Folyadékkromatográfia nagy felbontású tömegspektrometria zsírsavprofilozáshoz

Max Planck Molekuláris Növényélettani Intézet, Am Mühlenberg 1, Potsdam, 14476 Németország

Összegzés

Bevezetés

Mivel a zsírsavak elemzése kiemelkedő szerepet játszik az anyagcserében, a metabolomika szempontjából kiemelt jelentőségű. Jelenleg a növénytudományban a lipidmolekulákat rutinszerűen mérik és számszerűsítik folyadékkromatográfiás tömegspektrometriával (LC-MS; Welti és Wang, 2004; Markham és Jaworski, 2007; Giavalisco et al., 2011; Szarvatlan et al., 2011), míg a zsírsavtartalom (FA), sőt az egyes FA-k tartalma általában gázkromatográfiai tömegspektrometriával (GC-MS) vagy gázkromatográfiai lángionizációs detektálással (GC-FID; Li-Beisson) történik et al., 2013). Az FA-k analitokká történő átalakításához a GC-módszerek származtatást igényelnek (például metil-észterezés vagy szililezés) illékony FA-származékok képződéséhez. Másrészt az LC ‐ MS módszerek nem igényelnek derivatizálást, némi előnyt nyújtva ennek az elemzési megközelítésnek.

Itt bemutatunk egy módszert az FA-k elemzésére LC ‐ MS-alapú módszerrel. Bebizonyítottuk, hogy az FA-kat pontosan meg lehet jelölni hiteles szabványokkal és az FA-csúcsok tömegalapú feljegyzésével. Az annotációt 13 C-os, teljesen jelölt Arabidopsis levélkivonatokkal támogattuk. Másodszor két Arabidopsis desaturáz mutáns LC-MS és GC-FID alapú FA profilozását végeztük el a levelek és magvak, divat6 és divat7. A GC-FID eredményeink összehasonlíthatók voltak a korábban közöltekkel (Tallózás et al., 1986, 1989). Az LC ‐ MS hasonló eredményei azt mutatták, hogy a javasolt módszerünk alkalmazható az FA-k mérésére. Ráadásul rámutatott az FA-profilok korábban nem jelentett különbségeire, és ezzel demonstrálja az elfogulatlan LC-MS-alapú profilalkotás nagy érzékenységét és széles körű lefedettségét. A módszer egy korábban jelentett lipidanalízis eljárás kiterjesztése (Giavalisco et al., 2011). Kombinálva lehetővé teszik az FA és a lipid profilját ugyanazon a mintán. Ezt a jellemzőt a két deszaturáz-mutáns lipidprofiljai szemléltetik, és a megfelelő FA-profilokat figyelembe véve tárgyalják.

Az MS-alapú megközelítések egyik fő előnye az új vagy atipikus FA-k lehetséges felfedezése, a kimutatás céltalan jellege miatt. Itt fedeztük fel a kovaföldek FA sokféleségét. Profiloztunk Thalassiosira pseudonana és Biddulphia biddulphiana, amelyhez kiemelkedő számú FA-t találtunk.

Eredmények és vita

A 13 C izotóp jelölés lehetővé teszi a zsírsavak jelölését

Korábban a lipidprofilozás módszerét alkalmaztuk LC-MS-alapú megközelítéssel növényekre és algákra (Giavalisco et al., 2011; Bromke et al., 2013). Itt leírjuk a módszer kiterjesztését, amely lehetővé teszi a lipidek és az FA-k elemzését egy mintából, egy LC-MS összeállítás és egy standard protokoll felhasználásával. Ennek érdekében az extrahált lipideket hidrolizáljuk (a 4. szakaszban leírtak szerint), és LC-MS elemzésnek vetjük alá. Az annotáció elősegítése érdekében a légköri 12 CO2 jelenlétében termesztett Arabidopsis növényekből származó mintákat összehasonlítjuk a 13 CO2 jelenlétében növesztett mintákkal. Ez lehetővé teszi a szénatomok számának közvetlen következtetését az analitban (1a. Ábra). Amint az 1b. Ábrán látható, pozitív összefüggést figyelhetünk meg a retenciós idő és az FA hossza között, valamint a telítettség mértéke és a retenciós idő közötti összefüggést. Az annotáció további validálását a fent említett három kritérium alapján a kereskedelemben kapható FA-szabványok alkalmazásával végeztük (vö. S1. Táblázat). Összesen 20 különböző FA-t jegyeztek fel, amelyek közül néhányat korábban nem jelentettek az Arabidopsis-ban (3. ábra; Devaiah et al., 2007; Li ‐ Beisson et al., 2013).

A módszer kémiai validálása.

a) Példa a kromatogramokra és az eltolás m/z 13 C-jelölt növény kivonatában megfigyelt ionok esetében.

(b) A megfigyelt megoszlása m/z értékek és az analitok retenciós ideje.

Az LC ‐ MS és a GC-FID összehasonlítása két deszaturáz kiütéses mutáns levelének és magjának kivonatával

Két EMS deszaturáz mutáns, divat6 és divat7, korábban elemezték a GC ‐ FID (Tallózás et al., 1986, 1989). A FAD6 enzim egy kloroplaszt-lokalizációjú ω-6 FA deszaturáz, amely felelős a galaktolipidekbe, szulfolipidekbe és foszfolipidekbe kötött FA16: 2 és FA18: 2 FA szintéziséért. A FAD7 egy kloroplasztikus ω-3 deszaturáz, amely egy harmadik kettős kötést vezet be a lipidhez kötött FA-k aciláncaiban, így FA16: 3 és FA18: 3. Az analitikai eljárás érvényességének tesztelése érdekében elemeztük divat6 (SALK_118972) és divat7 (SALK_049635) homozigóta Arabidopsis T-DNS inszerciós vonalak FA-összetételükhöz. A klasszikus GC-FID és LC-MS módszereket egyaránt használtuk, az alábbiakban leírtak szerint.

Mindkét EMS vonal FA összetételének összehasonlítása (Tallózás et al., 1986, 1989) és a megfelelő SALK mutánsok azt mutatják, hogy a GC-FID-alapú eredményeink összhangban vannak a korábban közzétett adatokkal (2a, b ábra).

Zsírsavprofilok összehasonlítása GC-FID segítségével.

a) A SALK zsírsavszintjének oszlopdiagramja divat6 mutáns levelek összehasonlítva az EMS zsírsavprofiljaival divat6 mutáns, amelyet a Browse keres et al. (1989). A sávok az átlagokat és a szórásokat jelentik.

b) A SALK zsírsavszintjének oszlopdiagramja divat7 mutáns levelek összehasonlítva az EMS két zsírsavprofiljával divat7 különböző hőmérsékleten növesztett mutáns, a Browse leírás szerint et al. (1986). Összehasonlítás céljából az FA16 irodalmi értékei: 1‐cisz és FA16: 1‐ford összevonták.

A SALK levél és mag zsírsavprofiljai divat6 és divat7 mutánsok GC-FID és LC-MS alkalmazásával. A hőtérképek a mutáns FA2 szintjének log2-transzformált arányát mutatják be a vad típushoz viszonyítva.

A levélkivonatokat (a) és a magkivonatokat (b) LC-MS-sel és GC-FID-vel mértük. A GC-FID eredményekben az FA16: 1 (összesen) jelenti ennek a savnak az összesített izomerjeit. A szürke területek a kimutatási szint alatti méréseket jelentik. A kimutatott, de a szint alatti kvantifikációs elemzéseket „nyomnak” jelöltük. A csillagok jelzik a Tukey őszintén szignifikáns különbségtesztjének eredményeit: *P

Mint a divat6 mutáns, a SALK GC-FID mérése divat7 Az FA-k összhangban vannak a gén EMS-mutánsának korábbi méréseivel (Tallózás et al., 1986). Az LC ‐ MS analízissel megfigyeltük a prekurzorok (FA16: 2 és FA18: 2) felhalmozódását és a termék FA-k csökkenését divat7 levelek. Sőt, az FA20: 2 szint több mint 50% -kal nőtt a levelekben divat7. Ennek a génnek a mutációja is befolyásolja a divat7 magok (3B. ábra). A levelekhez hasonlóan ez az FA16: 2 szubsztrátum felhalmozódásához (10-szeres növekedés) és az FA16: 3 termék kimerüléséhez vezet (hétszeres csökkenés). Ezenkívül megfigyeltük mindhárom FA16: 1 izomer enyhe felhalmozódását ezekből a magokból készült kivonatokban (S2. Ábra). Végül a divat7 mutáció vezetett az FA18: 0, FA18: 1 és FA18: 2 felhalmozódásához.

A levelekben divat7 a kloroplasztikus ω-6 deszaturáz hiánya az MGDG34/36: 4 és az MGDG34/36: 5 felhalmozódásához, valamint az MGDG34: 6 körülbelül kétszeres csökkenéséhez vezet, amely az MGDG34: 5 után a második leggyakoribb MGDG-vé válik. Hasonló változásokat figyeltek meg a DGDG és az SQDG lipidosztályokban divat7. Ez összhangban van az FA18: 3 teljes levél 20% -kal csökkentett tartalmával és annak szubsztrátjának, FA18: 2 felhalmozódásával ebben a mutánsban (3. ábra). Ezeknek az FA-knak, valamint a plaszidos lipidekbe beépített FA-k összmennyiségének összehasonlítható változásáról korábban a Browse számolt be et al. (1986).

Két kovafaj céltalan zsírsavprofilozása

A kimutatott zsírsavak eloszlása és a fõ zsírsavtartalom összehasonlítása a kovafélékben Thalassiosira pseudonana és Biddulphia biddulphiana.

(a) A kovaföldi kivonatokban kimutatott zsírsavakat azoknak megfelelően ábrázoltuk m/z értékek és retenciós idők. A fedett szimbólumok mindkét fajban megtalálható zsírsavakat jelentik.

b) Négy fő zsírsav oszlopdiagramja mindkét fajban. A sávok az összes észlelt zsírsav medián százalékát jelentik, a hibasávok pedig a szórást (n = 5).

Következtetés

Kísérleti eljárások

Kiütéses mutáns vonalak: szelekció, genotipizálás és növekedési körülmények

Lipid és zsírsav extrakció

LC ‐ MS elemzés

A lipidprofilozáshoz az LC ‐ MS elemzést ugyanazzal a beállítással végeztük, mint fentebb az FA profilozásnál, pozitív és negatív ionizációs módok felhasználásával. A kromatogramok feldolgozását, a csúcsdetektálást és az integrációt finomító ms 7,5 alkalmazásával hajtottuk végre. A tömegspektrometriás adatok feldolgozása magában foglalta a fragmentációs információk és az izotópcsúcsok, valamint a kémiai zaj eltávolítását. A kapott tulajdonságok (m/z egy bizonyos retenciós időben) a házon belüli lipidadatbázissal kérdezték további annotálás céljából. A fennmaradó ismeretlen funkciókat egy másik online adatbázissal ellenőriztük a GoBioSpace adatbázis kereső eszközzel. A lipidprofilozás részletes eljárásait a Giavalisco írta le et al. (2011).

GC ‐ FID elemzés

A GC-FID analízishez az FA kivonatokat teflon csavaros kupakkal ellátott üvegcsövekben N2 áramban szárítottuk. A szárított anyagot 1 ml 1 N sósav/metanol oldatban (Sigma-Aldrich) újraszuszpendáljuk. Belső standardot (100 μl FA15: 0, pentadekánsav) adtunk minden mintához, mielőtt 80 ° C-on inkubáltuk volna vízfürdőben 30 percig. Szobahőmérsékletre történő lehűlés után 1 ml 0,9% NaCl-ot és 1 ml 100% hexánt adunk mindegyik fiolához. Az injekciós üvegeket 5 másodpercig rázattuk és 4 percig centrifugáltuk 21000-nél g. A felső FAME-tartalmú hexánfázist egy új üvegcsébe helyeztük, ahol N2-áramban bepároltuk. Végül a FAME-ket feloldottuk hexánban, és GC üvegcsékbe töltöttük. A GC-FID módszer részletei a következők: az injektor hőmérséklete 250 ° C; héliumhordozó gáz; fejnyomás 25 cm s -1 (11,8 psi); GC oszlop, J&W DB23 (Agilent, http://www.agilent.com), 30 m × 0,25 mm × 0,25 μm; detektor hőmérséklete 250 ° C; detektorgáz H2 40 ml min −1, levegő 450 ml min −1, ő pótgáz 30 ml min −1 .

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Aenne Eckardtnak az LC ‐ MS mérésekhez nyújtott segítségét és Ina Krahnertnek a GC ‐ FID mérésekhez nyújtott segítségét. A Max Planck Társaságot elismerték pénzügyi támogatásukért. A szerzőknek nem jelentenek be összeférhetetlenséget.

Fájlnév Leírás

tpj12739-sup-0001-FigS1.tifimage/tif, 884,3 KB	S1. Ábra. Az Arabidopsis leveleinek zsírsavtartalmának oszlopdiagramja LC-MS-vel mérve.
tpj12739-sup-0002-FigS2.tifimage/tif, 840,5 KB	S2. Ábra. Az Arabidopsis magjainak zsírsavtartalmának oszlopdiagramja LC-MS-vel mérve.
tpj12739-sup-0003-FigS3.tifimage/tif, 2,3 MB	S3. Ábra. A lipidek oszlopdiagramja a levelekben divat6 és Col ‐ 0 LC ‐ MS-vel mérve.
tpj12739-sup-0004-FigS4.tifimage/tif, 2,3 MB	S4. Ábra. A lipidek oszlopdiagramja a levelekben divat7 és Col ‐ 0 LC ‐ MS-vel mérve.
tpj12739-sup-0005-TableS1.docWord dokumentum, 50 KB	S1. Táblázat. LC-MS-sel Arabidopsis-ban kimutatott zsírsavak táblázata.
tpj12739-sup-0006-TableS2.docWord dokumentum, 92,5 KB	S2. Táblázat. Táblázat az LC-MS-ben két kovafajban kimutatott zsírsavakról.
tpj12739-sup-0007-legends.docxWord dokumentum, 14,3 KB

Kérjük, vegye figyelembe: A kiadó nem felelős a szerzők által szolgáltatott bármilyen kiegészítő információ tartalmáért vagy működéséért. Bármilyen kérdést (a hiányzó tartalom kivételével) a cikk megfelelő szerzőjéhez kell irányítani.