Dinamikus változások a bél mikrobiotájában és az anyagcserében a

A bél mikrobiota és az anyagcsere változásainak vizsgálata az alkoholmentes steatohepatitis (NASH) kialakulása során metionin-kolinhiányos (MCD) étrenddel etetett egerekben.

Huszonnégy hím C57BL/6J egeret egyenlően négy csoportra osztottak, és 2 hétig metionin-kolin elegendő táplálékkal táplálták őket (kontroll 2 h csoport, n = 6) vagy 4 hét (kontroll 4 hét csoport, n = 6) vagy MCD diéta 2 hétig (MCD 2w csoport, n = 6) vagy 4 hét (MCD 4 hét csoport, n = 6). A májkárosodást, a fibrózist és a bélgát funkcióját 2 és 4 hét etetés után értékeltük. A széklet mikrobiomját és metabolomját 16s rRNS mélyszekvenálás és gázkromatográfia-tömegspektrometriával vizsgáltuk.

Az MCD diétával táplált egerek egyszerű máj steatosisban és 2 hét múlva enyhe bélsorompóban romlottak. 4 hetes MCD-diétával történő etetés után azonban az egereknél kiemelkedő NASH alakult ki májfibrózissal, és a bélgát jobban károsodott. A kontroll étrendhez képest az MCD diéta fokozatos bél mikrobiota dysbiosist váltott ki, amit a Alistipák és a (Eubacterium) koprostanoligének csoport (P Alkoholmentes steatohepatitis, Metionin-kolinhiányos étrend, Bél mikrobiota, Metabolom, Alkoholmentes zsírmájbetegség

Alap tipp: A nem alkoholos steatohepatitis (NASH) világszerte egyre jelentősebb probléma. A fokozott bizonyítékok azt mutatják, hogy a bél mikrobiota kritikus szerepet játszik a NASH progressziójában. Célul tűztük ki a bél mikrobiota és a kapcsolódó metabolitok dinamikus változásainak vizsgálatát a NASH fejlődése során metionin-kolinhiányos (MCD) étrenddel táplált egerekben. Először tapasztaltuk, hogy az MCD-diéta tartós bél mikrobiotát és metabolomromlást indukálhat.

Idézet: Ti JZ, Li YT, Wu WR, Shi D, Fang DQ, Yang LY, Bian XY, Wu JJ, Wang Q, Jiang XW, Peng CG, Ti WC, Xia PC, Li LJ. Dinamikus változások a bél mikrobiotájában és az anyagcserében a metionin-kolinhiányos étrend okozta alkoholmentes steatohepatitis kialakulása során. Világ J Gasztroenterol 2018; 24 (23): 2468-2481
URL:https://www.wjgnet.com/1007-9327/full/v24/i23/2468.htm
DOI:https://dx.doi.org/10.3748/wjg.v24.i23.2468

A világon leggyakoribb krónikus májbetegség (NAFLD), a leggyakrabban krónikus májbetegség (NAFLD) előfordulása növekszik, kiterjedve az egyszerű steatosis és az alkoholmentes steatohepatitis (NASH) kóros spektrumára. [1] A NASH a metabolikus szindrómára jellemző máj, amely a lipidfelhalmozódást és a májgyulladást okozza [2], és az előrejelzések szerint a következő évtizedben a májtranszplantáció fő indikációja lesz [3]. A NASH általában társul a 2-es típusú cukorbetegséggel, a szív- és érrendszeri betegségekkel és a végstádiumú vesebetegségekkel [4, 5], és jelenleg nincsenek jóváhagyott farmakológiai terápiák a NASH számára [6] .

A közelmúltban meggyőző bizonyítékok rámutattak a bél mikrobiota kritikus szerepére a NAFLD patogenezisében és progressziójában a NASH-ba [7]. Normális esetben a kommensális bél mikrobiota és a gazdaszervezet jótékony szimbiotikus kapcsolatot tart fenn. A máj vaszkuláris tűzfalként működhet, közvetítve a gazda és a bél kommenzális baktériumai közötti kölcsönösséget [8]. Ez az intim kapcsolat a gyomor-bél traktus és a máj között meghatározza a bél-máj tengely kifejezést. A bél mikrobiota dysbiosis azonban növeli a káros anyagok, például a lipopoliszacharid (LPS), az etanol és a bakteriális DNS beáramlását a májba a portális vénakeringés révén, és elősegíti a NASH fejlődését [9, 10]. Jelenleg a NASH korai és nem invazív, magas érzékenységű és specifikus diagnózisa továbbra is kihívást jelent. A metabolomika a többi „omika” technológiával együtt segít a biokémiai események részletes megértésében a rendszerbiológiai megközelítés segítségével, és megkönnyíti a kezelési stratégiák korai diagnosztizálását és kiaknázását [11]. .

Annak ellenére, hogy a bél mikrobiota és metabolomja fontos a NASH-ban, a NASH fejlesztése során betöltött szerepükről részletes információk korlátozottak. Jelen tanulmány célja a bél mikrobiotájának és metabolomjának dinamikus változásainak vizsgálata a metionin-kolinhiányos (MCD) diéta által kiváltott NASH kifejlesztése során egérmodellben.

Az állatprotokollt az állatok fájdalmainak vagy kellemetlenségeinek minimalizálására tervezték, és a Zhejiang Egyetem Orvostudományi Karának Állatgondozási Bizottsága jóváhagyta (Engedélyszám: 2017-591). A hím C57BL/6J egereket (8 hét régi) a SLAC Laboratóriumtól (Sanghaj, Kína) vásároltuk. Megérkezésük után az egereket 1 hétig akklimatizáljuk egy adott kórokozótól mentes környezetben (23 ° C, 12 óra/12 óra világos/sötét, 50% páratartalom és ad libitum élelmiszerhez és vízhez való hozzáférés) a kísérletezés előtt. Az egereket metionin-kolin elegendő táplálékkal (Research Diet, New Brunswick, Egyesült Államok) etettük 2 hétig (a Control 2w csoport, n = 6) vagy 4 hét (a Control 4w csoport, n = 6). Alternatív megoldásként az egereket 2 hétig MCD diétával (Research Diet) etettük (az MCD 2w csoport), n = 6) vagy 4 hét (az MCD 4 hét csoport, n = 6). Az étrend specifikációit az 1. kiegészítő táblázat foglalja össze. 2 vagy 4 hét étrend után az egereket 4% klór-hidrát intraperitoneális injekciójával (1 mg/100 ml atropinnal, a légzőszervi szekréció gátlására) eutanizálják szövetgyűjtés céljából.

A székletmintákat az összes egérből székletürítés után gyűjtöttük, és további eljárásokhoz -80 ° C-on tároltuk. A vérmintákat centrifugáltuk (3000 fordulat/perc, 15 perc) a szérum elválasztáshoz, és az összes szérum alikvot részt -80 ° C-os fagyasztóban tároltuk. A máj- és vastagbélmintákat semleges pufferelt formalinban vagy az optimális vágási hőmérsékletet (OCT) tartalmazó közegben rögzítettük a szövettani festéshez, vagy folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, és a további eljárásokhoz -80 ° C-os fagyasztóban tartottuk.

A parafinba ágyazott májszakaszokat hematoxilin-eozinnal (HE) vagy Masson trichromjával festették a májkárosodás vagy fibrózis kimutatására. A foltos részeket egy NanoZoomer Digital Pathology rendszer (Hamamatsu Photonics, KK, Japán) segítségével szkenneltük, amely digitálisan egy adott képformátumba szkennelte a szakaszokat további értékelés céljából. A HE-vel festett szakaszokat a NAFLD aktivitási pontszám (NAS) rendszernek megfelelően értékeltük (0-2: Nem NASH, 3-4: Borderline NASH és 5-8: NASH) [12]. Minden szakaszból hat mezőt választottunk ki és elemeztünk 200-szoros nagyítással. A Masson trikrommal festett szakaszait elemeztük a fibrózis mennyiségi meghatározásához Image-Pro Plus szoftverrel (6.0 verzió, Media Cybernetics, Rockville, Egyesült Államok), a korábban részletezettek szerint [13]. Minden szakasz esetében a kék területet (kollagén) a vörös területre (hepatocita) normalizáltuk. A fibrózis indexet (%) a teljes szöveti régió százalékában számítottuk ki, és az egyes szakaszok közül hat véletlenszerűen kiválasztott mező átlagát jelentette.

Az OCT-ben rögzített fagyasztott májszakaszokat (10 μm) olajvörös O-val festettük (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Egyesült Államok). A képeket a fent említett NanoZoomer Digital Pathology rendszer segítségével rögzítettük. Az intrahepatikus lipidfelhalmozódás számszerűsítéséhez a vörös intenzitás átlagos optikai sűrűségét Image-Pro Plus szoftver segítségével értékeltük.

A máj triglicerid (TG) tartalmát az Applygen Technologies Inc. (Peking, Kína) kereskedelmi készletével határoztuk meg a gyártó protokolljainak megfelelően, és a végső TG koncentrációt a megfelelő fehérjetartalomra normalizáltuk.

A parafinba ágyazott májszakaszokat F4/80 (anti-aktív makrofág) (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság) és α-SMA (fibrózis jellegzetes) festésére használtuk immunohisztokémiai (IHC) festési eljárásokkal, amint azt korábban részleteztük [14]. Röviden, a májszakaszokat inkubáltuk egy specifikus primer antitesttel, majd inkubálás torma-peroxidázzal (HRP) kapcsolt másodlagos antitesttel (Dako, Glostrup, Dánia) és 3,3’-diaminobenzidinnel; a szekciókat ezután a NanoZoomer Digital Pathology rendszerrel szkennelték. Az F4/80 + sejtek számlálásához és az α-SMA festési intenzitásának kvantitatív elemzéséhez Image-Pro Plus szoftvert használtak a korábban leírtak szerint [13]. Minden szakaszban véletlenszerűen kiválasztottak hat látómezőt.

Hasonlóképpen, paraffinba ágyazott vastagbélmetszeteket festettünk a Zonula occludens-1 (ZO-1) (bélsorompó fémjel) (Proteintech, Rosemont, IL, Egyesült Államok) esetében standard immunfluoreszcens festési eljárásokkal, amint azt korábban részleteztük [15]. Röviden, a metszeteket nyúl poliklonális ZO-1 antitesttel inkubáltuk, majd inkubáltuk Texas Red-konjugált kecske nyúlellenes antitesttel (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, Egyesült Államok) és 4 ', 6-diamino-2-fenil indol (DAPI), és a képeket Zeiss LSM T-PMT konfokális mikroszkóppal rögzítettük (Zeiss, Jena, Németország).

A teljes DNS-t székletmintákból QIAamp gyors DNS széklet mini készlettel (Qiagen, Valencia, Kalifornia, Egyesült Államok) extraháltuk a gyártó kézikönyve alapján. A DNS-koncentráció és integritás meghatározása után amplikonszekvenáló könyvtárat állítottunk össze a 16s rDNS PCR-amplifikált V3-V4 variábilis régiói alapján. Ezután a minősített könyvtárakat egy Illumina MiSeq platformon párosított végű szekvenálással készítettük a gyártó eljárása szerint. A nyers szekvenálási adatokat szűrésnek vetettük alá Trimmomatic, FLASH és QIIME szoftverekkel. Ezután a tiszta leolvasásokat az operatív taxonómiai egységekbe (OTU-kba) csoportosították az UPARSE szoftver segítségével 97% -os küszöbérték mellett. Az egyes OTU-kból kiolvasott képviselőt a QIIME csomag segítségével választottuk ki [16]. Az OTU reprezentatív szekvenciákat annotáltuk és taxonómiailag osztályoztuk a Ribosomal Database Project (RDP) v.2.2 osztályozó segítségével, amelyet a Silva adatbázis 123-as verziójára tanítottunk [17]. A lineáris diszkrimináns analízis (LDA) hatásméret (LEfSe) módszert (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/) alkalmaztuk a taxonok statisztikai szignifikancia és biológiai jelentőségű megkülönböztetésére [18]. .

	Vezérlés 2w	MCD 2w	4w vezérlés	MCD 4w
NAS	0,17 ± 0,17	1,17 ± 0,17 a	0,33 ± 0,21	4,83 ± 0,31 c f j
Steatosis	0,00 ± 0,00	1,17 ± 0,17 b	0,33 ± 0,21	2,50 ± 0,22 c e j
Gyulladás	0,00 ± 0,00	0,00 ± 0,00	0,00 ± 0,00	1,17 ± 0,17 e i
Ballonozás	0,17 ± 0,17	0,00 ± 0,00	0,00 ± 0,00	1,17 ± 0,31
TG (nmol/mg fehérje)	179,41 ± 21,72	592,88 ± 55,84 b	204,45 ± 6,76 e	731.60 ± 113.46 a óra
ALT (U/L)	19,33 ± 0,88	413,83 ± 81,77 a	34,83 ± 2,64 b d	974,17 ± 163,00 óra
AST (U/L)	105,50 ± 10,55	327,33 ± 39,92 a	109,83 ± 11,91 d	749,677 ± 92,34 b d i

Ahogy az várható volt, az MCD 4w csoport egereinél kiemelkedő NASH alakult ki, amit a fő máj steatosis lobuláris gyulladással és a májban lévő ballocing hepatocitákkal igazol (1A. Ábra, 1. táblázat). Olajvörös O festés és a máj TG mennyiségi meghatározása azt is feltárta, hogy a zsír felhalmozódása szignifikánsan megnőtt az MCD étrendet 4 hétig tápláló egerek májában (az MCD 4w csoport), összehasonlítva azokkal az egerekkel, amelyek 4 hétig táplálták a kontroll étrendet (a 4w kontrollcsoport) (1B és D ábra, 1. táblázat). Az F4/80 + sejtek beszivárgása szignifikánsan megnőtt az MCD 4w csoportban, mint a Control 4w csoportban (1C. És E ábra). Ezenkívül azt tapasztaltuk, hogy az MCD 4w csoportba tartozó egerek májfibrózisra utaló jeleket mutattak, beleértve a periportális és az interstitialis kollagén lerakódást (2A. És C. Ábra). Az immunhisztokémiai elemzés tovább erősítette eredményünket: az a-SMA fehérje expressziója szignifikánsan felfelé volt szabályozva az MCD 4w csoportban, összehasonlítva a Control 4w csoportéval (2B és D ábra). A bélsorompó funkciója tovább romlott azokban az egerekben, amelyek 4 hétig táplálták az MCD diétát, összehasonlítva a kontroll étrendet tápláló egerekével, amint azt a ZO-1 immunfestés mutatja (3. ábra).

Az MCD diéta egyértelműen megváltoztatta a bél mikrobiota konfigurációját. Nem figyeltünk meg szignifikáns különbséget az alfa változatosságban a kontroll és az MCD csoport között 2 és 4 hét kezelés után, a Chao1, Shannon és Simpson indexekkel becsülve (az adatokat nem mutatjuk be). Ez a két csoport azonban egyértelműen különálló klaszterekre vált szét 2 hét múlva (ANOSIM, P V: A mikrobiota PCoA diagramja súlyozatlan UniFrac mutató alapján. Minden szimbólum egy mintát képvisel (n = Csoportonként 6). B-D: A legfelső leggyakoribb taxonok a menedék (B), a család (C) és a nemzetség (D) szintjén. E: Az LEfSe kladogram a Control 4w csoportban (zöld) és az MCD 4w csoportban (piros) gazdagodott taxont képviselte. A belülről kifelé irányuló gyűrűk rendszertani szinteket képviselnek a menedékektől a nemzetségekig. A körök méretei jelzik a taxonok relatív bőségszintjét. F: Diszkriminatív biomarkerek> 4,8 LDA pontszámmal. MCD: Metionin-kolin-hiány.

A két csoport bél mikrobiotájában a megkülönböztető filotípusok további jellemzésére LEfSe elemzést végeztünk. Nem találtunk szignifikáns különbséget az MCD 2w és a Control 2w csoport között. 4 hét múlva azonban azt tapasztaltuk, hogy az MCD diéta megnövelte az Anaerotruncus, Bilophila, SMB53, Clostridium, Anaeroplasma, Turicibacter, Helicobacteraceae, Flexispira, és Bacteroides [LDA pontszám (-log10)> 4,8], és csökkentette a bőség szintjét Allobaculum, S24-7, Bifidobacterium, Adlercreutzia, Lachnospiraceae, Akkermansia, Sutterella, Desulfovibrionaceae, Porphyromonadaceae, Parabacteroides, és Erysipelotrichaceae [LDA pontszám (log10)> 4,8] (4E és F ábra).

Céltalan stratégia segítségével tanulmányoztuk a bél mikrobioma funkcionális jellemzőihez kapcsolódó széklet metabolomot, és végül összesen 322 metabolitot azonosítottak és számszerűsítettek.

Legjobb tudomásunk szerint ez az első tanulmány, amely kimutatta a bél mikrobiotájának és metabolomjának dinamikus változását az MCD diéta által kiváltott steatohepatitis kísérleti modelljében: Arra törekedtünk, hogy meghatározzuk a NASH progressziójában szerepet játszó legfontosabb mikrobiotát és metabolitokat az idő múlásával.

Összegzésképpen elmondható, hogy az MCD diéta a bél mikrobiotáját és a metabolom romlását idézte elő. Ezeknek a változásoknak az alapvető megfigyelései új betekintést nyújtanak a NASH-val összefüggő bél rendellenességekbe és a bélre irányuló NASH terápiákba.

A bél mikrobiota közreműködő szerepét az alkoholmentes steatohepatitis (NASH) patogenezisében alaposan tanulmányozták.