), Olaszország; ti.asinu@oiccailgimv (V.M.); ti.asinu@ittenoill (L.L.)

Rosalba Putti

2 Federico II Egyetem Biológiai Tanszék, 80126 Napoli, Olaszország; [email protected]

Rosaria Scudiero

2 Biológiai Tanszék, Federico II Egyetem, 80126 Napoli, Olaszország; [email protected]

Absztrakt

1. A metallotioneinok multifunkcionális szerepei

A ló vese kéregében 1956-ban történt felfedezésük óta [1] a metallotioneinok (MT) különösen mérgező nehézfémekkel szemben méregtelenítő tulajdonságukról ismertek [2]. Valójában a fehérjék multigén családjába tartoznak, amelyek képesek fém-tiolát kötéseket kialakítani az aminosavláncukban jelen lévő nagyszámú ciszteinnek köszönhetően (az összes aminosav körülbelül 30% -a) [3]. A citoszolos fehérjék szinte minden állati sejttípusban mindenütt expresszálódnak [4,5]; fiziológiai körülmények között esszenciális fémekhez kötődnek, mint például a cink (Zn) és a réz (Cu), így ezekből a mikroelemekből álló tartalékot képeznek a sejtekben; emellett nagy affinitást mutatnak mindenféle biológiai funkció nélküli mérgező nehézfémek, például higany (Hg), ólom (Pb) és kadmium (Cd) iránt [6]. Ennek a méregtelenítő funkciónak az alapvető ismérve az MT képessége, hogy több nehézfém faj indukálja transzkripciós szinten, köszönhetően az MT kódoló gének upstream régiójában a fémre reagáló elemek (MRE) több példányának. [7,8].

2. Metallotioneinok és DDT-metabolitok

A DDT [1,1 ′ - (2,2,2-triklór-etán-1,1-diil) -bisz (4-klórbenzol)], más néven diklór-difenil-triklór-etán, szintetikus szerves klór-olcsó peszticid, amelyet a múltban széles körben használtak a malária ellen [34,35]. Noha a gazdag ipari országokban az 1970-es évek óta tilos, a talaj DDT-szennyezése tartóssága miatt különösen elterjedt [36]. Ezenkívül még mindig használják a fejlődő országokban, ahol a malária és a rovarok által közvetített egyéb betegségek endémiásak [37]; a szöcske-hatás hozzájárul a DDT diszperziójához az összes kontinensen [38].

A talajba kerülve részben diklór-difenil-diklór-etilénné (DDE) és diklór-difenil-etánné (DDD) metabolizálódik; a három különböző készítmény bejuthat a táplálékláncba, elérve a csúcsot, és számos állatfajban sejtbetegségeket okozhat [40]. Lipofil lévén a DDT és származékai felhalmozódnak a zsírszövetekben [41]; ennek eredményeként a gazdagabb iparosodott országokban élő, a DDT-t betiltó emberek egyenletesen ki vannak téve, mivel általában magas kalóriatartalmú, húsban gazdag étrendet követnek [42].

Kimutatták, hogy a DDT és metabolitjai az állati szövetekben oxidatív stresszt és mitokondriális károsodást okoznak [43,44,45,46,47,48], míg ezen anyagok hatásairól kevés, gyakran ellentmondásos adat áll rendelkezésre. az MT expressziójáról és szintéziséről. Ben Miled és munkatársai által végzett vizsgálat [49] kimutatta az MT-tartalom növekedését a patkányok hepatocitáiban, egyetlen intraperitoneális injekcióban, 100 mg DDT/testtömeg-kilogramm (testtömeg) -ben. A patkányok veséiben és heréiben, akik tíz napig ugyanazon DDT-dózist kapták, az MT-tartalom szignifikánsan csökkent [45,46].

Jelen áttekintés azoknak a vizsgálatoknak az eredményeire összpontosít, amelyek célja az MT-k esetleges szerepének tisztázása a DDE, a fő DDT-metabolit orális beadásakor kiváltott sejtes válaszokban. Az MT expressziójának és szintézisének DDE által kiváltott változásait három patkányszervben értékeltük: a májban és a vesében, az MT-ben gazdag mérgező anyagok méregtelenítésében és kiválasztásában részt vevő fő szervekben [50], valamint a herékben a DDT és a DDE toxikus hatásának tanulmányozott célpontja [45,51,52]. Ismerve az intraperitoneálisan beadott DDT hatását az MT szintézisére patkány vesékben és herékben [45,46], a DDE sejtek lokalizációjára, a génexpresszióra és a fehérjeszintézisre gyakorolt hatását egy 4 hetes orális DDE adagolás után határoztuk meg (10 mg/ttkg) normokalorikus étrendhez (10,6% zsír J/J, 15,47 KJ/g) vagy magas kalóriatartalmú étrendhez (45% zsír J/J, 19,88 KJ/g) telített zsírsavakban gazdag és képes a DDE sejtekben történő felhalmozódásának elősegítése érdekében.

A DDE orális adagolása ebben az adagban 4 vagy 6 hétig nem befolyásolja a hím patkányok fizikai fejlődését, ivarérését és szérum metabolikus paramétereit [53].

3. A DDE hatása az MT expressziójára, szintézisére és lokalizációjára patkányszövetekben

3.1. Máj

Az MT mRNS-ek konstitutív mennyiségét 2 hónapos hím Wistar patkányok szövetében valós idejű PCR-analízissel határoztuk meg [54,55,56]. Az alkalmazott MT primerek lehetővé teszik az MT1 és az MT2 izoformák együttes amplifikálását és mennyiségi meghatározását [55,56]. Ahogy az várható volt, az MT transzkriptumok mind a három vizsgált szövetben jelen voltak, az átiratok bőségének sorrendje a következő volt: máj> herék> vesék. Különösen az MT transzkriptumok relatív mennyisége szinte összehasonlítható volt a máj és a herék között; a vesékben az MT mRNS-szint körülbelül ötször alacsonyabb volt. Hasonló forgatókönyvet találtak az MT fehérjék esetében is, amelyek relatív mennyiségét a három különböző szervben a Western blot elemzés segítségével értékelték [56].

A DDE 4 hetes orális adagolását követően a MT transzkriptum tartalmában jelentős változásokat figyeltek meg a patkány szövetekben, az étrendtől is függően.

A májban önmagában a hiperlipidémiás étrend drámai csökkenést okozott az MT transzkriptumokban, a standard étrendet tápláló patkányokban (Ctr patkányok) meghatározott mennyiség kevesebb mint 1/3 részéig; ez utóbbiban a DDE beadása az MT gének hepatocitákban történő alacsony szintű szabályozását is kiválthatta (Ctr + DDE patkányok). Ekvivalens mennyiségű MT-transzkriptumot találtak a magas zsírtartalmú étrenddel táplált patkányok májában (HF patkányok), valamint a magas zsírtartalmú étrendet és orális DDE-t tartalmazó patkányokban (HF + DDE patkányok).

A Western blot elemzés hasonló forgatókönyvet kapott az MT fehérjetartalmáról a máj homogenátumában, a legmagasabb MT szintet a normokalorikus táplálékkal etetett patkányokban (Ctr csoport) figyelték meg; a legalacsonyabb MT fehérjetartalmat a HF + DDE csoporthoz tartozó patkányok májjában mutattuk ki (1. táblázat).

Asztal 1

Metallotionein gén expresszió és fehérje szintek p, p-diklór-difenil-diklór-etilénnel (p, p-DDE) vagy p, p-diklór-difenil-triklór-etánnal (p, p-DDT) kezelt patkányok szövetében, önmagában vagy magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) kombinálva ).

NTD: nem toxikus dózis (10 mg/ttkg, orálisan beadva); HD: nagy dózisok (50–100 mg/ttkg, intraperitoneális injekció).

Figyelemre méltó, hogy a telített zsírsavak bevitelének növekedése és a DDE beadása módosította az MT fehérjék intracelluláris lokalizációját a hepatocitákban, amint azt immunocitokémiai elemzés bizonyítja (1. ábra). Kontroll patkányokban az MT-pozitivitás leginkább a citoszolban lokalizálódott, és kevésbé volt látható a magokban; HF és DDE kezelt patkányokban a festés alacsony volt a citoszolban, és magas volt a hepatocita magja. Ezeket az eredményeket a citoszolos és a magkivonatok Western blot analízisével hitelesítettük.

Metallotionein (MT) lokalizációja patkány májban. Kontroll állatokban (Ctr) az immunocitokémiai jelet (barna területek) detektáltuk a sejtek citoplazmájában (vastag nyilak) és néhány magban (vékony nyilak). Az összes kezelt állatban az immunreaktív jelet nagyobb számú magban detektálták, míg az MT-k citoszolos lokalizációja kevésbé volt elterjedt. HF, magas zsírtartalmú étrend. Bar = 50 um. Migliaccio et al., 2019-ből adaptálva [56].

Az MT fehérjék nukleáris transzlokációja az összes kezelt patkány hepatocitáiban bekövetkezett, a jelentős növekedés csak patkányokban DDE-t kapó patkányokban következett be (2. ábra).

Mint a máj esetében, a vesék immunocitokémiai (3. ábra) és Western blot elemzései (4. ábra) is kimutatták, hogy a DDE beadása a sejt MT eloszlásának változását eredményezte: a fehérje, elsősorban normál körülmények között citoszol, elsősorban a magban.

Metallotionein lokalizáció patkány vesékben. Kontrollállatokban az immunocitokémiai jelet a citoplazmában (vastag nyilak) és a ritka magokban (vékony nyilak) detektáltuk. A magas zsírtartalmú étrenddel (HF) táplált patkányok veséjében az immunfestés gyengébb volt, de több mag egyértelműen pozitív volt. A DDE-vel kezelt állatokban, a tápláléktól függetlenül, markáns pozitivitást detektáltak a citoszolban és sok magban. A magokat hematoxilinnel ellenfestettük. Bar = 50 um. Migliaccio et al., 2019-ből adaptálva [56].

Az MT fehérjék immunolokalizációja a herékben megerősítette a Western blot analízissel kapott eredményeket. A kontroll patkányok heréiben az immunfestés a szemináris epithelium teljes felületén lokalizálódott; intenzívebben festődött azonban a spermatogonia, spermatocyták és Sertoli sejtekből készült bazális rekesz, valamint az adluminalis peremet alkotó spermiumok (5. ábra). A kezelt patkányok heréiben az MT lokalizációja nem változott, de az immunreaktivitás általában csökkentnek tűnt (5. ábra).

Metallotionein lokalizáció patkány herékben. Kontrollállatokban az immunhisztokémiai jelet (barna területek) a szemináris hámot alkotó összes sejt citoplazmájában detektáltuk: szomatikus Sertoli sejtek (SER), spermatogonia (SG), spermatocyták (SC), kerek spermatidák (rSP) és spermatozoák fejek (SZ). Az összes kezelt állatban az immunreaktív MT szignál gyenge volt, többnyire a Sertoli sejteken, a spermatogonián és a spermatozoákon lokalizálódott. Az anti-MT antitest nélkül inkubált negatív kontroll (NC) szakaszokban nem volt látható jel. A magokat hematoxilinnel ellenfestettük. Bar = 50 um.

A patkány heréje magas konstitutív MT transzkriptumokat tartalmaz, összehasonlítva a májban. Az a tény, hogy a heresejtekben lévő MT-gének reagálnak a DDE és/vagy a HF beadására, mint a hepatocitákban, csökkentve az expressziójukat, megerősítette azt a hipotézist, miszerint az MT-gének magas mértékben expresszálódnak a májban és a herékben, következésképpen kevésbé reagálnak a stresszes stresszre. a fémektől eltérő tényezők. A májban és a vesében, a herékben, a herékben nem figyeltek meg változásokat az intracelluláris MT eloszlásban a DDE beadását és/vagy a HF diétát követően, a festés többnyire citoplazmatikus volt (5. ábra).

4. Záró megjegyzések

A májban és a herékben regisztrált MT-szint csökkenése oka lehet a szabad cink- és réz-ionok csökkenése is, amely a fém által aktivált transzkripciós faktorok révén már nem képes kiváltani az MT-k szintézisét. A reaktív oxigénelemek egyensúlyhiánya és a zsírsavak és a lipofil peszticid DDE által termelt sejtes oxidatív stressz események kaszkádját indukálja, kezdve a membrán lipidjeinek peroxidációjával, ami a metalloenzimek aktivitásának éles növekedéséhez vezet. A fém nyomelemeket, különösen a cinket, ezek a metalloenzimek, például a SOD, megköthetik. Hangsúlyozni kell azt is, hogy a fémek sejtekben való bekerülésétől kezdve eltérő hozzáférhetőség állhat rendelkezésre. Valójában negatív korrelációt mutattak ki a nyomelemek és a lipid-anyagcsere termékek (koleszterin, trigliceridek, lipoproteinek) szérumszintjében [62].

Az összegyűjtött adatok azonban arra utaltak, hogy a DDE, HF és HF + DDE csoportba tartozó állatok májában és veséiben az MT fehérjék fenntartották a citoprotektív funkciót, különös tekintettel a DNS védelmére. A magas zsírtartalmú táplálékkal etetett patkányokban és a DDE-vel kezelt patkányokban az MT-tartalom jelentős növekedését figyelték meg mind a máj-, mind a vesesejtek magjaiban, a citoplazmatikus fehérje szintjének egyidejű csökkenésével. A fehérjék nukleáris transzlokációján keresztül bekövetkező MT-k jelenléte a sejtekben sejtmechanizmusnak tekinthető, amely a DNS védelmét szolgálja a hidroxilgyök-támadásoktól [22,57]. Annak köszönhetően, hogy ezek a fehérjék képesek cinket adni több enzimnek, a magas nukleáris MT-szintek szintén összefüggenek a metalloenzimek és a transzkripciós faktorok megnövekedett cinkigényével a gyors sejtszintű metabolizmus és növekedés során [63,64,65,66].

Összességében az adatok azt mutatják, hogy az MT-k más-más szerepet játszanak a szövetek HF-indukált és DDE-indukált oxidatív stressztől való megvédésében, ami arra utal, hogy a különböző típusú sejtek különböző stratégiákat alkalmaznak a pro-oxidáns fajokkal szemben (1. táblázat). Az MT-k bőségesen előfordulhatnak a sejtekben és csökkenthetik a nem fém által kiváltott stresszt (máj és herék), vagy növekedhetnek oxidatív stressz alatt (vese); végül főleg citoplazmatikusak lehetnek, de a mag felé is elmozdulhatnak.

Az adatok azt is mutatják, hogy nincs additív vagy szinergikus hatás a DDE szennyeződés és a HF diéta között; éppen ellenkezőleg, a magas telített zsírsavbevitel enyhíti a DDE által kiváltott károsodást, ha együtt adják őket. Ez az eredmény lehetővé teszi számunkra azt a feltételezést, hogy a lipofil DDE részben elkülönül a zsírtartalmú táplálékkal etetett patkányok szöveteiben előforduló zsírlerakódásokból, ezáltal csökkentve a peszticid sejtes hozzáférhetőségét. További vizsgálatokra van szükség hipotézisünk megerősítéséhez és a DDE zsírlerakódásokból történő felszabadulása utáni további károsodás megjelenésének igazolásához, amelyet a kalóriakorlátozás okozhat. Ugyanakkor további vizsgálatokra van szükség, hogy jobban megvilágítsák a fémek szerepét, különös tekintettel a lipofil (mérgező vagy nem) anyagcsere és egyrészt a lipidek metabolizmusa, valamint a fémes mikroelemek felvétele és homeosztázisa közötti összefüggésekre. a másikon.

Szerző közreműködései

Konceptualizáció, L. L., R. P. és R. S.; nyomozás, L. L., V. M. és R. S.; adatkezelés, L. L., V. M. és R.S .; írás - eredeti vázlatkészítés, R.S .; írás - áttekintés és szerkesztés, R.S. és L. L. Minden szerző elolvasta és elfogadja a kézirat közzétett változatát.

Finanszírozás

Ez a kutatás nem kapott külső támogatást.