Megnövekedett szénhidráthiányos transzferrin (CDT) és normalizálása az étrendi kezelés során, mint hasznos biokémiai teszt az örökletes fruktóz-intolerancia és a galactosemia szempontjából

Absztrakt

A fehérje-glikoziláció rendellenességeiről a fruktozémiában (HFI) és a galaktozémiában számoltak be, bár, különösen a HFI esetében, a közzétett adatok egyetlen esetre korlátozódnak. A cél a szénhidrát-hiányos transferrin (CDT) profil hasznosságának vizsgálata volt ezeknek a rendellenességeknek az azonosítása és monitorozása céljából. Először a diagnózis előtt és röviddel után elemeztük a CDT értékeket 10 esetben HFI és 17 esetben galaktozaemiát. Valamennyi betegnél magas CDT-szintet találtak, amely szignifikánsan (o

A fruktozémia rutin diagnózisa (McKusick 229600) a fruktóz intolerancia, az aldoláz B aktivitás értékelésére szolgáló májbiopszia és/vagy a fruktóz provokációs teszt klinikai jellemzőin alapszik (1). Klinikai és enzimatikus módszereket is alkalmaznak a galaktozémia (McKusick 230400) kimutatására azokban a populációkban, amelyekre nem terjed ki az újszülöttek populációjának szűrése (2). Az újszülöttek és csecsemők ezen potenciálisan gyógyítható, veleszületett anyagcsere-hibák diagnosztizálásának késedelme súlyos, néha végzetes, irreverzibilis következményeket eredményez.

Míg a száraz vérminta anyagcsere laboratóriumba küldhető a galaktozémia könnyű felismerése érdekében, az örökletes fruktóz-intolerancia (HFI) gyors azonosításához nem áll rendelkezésre egyszerű anyagcsere-teszt. A HFI diagnosztizálása kórházi kezelést igényel egy speciális központban, és a gyakorlatban gyakran potenciálisan veszélyes eljárásokat tartalmaz. Aldoláz B (ALDOB) génmutációs szűrés biztonságos alternatívát jelent, de nincs abszolút érzékenysége, viszonylag drága, és a gyakorlatban gyakran csak a mutációk hordozóira korlátozódik ALDOB gén (3–5).

1996-ban beszámoltunk a reverzibilis hipoglikozilációról N-A transzferrin izoformák mintájában az I. típusú glikozilezés (CDG) veleszületett rendellenességeit utánzó glikoproteinek a kezeletlen HFI egyik biokémiai jellemzője voltak (6). A HFI-ben a CDG rendellenességek mechanizmusát ezt követően Jaeken és mtsai. (7), aki feltételezte a foszfomannóz-izomeráz gátlását a fruktóz-1-P által a májban, a vesében és a belekben. Korábban rendellenes transzferrin-glikozilezést találtak a kezeletlen galaktozémiában (8–10). A kóros glikozilezés mechanizmusa galaktóz-1-foszfát-uridil-transzferáz-hiányos betegeknél nem teljesen ismert, de a közelmúltbeli megfigyelések rámutatnak arra, hogy a galaktozémia másodlagos, „kettős” CDG, és a N-glikánok (11).

1997 és 2005 között a CDT értékelését széles körben alkalmazták központunkban, elsősorban az elsődleges glikozilezési rendellenességek metabolikus szűrésének részeként (12), amelyet az európai EUROGLYCAN és EUROGLYCANET programok keretében végeztek. Érdekes módon megfigyeltük, hogy a HFI vagy a galactosemia volt a végső diagnózis viszonylag sok, emelkedett CDT-vel rendelkező gyermeknél. A CDT-meghatározás hasznosságának további növelése ezen állapotok diagnosztizálásában bevezettünk egy tesztet is, amely a fruktóz vagy galaktóz kizárása után a CDT normalizálásán alapult.

Ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy bemutassa a CDT-t, mint alternatív módszert a fruktozémiás (és galaktozémiás) betegek azonosítására. Ezenkívül meg akartuk vizsgálni a CDT meghatározásának lehetséges felhasználását a fruktóz-korlátozott étrend betartásának ellenőrzésére HFI-ben.

TÁRGYAK ÉS MÓDSZEREK

Az 1997 és 2005 között végzett vizsgálatban 31 fruktózémiás és 17 galaktozémiás gyermek vett részt. A tanulmányt a helyi bioetikai bizottság hagyta jóvá. Tájékozott beleegyezést kaptak a szülők és az idősebb érintett gyermekek.

A HFI-t orális fruktózterhelési teszt (OFLT) és/vagy jelenléte alapján diagnosztizálták ALDOB génmutációk mindkét kromoszómán, kivéve öt gyereket, akit diagnosztizáltak ex juvantibus, fruktózmentes étrenden (FFD) végzett markáns klinikai normalizálás után. A galaktozémiát a galaktóz-1-foszfát-uridil-transzferáz aktivitás rutin kvantitatív meghatározása eritrocitákban igazolta.

A vizsgálat első része 10 HFI-s és 17 galactosemiás beteget vett fel, akiket a diagnózis felállítása előtt beirattak, miközben az országos gyermekgyógyászati anyagcsere-központunkban tesztelték őket. A diagnózis kora 2 hónap és 7 év között volt (medián 16 hónap) a HFI esetében, és 8 nap és 16 hónap (medián 26 nap) között a galaktozémiában. Ezekben a betegeknél a CDT-t a kezelés bevezetése előtt vagy röviddel azután értékelték, majd méréseket követtek 2–4 hét fruktóz vagy galaktóz restrikció után. A fruktóz-korlátozás hatását négy, a HFI-től eltérő ismert etiológiájú CDG-s gyermek referenciacsoportjában is tanulmányozták.

Az FFD hosszú távú megfelelését és annak lehetséges fejlődésre gyakorolt hatását vizsgáló tanulmány második részében 25 HFI-s gyermeket (köztük négy, a vizsgálat első részében azonosított HFI-beteget) vizsgáltak. Mindegyikben egymást követő konzultációk során végezték el a CDT tesztet. Egy időben felmértük az étrend összetételét és a gyermekek fizikai fejlődését (testtömeg és testmagasság a népesség átlagához viszonyítva), a hepatomegalia jelenlétét, a vérképet, a vas- és magnéziumszintet, a kiválasztott paramétereket, amelyek a máj (transzaminázok, koleszterin, protrombin idő, koagulációs tesztek) és a vese (kalcémia és kalcúuria, lúgos foszfatáz, a vér pH-értéke, a szérum és a vizelet húgysavszintje, foszfát reszorpció), valamint a pajzsmirigy működése (pajzsmirigy-stimuláló hormon, szabad trijódtironin, tiroxin). A vizsgálatban résztvevők életkora a vizsgálat során 3–20 év volt (átlagosan 9,2 ± 4,7 év), és a megfigyelés teljes időtartama 0,5–18 év volt (átlagosan 9,4 ± 6,0 év, medián, 10 év).

Orális fruktóz tolerancia teszt.

Egy éjszakán át tartó böjt után, 0800 órakor, 20% -os fruktózoldatot adtunk be orálisan, 5 percig 0,5 g/kg dózisban. Vért vettünk kiinduláskor, 15, 30, 45 és 60 percig. betöltése után. Meghatároztuk a glükóz, a fruktóz, a laktát, és egyes esetekben a húgysav és a foszfát szintjét. A tesztet akkor tekintették diagnosztikusnak, ha hipoglikémia, hipofoszfatémia, a fruktóz, a laktát és a húgysav koncentrációjának növekedése következett be. A tesztet i.v. glükóz beadása a hipoglikémia megjelenésekor.

ALDOB génmutációs szűrés.

A mutációszűrést a kódoló exonok és az illesztési helyek közvetlen szekvenálásával végeztük ALDOB gén az előzőekben leírtak szerint (5).

Transferrin izoelektromos fókuszálás (IEF).

Vassal telített szérumok transzferrin izoformáit (vas-citrát/nátrium-hidrogén-karbonát) 1% agaróz gélen (Iso-Gel agarose FMC) 5% amfolinnal 5,0–7,0 pH-tartományban (Pharmacia Fine Chemicals) szétválasztottuk Multiphore 2117 készülékkel. (LKB) módosított elektródafedéllel (az elektródák közötti távolság 5,6 cm-re csökkent). Miután az IEF transzferrin izoformákat immunfixálással (poliklonális nyúl anti-humán transzferrin szérum, DAKO) és Coomassie kék R-250 festéssel vizualizáltuk. Az elválasztott sávok OD-jét Appraise densitometer (Beckman) alkalmazásával határoztuk meg. A% CDT-t az asialo-, monoszialo- és diszialotranszferrin-frakciók összegeként fejeztük ki. A% CDT referenciaérték 60 egészséges gyermeknél 1,5 és 6,2 között volt (átlag 3,9, SD ± 2,3).

Az étrend értékelése.

Az étrendet háromdimenziós élelmiszer-nyilvántartási módszerrel értékelték becsült súlyok felhasználásával. Az energia-, fehérje-, zsír-, szénhidrát- és C-vitamin-fogyasztást a lengyel ajánlott napi bevitel (RDI) százalékában fejezték ki. Az étrend fruktóztartalmát mg/kg/napban fejeztük ki. A háromdimenziós tápláléknyilvántartást az egyes HFI-betegek szülei otthon tartották a klinikai és biokémiai vizsgálatra (beleértve a CDT-elemzést is) szorosan megelőző időtartamig otthon.

EREDMÉNYEK

CDT versus kezelés HFI-ben.

A kezelés előtt a HFI végső diagnózisával rendelkező összes gyermeknél a CDT-szint megemelkedett, míg az FFD bevezetése normalizálódásukhoz vagy 2–4 hét múlva nyilvánvaló jelentős csökkenéshez vezetett (1. ábra). Az átlagos CDT-értékek az FFD előtt 27,3 ± 11,5% (maximum 48,7%), táplálkozási kezelés után 9,3 ± 5,1% voltak. Ez a különbség nagyon jelentős volt (o 1.ábra

A CDT% -a (szilárd oszlopok) és után (nyitott oszlopok) fruktóz-korlátozott étrend esetén HFI-betegeknél (1–10. Szám) vs. referencia esetek (CDG, galactosemia). Az oszlopokban szereplő értékek az FFD-n töltött napok számát jelzik. Két betegben (9 és 10) csak a diagnózis előtti eredmények állnak rendelkezésre. ALDOB Az 1-3. és 5. betegek génmutációit az 1. táblázat mutatja be. Az 1. ábra szerinti többi beteg mutációi a következők: 4. beteg: A150P/A175D; 6. beteg: A150P/-; 7. és 8. beteg: nincs mutáció az 5. exonban, más exonokat nem teszteltek; 9. beteg: A150P/A150P; 10. beteg: Y174X/Y174X. R, referencia (oszlop, átlag; függőleges vonal, felső tartomány).

CDT versus kezelés galaktozémiában.

A kezelés előtt minden galaktozémiában szenvedő gyermeknél a CDT-szint emelkedett, míg a galaktóz-korlátozott étrend bevezetése normalizálódásukhoz vagy szignifikáns csökkenésükhöz vezetett, általában csak néhány nap elteltével (2. ábra). A megfelelő átlagos kezelés előtti és utáni értékek 43,8 ± 14,1% (maximum 61,6%) voltak ellen 11,2 ± 4,0% (o 2. ábra

A tejmentes étrend előtti (szilárd oszlopok) és után (nyitott oszlopok)% CDT galaktozémiás betegeknél. A nyitott oszlopokban szereplő értékek jelzik a tej nélküli étrendben töltött napok számát. Két beteg (13 és 14) esetében csak a diagnózis előtti eredmények álltak rendelkezésre, míg háromnál (15, 16, 17) csak az étrendi kezelés bevezetése után voltak elérhető eredmények. A 4. beteget 48 nap galaktózmentes étrend után 10 napig tudtukon kívül galaktóznak tették ki. R, referencia (oszlop, átlag; függőleges vonal, felső tartomány).

A CDT értékek monitorozása a fruktozémia kezelése során.

A fruktozémia diétás kezelése során a% CDT érték 3% és 25,8% között mozgott (átlagosan 11,3 ± 5,5%). A 25 gyermekből álló csoportban végzett összes 134 meghatározás közül csak 30 volt a normális határokon belül (1. CDT táblázat. A fruktóz-korlátozott étrendben lévő HFI betegek CDT-értékeinek hosszú távú monitorozása

Fejlődési és biokémiai paraméterek a kezelt fruktozémiában.

A fizikai fejlődés hiányosságokat mutatott, amelyek főleg magassághiányként jelentkeztek. A magasság és a testtömeg átlagos SD-ja a magasság volt, -0,97 ± 1,45 SD; súly, -0,38 ± 1,17 SD. A legalacsonyabb megfigyelt normalizált egyéni magasság -2,6 SD volt.

A 25 vizsgált gyermek közül 16-ban patológiásán megnövekedett> 15% -os húgysavkiválasztást találtak, és általában a szérum húgysavkoncentrációjának csökkenése kísérte.

VITA

A különböző populációkban előforduló betegség gyakoriságára vonatkozó molekuláris adatok azt mutatják, hogy a HFI viszonylag gyakori rendellenesség (kb. 1: 20 000 születés), ugyanakkor minden szerző egyetért abban, hogy jelentősen alul diagnosztizált. A HFI gyors diagnosztizálásának szükségessége egyre sürgetőbb, tekintettel a mesterséges édesítőszereket (szorbit, fruktóz, magas fruktóz tartalmú kukoricaszirup szilárd anyagokat) tartalmazó feldolgozott élelmiszerek növekvő használatára, egyre növekvő számú fel nem ismert beteg válik tünetessé (12,13).

Vizsgálatunk során megállapítottuk, hogy a szérum CDT meghatározása hatékony módszer a HFI és a galactosemia azonosítására. Ezek az eredmények különös jelentőséggel bírnak a HFI vonatkozásában, amelyek esetében nem áll rendelkezésre egyszerű anyagcsere-teszt. A HFI diagnózisát jelentősen késleltették a tünetek megjelenésétől, átlagosan 23 hónapos korban. Hasonlóképpen, amint azt az irodalom leírja, a HFI-betegek közül sokat többször kórházba szállítottak, és máj, izmok és vesék diagnosztikai biopsziájának, valamint enzimatikus és molekuláris vizsgálatnak vetették alá különféle anyagcsere-betegségek miatt (12–18).

A HFI diagnózisának késése nemcsak tapasztalataink szerint gyakori. A gyermekgyógyászati anyagcsere-központokban a HFI diagnosztizálásához szükséges idő jelentősen meghaladhatja az 1 hónap „példaértékű” idejét, amelyet a legutóbbi torontói elemzés adott (19). A neurológiai tünetek (20), a hipoglikémia, valamint a visszatérő hányás és az izolált hypertransaminasemia (21) az Ib típusú veleszületett glikozilációs rendellenességben is előfordulnak (22, 23), és rossz irányba terelhetik az anyagcsere-diagnosztikát.

Vizsgálatunk során a hosszú távú diétás kezelésben szenvedő HFI-ben szenvedő gyermekeknél is meglepően magas volt a CDT. Normál CDT-értékeket az összesen 134 meghatározás közül csak 30-ban találtunk; ráadásul ezek az értékek egyedi esetekben javultak egy tapasztalt dietetikus rendszeres konzultációin keresztül. A fruktóz hosszú távú szigorú elkerülésének mellékhatása egyértelműen kiegyensúlyozatlan étrend volt, amely felesleges fehérje- és zsírtartalmat, szénhidráthiányt és gyakran hiányos energiaellátást tartalmaz. Az étrend összetételében hasonló minőségi és mennyiségi változásokról számolt be Mock et al. (24) két HFI-ügyükben.

Véleményünk szerint a HFI kezelése során a CDT szint objektíven tükrözi a fruktóz bevitelt, és felülmúlja az étkezési naplók alapján végzett étrendi elemzéseket. Hasonlóképpen, a galaktozémiában kimutatták, hogy a kóros glikoformok fennmaradnak a korlátozott galaktóz diétán, és felvetették, hogy a CDT kimutatás hasznos előrejelző lehet a kezelés kimenetelére ebben a betegségben (10).

Meg kell még mutatni, hogy az FFD-nek a kielégítően kielégítő betartása hosszú távon káros következményekkel jár-e. Vizsgálatunkban az összes fruktozémiában szenvedő beteg átlagos magassága FFD-nél alacsonyabb volt az egészséges populációhoz képest. Nehéz meghatározni, hogy a HFI-betegek magassági hiánya a fruktóz nyomokban található étrendben van-e, vagy az eliminációs étrend mellékhatásaként jelentkező kvalitatív és kvantitatív étrendbeli hiányosságok miatt.

Más szerzők is tették ezt a megfigyelést. Gúny et al. (24) felvetette, hogy a fruktozémiában a növekedési hiányt a nem megfelelő fruktóz-korlátozás okozza. A HFI korai diagnózisával rendelkező, növekedési hiányt mutató két gyermek étrendje napi 110–450 mg/kg fruktózt tartalmazott, anélkül, hogy szokatlan hasi fájdalom, hányás, tüneti hipoglikémia vagy hepatopathia formájában az intolerancia tüneteit okozta volna. A fruktóz bevitelének 20–40 mg/kg/napra (24) történő csökkentése felzárkózási növekedéshez vezetett (-2,40 SD-ről +0,3 SD-re és a 25.-ről a 97. percentilisre). Egy speciális étrendi vizsgálat szigorú és nyugodt, rövid távú fruktóz-korlátozással összefüggést mutatott ki a szérum fruktózszintje és a húgysav- és magnéziumszint között (24).

A legújabb tanulmányok arról számoltak be, hogy a cöliákia együttélése növekedési deficithez is vezethet a HFI-ben (25). Vizsgálatunk során nem vizsgáltuk ezt a lehetőséget. Függetlenül a fruktozémia növekedési hiányának okaitól, eredményeink rámutatnak arra, hogy minden HFI betegnek tapasztalt metabolikus dietetikus rendszeres gondozása szükséges.

Vizsgálatunk során a húgysav-anyagcsere rendellenességeit is megállapítottuk a HFI által érintett gyermekeknél jóval a diagnózis felállítása után. A húgysav megnövekedett vesekiesése, amely alacsonyabb szérum húgysavszinttel társul, a tubuláris reszorpció károsodását jelezte. A fruktóz, pontosabban a fruktóz-1-foszfát (F-1-P) hatása a húgysav anyagcseréjére jól ismert (12,13,24), és egészséges egyénekre is érvényes. Rövid távú kísérlet során a húgysav szérumszintje megemelkedett a fruktózterhelés után, ez a hatás a fruktozémiában szenvedő személyeknél egyértelműbb. Ismeretes, hogy az F-1-P kimeríti az adenozin-trifoszfátkészletet és stimulálja a purin anyagcseréjét. A HFI-ben a hiperurikozuriát két mechanizmus okozza: a húgysav túltermelése (fent említett) és a hiányos újrafelvétel a Fanconi-DeToni-Debre típusú tubulopathia következtében. Érdekes, hogy tanulmányunkban csak az F-1-P hatása a húgysav útjának vese stádiumára vált nyilvánvalóvá azoknál a gyermekeknél, akik nyomnyi mennyiségű fruktózt fogyasztottak. A szérum húgysavszintje nem emelkedett, de gyakran a normál érték alsó határán vagy alatt volt (1. táblázat). A hypouricemia előfordulásáról a HFI-ben szórványosak a jelentések (15). Ennek a megfigyelésnek a fontossága megköveteli egy nagyobb résztvevői létszámú tanulmányt.

Vizsgálatunk során a szérum CDT vizsgálatával az anyagcserezavarok korai tüneti szűrésének részeként a fruktozémia eseteinek azonosítása mellett 17 galaktozémiás esetet diagnosztizáltunk újszülötteknél és fiatal csecsemőknél. Becslések szerint a galaktozémia gyakorisága 1: 23 000 - 1: 44 000 születés (26). Körülbelüli becslés szerint az ebben a vizsgálatban feltárt esetek száma az összes rokon, galaktozémiában szenvedő páciens 28% -át azonos idõszakban diagnosztizálták Lengyelországban. Hangsúlyozni kell, hogy az enzimatikus vizsgálatokkal ellentétben a vérátömlesztés nem befolyásolja a CDT értékeket kezeletlen galaktozémiában. Ennek a tesztnek az a korlátja, hogy az eredmények 2 hét kor előtt nem egyértelműek, és csak akkor lehetnek rendellenesek (és diagnosztikusak), ha a tej szerepel az étrendben.

Összefoglalva, eredményeink azt mutatják, hogy az emelkedett CDT és annak normalizálása az étrendi kezelés során hasznos biokémiai teszt a HFI és a galactosemia szempontjából. Ezenkívül a CDT assay felhasználható az FFD betartásának ellenőrzésére, ami a HFI-betegeknél jelentős, fel nem ismert problémának tűnik.

Rövidítések

aldoláz B gén

a glikoziláció veleszületett rendellenességei (korábban szénhidráthiányos glikoprotein)