Egyedülálló hiba a zsigeri zsírsejtek lipolízisének szabályozásában a policisztás petefészek-szindrómában, mint az inzulinrezisztencia korai összefüggése

Absztrakt

A zsírsejtek izolálása, valamint a zsírsejtek méretének és számának meghatározása.

Egy darabot, ~ 300 mg-ot, folyékony nitrogénben fagyasztottak be, és -70 ° C-on tárolták a későbbi Western blot elemzéshez. Elszigetelt zsírsejteket készítettünk, Rodbell (21) leírása szerint. A zsírsejt-átmérő közvetlen mikroszkópos meghatározását a korábban leírt módon hajtottuk végre (20). A zsírsejtek átlagos térfogatát és tömegét a korábban leírtak szerint határoztuk meg (22). Az alikvot teljes lipidtartalmát gravimetriásan határoztuk meg szerves extrakció után, és a zsírsejtek számát úgy lehetett kiszámítani, hogy a teljes lipidtömeget elosztottuk az átlagos sejttömeggel. Ez a módszer ugyanazokat az eredményeket adja, mint a közvetlen módszer a sejtek számának meghatározására (23,24).

Lipolízis kísérletek.

Az izolált zsírsejteket inkubáltuk a korábban részletesen leírtak szerint (11–15). Röviden, a hízott sejtek hígított szuszpenzióját két órán át inkubáltuk, a noradrenalin, a nem szelektív β-adrenerg agonista izoprenalin, a szelektív β1-adrenoreceptor agonista dobutamin, a szelektív β2-adrenoreceptor agonista terbutalin, a szelektív részleges β3-adrenoreceptor-agonista, CGP 12177, a foszfodiészteráz-rezisztens cAMP analóg dibutiril-cAMP (dcAMP), a szelektív α2-adrenoreceptor-agonista UK 14304, fenil-izopropil-adenozin (nem metabolizáló adenozin-analóg), prosztaglandin E2 vagy inzulin Az összes inkubálást 37 ° C-on Krebs-Henseleit foszfátpufferben (pH 7,4) végeztük, kiegészítve glükózzal (1 g/l), BSA-val (20 g/l) és aszkorbinsavval (0,1 g/l), valamint antilipolitikus kísérletek, adenozin-deamináz (1 mU/ml), valamint 10-3 mmol/l 8-bróm-ciklikus AMP (8bcAMP), gázfázisként levegővel. Inkubálás után egy sejtmentes alikvot részt eltávolítottunk a glicerin meghatározásához, amely a lipolízis indexe.

Az agonista koncentrációját (log mol/l), amely a maximális hatást (EC50) okozza, a koncentráció-válasz görbék logisztikai átalakításával határoztuk meg. Az egyes agonisták maximális hatását (reagálóképességét) glicerin felszabadulásként határoztuk meg a maximális hatékony agonista koncentráció mellett.

Fehérje izolálás és Western blot elemzés.

HSL antitestek.

Az emberi HSL két formában létezik a 6. exon alternatív splicingje miatt (25). Ezeket általában HSL hosszúnak és rövidnek nevezik. Jelen tanulmányban olyan antitestet használtunk, amely specifikus a hosszú variánsra, és egy másikat, amely mindkét formát felismeri. A HSL hosszú antitest nyulakban keletkezett, amint azt korábban leírtuk (25). A 6. exon által kódolt aminosav-szekvenciából származó 15 szermaradékú szintetikus peptidet (QPAASPSRLLSLMDBP) egy kulcslyuk-limpet-hemocianinnal kapcsoltunk egy hozzáadott COOH-terminális cisztein-maradékon keresztül, és a nyulak immunizálására használtuk. Kimutatták, hogy az antiszérum specifikusan felismeri a teljes hosszúságú humán HSL-t (HSL-hosszú), míg nem ismerte fel a 6 exont (HSL-rövid) nem tartalmazó kötési változatot. A HSL hosszú és rövid rövidt felismerő antitesteket csirkében állítottuk elő, az előzőekben leírtak szerint (26, 27). Röviden, az immunizált csirke antiszérumot affinitással tisztítottuk a rekombináns patkány HSL ellen, CNBr-aktiváló Sepharose 4B oszlophoz kapcsolva (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Svédország). Kimutatták, hogy az affinitással tisztított antitestek specifikusak a HSL mindkét formájára.

Kábítószerek és vegyszerek.

BSA (V frakció, A4503), Clostridium histolyticum 1. típusú kollagenáz, Escherichia coli-ból származó glicerin-kináz (C-0130), forskolin (Calbiochem 344270; Calbiochem, La Jolla, Kalifornia) és norepinefrin [(-) - Arterenol A-9512] A dcAMP-t a Sigma Chemical-tól (St. Louis, MO) szereztük be. Az adenozin-deamináz ADA borjúbélből származott, és a Roche Diagnostics Scandinavia (Bromma, Svédország) szállította. A dobutamin-hidrokloridot az Eli Lilly-től (Indianapolis, IN) szereztük be, a terbutalin-szulfátot az Astra-tól (Lund, Svédország) szereztük be. A CGP (±) 12177 [(-) - 4- (3-terc-butilamino-2-hidroxi-propoxi) -benzimidazol-2-on] Ciba Geigy-től (Bázel) származott, az UK 14304 tartarát pedig a Pfizer-től (Sandwich, Egyesült Királyság). A szentjánosbogár luciferázt tartalmazó ATP monitorozó reagens Biothemából (Stockholm) származott. Minden egyéb vegyi anyag a kereskedelemben kapható legmagasabb szintű tisztaságú volt.

Statisztika.

A Student kétfarkú t tesztjét alkalmaztuk a (párosítatlan) és a (párosított) csoportok közötti adatok összehasonlításához. Az adatokat az ANOVA is elemezte, figyelembe véve a kovariancia-analízissel az életkorot vagy a zsírsejtek térfogatát, és az ismételt méréses elemzéssel a gyógyszerkoncentrációt. Az SD-t használtuk a klinikai jellemzők adatainak diszperziójának mértékeként (1. táblázat), normál eloszlás esetén pedig az SE-t használtuk a kísérleti adatokhoz. Lineáris regresszióanalízist is végeztünk. Az összes statisztikai számítást statisztikai szoftvercsomaggal végeztük (Statistica; StatSoft, Tulsa, OK).

EREDMÉNYEK

Klinikai jellemzők.

A klinikai adatokat az 1. táblázat mutatja. A PCOS-ban szenvedő nőknél a Kitt enyhe, de szignifikáns (P = 0,03) csökkenést mutatott, ami némi in vivo inzulinrezisztenciára utal. Az inzulinrezisztencia-szindróma egyéb jellemzőit azonban nem mutatták, mivel a WHR, az éhomi plazma inzulin-, glükóz-, triglicerid- és koleszterinszint, valamint a BMI összehasonlítható volt a kontroll nőkével. A PCOS-betegek és a kontrollalanyok között nem volt különbség a becsült szubkután és viscerális zsírszövet tekintetében, függetlenül attól, hogy a különböző zsírraktárak teljes területét vagy arányát CT-vel határozták-e meg az L3 és L4 szinteken (az értékeket az L4 nem mutatta) ). Hasonlóképpen nem volt különbség a zsírsejtek tömegében a csoportok között. A PCOS-nők azonban átlagosan 4 évvel voltak fiatalabbak, mint a kontroll nők (P = 0,01). A vérnyomás mindkét csoportban normális volt (az értékeket nem tüntettük fel). A nemi hormonok és a megkötő fehérjék mérése alapján várható volt, hogy a PCOS nők hiperandrogenémiában szenvedtek.

Lipolízis kísérlet.

Az agonista által kiváltott lipolízis átlagos koncentráció-válaszgörbéjét a 2. és 3. ábra szemlélteti. 1–3. A lipolízis stimulálása noradrenalin vagy β1-, β2- és β3-adrenoreceptor-szelektív agonistákkal sokkal hatékonyabb volt PCOS-ban, mint kontroll alanyokban. Ez igaz volt az adenilil-cikláz forskolinnal vagy a PKA szintjén dcAMP-val történő stimulációra is. A lipolízist stimuláló szerek összes átlagos görbéje szignifikánsan különbözött (P 0,02-0,04), ha összehasonlítottuk a PCOS-t és a kontrollállapotot. Ugyanakkor a lipolízis gátlása az inzulinreceptor, az α2-adrenoreceptor, valamint az adenozin- és a prosztaglandin-receptor szintjén hasonló volt mindkét csoportban.

Az egyéni koncentráció-válasz görbékből származó lipolízis elemzését a 2. táblázat mutatja. Nem volt különbség az alkalmazott agonisták egyikének bazális lipolízis sebességében és lipolitikus érzékenységében (az EC50 negatív logaritmusa) a két test között csoportok. A noradrenalin, a szelektív és nem szelektív β-adrenoreceptor hatású szerek, valamint az összes posztadrenoceptor hatású szer reakciókészsége (lipolitikus sebesség a maximális hatásos koncentrációnál) ~ 50% -kal nőtt a PCOS-ban, ami statisztikailag szignifikáns volt az összes szer esetében, kivéve a dcAMP-t. (P = 0,056). Azonban az összes antilipolitikus szer iránti reakcióképesség hasonló volt a két csoportban. Csak egy gyógyszerkoncentrációt (1 mmol/l) használtunk a 8bcAMP-hoz. Nem volt szignifikáns összefüggés az inzulinérzékenység (Kitt 3,2 és 6,5 között volt minden alany esetében) és a lipolitikus válaszkészség között bármely szerre (r 2, n = 34). Az izoprenalint azért használták, mert maximálisan aktiválja a lipolízist. Lineáris regressziós analízissel nem figyelték meg az életkor jelentős hatását a bazális (r = 0,29) vagy a maximális izoprenalin (r = 0,08) által kiváltott lipolízisre.

Fehérje izolálás és Western blot elemzés.

Eredményeink azt mutatják, hogy a PCOS-alanyoknál a megnövekedett lipolitikus aktivitás a PKA-HSL-szintű hatásnak köszönhető. Ez arra késztetett bennünket, hogy megvizsgáljuk a lipolitikus szignál kaszkád lehetséges változásait a PKA komplex különböző komponenseinek, valamint a HSL fehérje expressziójának tanulmányozásával. A PKA komplex heterotetramerként van jelen, amely két katalitikus és két szabályozó alegységből áll. Ez utóbbiak két osztályra oszthatók (I. és II.), Amelyek viszont két különböző izoformában (α és β) vannak jelen. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a zsírsejtekben expresszált két fő szabályozó alegység az RIα és RIIβ izoformák (28), és a relatív alegység expressziójának változásai megváltoztathatják az sejten belüli jelátvitelt állatmodellekben (29,30,31). A HSL a zsírszövetben expresszálódó domináns lipáz (32). Emberben az exon specifikus splicingje következik be, ami a HSL két formájának expresszióját eredményezi. Az egyik egy teljes hosszúságú fehérje, teljes biológiai aktivitással (HSL hosszú), a másik pedig egy csonka variáns, amely nélkülöz minden lipáz- és észterázaktivitást (HSL-rövid) (25).

VITA

Ebben a tanulmányban a zsigeri zsírszövet lipolízisét vizsgáltuk PCOS-ban. Ez releváns a 2-es típusú cukorbetegség szempontjából, egyrészt a zsigeri zsírsavak feltételezett szerepe miatt az úgynevezett inzulinrezisztencia (metabolikus) szindrómában észlelt számos rendellenesség esetében, másrészt a PCOS és a metabolikus szindróma közötti szoros hasonlóság miatt . A lipolízis elsődleges és másodlagos változásainak elkülönítése érdekében nem elhízott, fiatal és egészséges PCOS-nőket vizsgáltunk. Ezek a nők nem mutattak klinikai rendellenességeket a testzsír összetételében, a lipidprofilban vagy a keringő inzulinban, de az intravénás inzulin tolerancia alapján ítélve már enyhe általános in vivo inzulinrezisztenciával rendelkeztek. Elismerjük, hogy ez az inzulinérzékenység nyers mértéke in vivo, de szoros összefüggést mutat a bonyolultabb euglikémiás-hiperinsulinémiás clamp módszerrel (18). Valószínűleg a két vizsgálati csoport kiválasztása miatt a PCOS nők valamivel fiatalabbak voltak (átlagosan 4 év), mint a kontroll nők. Ennek a kisebb életkornak azonban nincs jelentős hatása az eredményekre, amint azt az életkor lipolízisre gyakorolt hatására vonatkozó jelenlegi vizsgálatok alapján megítéljük. Ezenkívül a legfrissebb adatok a lipolízis hasonló szabályozására utalnak fiatalabb és idős nőknél (33).

A HSL-en végzett vizsgálatokból kiderül, hogy a zsírsejtekben a lipolízis alternatív és még nem meghatározott lipázokkal aktiválható (32). Ezek a lipázok szerepet játszhatnak a zsigeri zsírsejtek fokozott lipolitikus reakciókészségében is a PCOS-ban.

Néhány újabb bizonyíték van arra, hogy a zsigeri zsírszövet szerepet játszik a máj működésében. A zsigeri zsír szelektív eltávolítása javítja a rágcsálók májműködését (40). Az elhízás bariatrikus műtéte kapcsán a fő omentum eltávolítása a testtömeg csökkenésétől függetlenül javítja az inzulinérzékenységet, a hiperinsulinémiát és a glükóz intoleranciát (41).

A PCOS kiemelkedő jellemzője a hiperandrogenémia, amelyre a jelen tanulmány is rátalált. Patkány-adipocitákon végzett vizsgálatok arra utalnak, hogy a tesztoszteron javítja a katekolamin-stimulált lipolízist a PKA-HSL-t érintő szignáltranszdukció többféle változása miatt (42,43). Nem valószínű azonban, hogy a PCOS-ban megnövekedett lipolízis-változás másodlagos jelenség a magas androgénszint miatt. Az androgénszintet normalizáló orális fogamzásgátló kezelés nem javítja a katekolamin által kiváltott lipolízist a sovány (14) vagy az elhízott PCOS nők szubkután zsírszövetében (15). A zsigeri zsírban az androgének által végzett szelektív lipolízis szabályozása kevésbé valószínűnek tűnik, mivel a tesztoszteron receptorok a szubkután és a zsigeri zsírraktárakban vannak jelen, bár a zsigeri régióban nagyobb mennyiségben vannak (44).