Genotipizálás és diagnosztikai módszerek a hepatitis C vírushoz: Alacsony erőforrású országokra van szükség

Anoop Kumar

Nemzeti Biológiai Intézet, Noida, India

Manoj Kumar Rajput

Nemzeti Biológiai Intézet, Noida, India

Deepika Paliwal

Nemzeti Biológiai Intézet, Noida, India

Aakanksha Yadav

Nemzeti Biológiai Intézet, Noida, India

Reba Chhabra

Nemzeti Biológiai Intézet, Noida, India

Surinder Singh

Nemzeti Biológiai Intézet, Noida, India

Absztrakt

Bevezetés

A hepatitis C vírus (HCV) fertőzés az egyik legnagyobb egészségügyi kihívássá vált, és becslések szerint 200 millió HCV-fertőzött ember fedi le a világ népességének körülbelül 3,3 százalékát, és évente körülbelül 350 000 halálesetet okoz 1, 2. A HCV-fertőzés vér által terjedő fertőzés, amely elsősorban májfibrózist okoz, amely májcirrhosissá és májrákká fejlődik 3. Az alacsony erőforrásokkal rendelkező régiók, például India, Kelet-Ázsia, Észak-Afrika és a Közel-Kelet hozzájárulnak a HCV-fertőzés globális terheinek 80 százalékához 4. A világ HCV-fertőzött lakosságának körülbelül kilenc százaléka Indiában él, és a HCV-fertőzöttek jelentős részét (

A HCV anti-HCV antitesteket alkalmazó szerológiai vizsgálatokkal és molekuláris tesztekkel detektálható a HCV RNS 17. szekvenciájának komplementer molekulaszondákkal. Az 1940-es és 1945-ös Drugs and Cosmetics Act és az azok szabályai szerint Indiában kötelező a véregységek szűrése harmadik generációs szerológiai vizsgálatokkal 18. Negyedik generációs, nagyobb érzékenységű szerológiai vizsgálatok állnak rendelkezésre, amelyek azt állítják, hogy csökkentik az ablak periódusát. A molekuláris vizsgálatok nemcsak a korai diagnózisban segítenek, hanem megerősítik a fertőzés szakaszát is. A HCV diagnózisa és mennyiségi meghatározása rendkívül érzékeny és specifikus módszerekkel döntő szerepet játszik a HCV fertőzés kezelésében. Beszámoltak arról, hogy a HCV különböző genotípusai eltérően reagálnak az anti-HCV terápiára 19. Ezek a genotípusok genomiális szintjükben különböznek egymástól. A HCV genomjának replikációs folyamata során hajlamos a transzkripciós variációkra. Ezenkívül a HCV genomja a globalizáció következtében folyamatosan fejlődik. Ez az áttekintés összefoglalja a HCV molekuláris diagnosztikai módszerekkel és azok alkalmazásával kapcsolatos információkat a világ különböző részein.

A HCV genomszervezése és működése

A hepatitis C vírus genomszervezésének sematikus ábrázolása. A teljes genom egy poliproteint kódol, amelyet további három szerkezeti [mag (C), burkoló fehérje (E1 és E2)] és öt nem strukturális fehérje [NS1, NS2, NS3, NS4 és NS5] alakít fel; A fehérje helyzetét számok mutatják a séma felső részén. Ábra módosítva és reprodukálva a 20. hivatkozás engedélyével.

A hepatitis C vírus természetes története

A vírus perzisztenciájának és az átvitel módjának megértése fontos a HCV fertőzés megelőzésében. A HCV általában fertőzött vér transzfúziója, védtelen, magas kockázatú szexuális aktivitás, szervátültetés útján terjed a fertőzött donortól és az anyától a magzatig. A továbbfejlesztett szűrési módszerek alkalmazásával a HCV-átvitel 0,0002-ről 0,00005% -ra történő csökkenését figyelték meg a fejlett országokban 41, 42, 43 .

HCV genotípusok, altípusok és anti-HCV terápia

Amint azt korábban említettük, a HCV-törzseket hét genotípusba sorolják a HCV-genomok filogenetikai és szekvencia-elemzése alapján, és az egyes genotípusokon belül a HCV-t további 67 46 altípusba sorolják. Indiában a 3. genotípus az uralkodó genotípus (

63,85%), amelyet az 1. genotípus követ (25,72%). A HCV 3. genotípusa inkább India északi, keleti és nyugati részén, az 1. genotípus pedig inkább India déli részén fordul elő 47. Annak ellenére, hogy a 3. és 1. genotípus elterjedt, az ország egyes régióiban a 4. és a 6. genotípus prevalenciája is megnő. A 4. genotípus főleg Andhra Pradesh és Tamil Nadu államok déli indiai betegekénél található meg. Úgy találják, hogy a 6. genotípus elterjedt az India északkeleti részeihez tartozó betegeknél 48. Szintén megfigyelték a 6. genotípus elterjedtségét a szomszédos Mianmar különböző részein, amelyek megosztják a határait India északkeleti államaival 49. A 2. genotípust ritkán jelentik, míg az 5. genotípust még Indiából kell jelenteni 47 .

Az új gyógyszerek orvosi kutatásának és klinikai kísérleteinek előrehaladtával a HCV-fertőzés kezelése a pegilezett interferon/ribavirin helyett a közvetlen hatású antivirális (DAA) kombinált terápiákra vált. Ezek a DAA-k megcélozzák és gátolják a HCV replikációs útjának legfontosabb szakaszait. A DDA-kat hatásmechanizmusuk és céljuk alapján négy osztályba sorolják (táblázat).

asztal

Közvetlen hatású vírusellenes szerek (DDA) osztályai, jóváhagyva/klinikai vizsgálatok alatt

HCV genotipizálási módszerek

A diagnózisra szánt HCV genotípusát leginkább a genomi nukleotidszekvencia szekvenálásával vagy kit-alapú vizsgálatokkal határozzák meg, amelyek komplementer próbákat alkalmaznak a mintában jelenlévő genotípus jelentésére. Az erősen konzervált régiók, például az NS5, a mag, az E1 és az 5’UTR szekvenálása a legelismertebb módszer a HCV 61 genotipizálásához. A készlet alapú vizsgálatok könnyen használhatók, és nem igényelnek szekvenáláshoz szükséges szakértelmet. A TruGene 5’NC HCV genotipizáló készlet (Siemens Healthcare Diagnostics Division, Tarrytown, NY) és a Versant ™ HCV Genotype Assay LiPA (I. verzió, Siemens Medical Solutions, Diagnostics Division, Fernwald, Németország) az 5’UTR szekvencián alapul. Mindkét készlet fordított hibridizációt alkalmaz 62 genotípus-specifikus oligonukleotid szondákkal. Mindkét készlet azt állítja, hogy kimutatja az 1–6. HCV genotípusokat. Abbott RealTime HCV II. Genotípus A készlet azt állítja, hogy az 1–5. Genotípusokat észleli. A Roche által gyártott cobas® HCV GT, amelyet a Roche gyárt. HCV genotípus-állítás szerint az 1–6. és b genotípus-1. Teljesen automatizált rendszer, a cobas® 4800 (Roche, USA) is elindult a HCV genotipizálásához. A HCV genom három régiója, az 5’UTR, a Core és az NS5B komplementer próbákat beépítették a genotipizálás és az altípus-pontosság érdekében.

Duarte és mtsai 63 kifejlesztették az xMAP Luminex assay rendszert, egy folyékony mikroarray-alapú HCV genotipizálási módszert. A legtöbb variábilis régióval, az NS5B-vel és az erősen konzervált 5'UTR-sel szembeni komplementer szekvenciákat használtuk a HCV genotípusok meghatározásához. A bemutatott eredmények 100% -ban összhangban voltak a Versant ™ HCV Genotype Assay LiPA-val. Két nagy áteresztőképességű módszert is kifejlesztettek, például a LightCycler® rendszereket, amelyek a metlting görbe elemzésén alapultak (64, 65) és mátrix-segített lézeres deszorpciós ionizációs repülési idő (MALDI-TOF) technológiát alkalmaztak 66. Athar és mtsai 67 valós idejű polimeráz láncreakció (PCR) alapú vizsgálatot fejlesztettek ki a HCV genom magrégiójának két kettősen jelölt önmegoltó próbájának felhasználásával. A HCV mag régiójának specifikus próbáit alkalmazták, és a pontos HCV genotípusokat az RT PCR 67-ben a megfelelő próbákból származó olvadási görbékkel lehetett meghatározni. .

További alternatív HCV genotipizálási módszerek az amplifikáció típus-specifikus primerekkel vagy típus-specifikus 68-as, 69-es próbákkal, restrikciós fragmens hosszúságú polimorfizmus (RFLP) elemzés 70, vonal-szonda teszt 71 és heteroduplex mobilitás elemzés 72, 73 .

A HCV diagnosztikai módszerei

A HCV fertőzés szerológiai módszerekkel és molekuláris módszerekkel mutatható ki (2. ábra) 74. A HCV-fertőzés pontos diagnosztizálása fontos a terápia megkezdése előtt. A diagnózis a HCV-fertőzés stádiumának megismerése szempontjából szintén döntő fontosságú, mert a HCV-fertőzés 6-12 hónapon belül megtisztul a fertőzött személyek 15-45 százalékánál, és ezek az egyének továbbra is anti-HCV antitest-pozitívak maradnak kimutatható viraemia nélkül. Ilyen esetekben az orvosoknak különbséget kell tenniük a fertőzött és a gyógyult személyek között 75. Korábban a HCV-fertőzés ELISA-val végzett szerológiai reaktivitását rekombináns immunoblot assay (RIBA) módszerrel igazolták. A RIBA-t a HCV-fertőzés diagnosztizálásának megerősítő módszereként szüntették meg. Manapság a nukleinsav-tesztet (NAT) tekintik az aktív HCV-fertőzés megerősítésének arany standardjának 76. A NAT a HCV RNS vagy HCV genom kimutatásán alapul.

Algoritmus a hepatitis C vírus tesztelésére. A HCV antitest (Ab) kimutatását laboratóriumi vizsgálattal végezzük. A HCV Ab pozitív minták további vizsgálata jelenlegi vagy korábbi HCV fertőzést vagy hamis HCV antitest pozitivitást mutat. A pozitív mintákat nukleinsav-alapú teszteléssel (NAT) kell tesztelni, mivel a pozitív jelzi a jelenlegi HCV-fertőzést, a negatív pedig a múltbeli vagy megoldott HCV-fertőzést, vagy hamis Ab-pozitivitást. Módosítva és reprodukálva a 71. hivatkozásból.

Szerológiai vizsgálatok a HCV diagnózisához

A HCV diagnosztizálható az anti-HCV antitest kimutatásával a szérum- vagy plazmamintákban, ahol a nem reaktív eredmény a HCV-fertőzés hiányának tekinthető. Továbbá, hogy a HCV-fertőzést aktív fertőzéssé nyilvánítsuk, ezt HCV RNS-vizsgálattal kell megerősíteni. A HCV-fertőzés kimutatására használt vizsgálatokat úgy fejlesztették ki, hogy minimalizálják a hamis pozitívok számát, javítva a specifitásukat. A HCV-szerológiai vizsgálatok egymást követő generációi nemcsak javították az érzékenységet és a specificitást, hanem csökkentették a fertőzés kimutatásának időtartamát 77, 78, 79 .

Első generációs vizsgálat: Ezek anti-HCV antitest és rekombináns fehérjét tartalmazó NS4 (C100-3) epitópiás régió megkötésén alapultak. Ezek a vizsgálatok a transzfúzió utáni esetekben körülbelül 80 százalékos anti-HCV IgG-t tudtak azonosítani; ezért érzékenységük és specifitásuk nagyon alacsony volt 80. A hamis pozitivitásuk aránya az alacsony kockázatú populációkban akár 60 százalék is.

Második generációs vizsgálatok: A magból (strukturális), az NS3-ból és az NS4-ből származó rekombináns fehérjéket használtuk kötő fehérjeként anti-HCV antitesttel. Ezekről a vizsgálatokról beszámoltak arról, hogy jobb érzékenységgel és specifitással rendelkeznek. A második generációs vizsgálatok 10-24 hét hétre csökkentették a HCV időtartamát .

Harmadik generációs vizsgálatok: Az immunszorbens a mag, NS3, NS4 és NS5 régiók rekombináns fehérjéit tartalmazza. A vizsgálatok ezen kategóriájához több mint 99 százalékos diagnózis-specifitást jelentettek 81. A harmadik generációs vizsgálatok hamis negatív eredményeket mutathatnak immunhiányos vagy hemodialízis alatt álló betegeknél 62. Indiában, a Drugs and Cosmetics Act, 1940 és 1945 szerint, a harmadik generációs szerológiai vizsgálatok használata kötelező a véradók egységeinek átvizsgálására a HCV fertőzés szempontjából a transzfúzió előtt 67 .

Negyedik generációs vizsgálatok: A negyedik generációs tesztek más néven „antigén-antitest kombinációs tesztek” néven is ismertek, mivel ezen vizsgálatok alapja az anti-HCV antitest és a HCV antigén egyidejű kimutatásán alapul. Ezek a vizsgálatok nagyon érzékenyek és felelősek az ablakidő magas csökkenéséért. Az átlagos ablakidő 26,8 nap ezeknél a vizsgálatoknál 79 .

Korábban a CDC szerint a pozitív szerológiai tesztet végző személyt az RIBA-val kellett megerősíteni HCV-fertőzés miatt, de most HCV RNS nukleinsav-tesztet alkalmaznak az aktív HCV-fertőzés megerősítésére 76 .

Rekombináns immunblot-vizsgálatok (RIBA)

Az RIBA-t korábban használták a HCV fertőzés megerősítésére, és az anti-HCV antitest kimutatásán alapult immobilizált HCV antigénnel és szintetikus peptiddel strukturális (mag) és nem strukturális (NS3 és NS5) fehérjékből, mint egyedi sávok egy membrán. Legalább két sáv megjelenését tekintették a megerősített fertőzés indikátorának, az egyetlen sáv megjelenését pedig határozatlan eredménynek. Határozatlan esetek a nem specifikus keresztreakciót okozó antitestek miatt következtek be, vagy a széleskörű humorális választ nem váltotta ki a közelmúltbeli fertőzés. Általában egy hetes HCV-fertőzött egyének eredményei határozatlanok voltak, akik 1-6 hónapos fertőzés után megerősített esetekké alakulhatnak 82 .

Gyors vizsgálatok

A gyorstesztek úgy vannak konfigurálva, hogy fél órán belül eredményt adjanak, és felhasználhatók az ápolás helyén történő tesztelésre. Ezek a vizsgálatok nem igényelnek kifinomult műszert és magasan képzett személyzetet. Három gyorstesztet (Orasure, Chembio és Medmira) anti-HCV IgG-re értékelt a CDC laboratóriumi és terepi körülmények között. E vizsgálatok sajátosságai és érzékenysége> 99%, illetve 86-99%, illetve 83 volt. A szerológiai vizsgálatok fő hátránya, hogy képtelenek megkülönböztetni az aktív és nem aktív fertőzést. A szerológiai vizsgálatok pozitív eredményt mutatnak az anti-HCV IgG jelenléte miatt, még a vireemiás részecskék immunrendszer általi eltávolítása után is. Ezen vizsgálatok másik hátránya a nagy ablakperiódus. Ebben az időszakban a HCV RNS az első kimutatható diagnosztikai marker, amelyet a mag antigén diagnosztikai marker követ. Az anti-HCV antitest létrehozását ez a két diagnosztikai marker követi. Ennek a hátránynak köszönhető, hogy az Egyesült Államok vérbankja az 1990-es évek végén átvette a nukleinsav-alapú tesztet (NAT) a HCV diagnosztizálásának arany standard módszereként 84, és a NAT megvalósítása miatt a transzfúzióval kapcsolatos HCV-fertőzés kockázata 0,0001 százalék az USA-ban 6 .

Nukleinsav-teszt (NAT)

A NAT molekuláris technika, amely a vírus nukleinsav amplifikációján és kimutatásán alapul. A NAT csökkenti a transzfúzióval átvitt fertőzések (TTI) kockázatát; ezért további biztonsági réteget ad a vérnek a transzfúzióhoz. Kétféle technológiát, a PCR-t és a transzkripció által közvetített amplifikációt (TMA) szokásosan alkalmazzák a véradás NAT tesztelésére a HCV-fertőzés szempontjából. A nukleinsav-vizsgálat fő előnye a HCV-fertőzés korai felismerése. A fertőzött mintákban található HCV RNS a kezdeti expozíciót követő egy héten belül kimutatható 19. A magas érzékenység és specifitás miatt a NAT-ot használjuk a minták felbontására, amelyek szerológiai módszerekkel meghatározatlanok vagy téves negatívak. .

Roth és mtsai 86 3000 NAT-hozamról számoltak be 37 országban mintegy 300 millió HIV-vírus és HCV-véradás, valamint HBV-fertőzés miatt mintegy 100 millió véradás NAT-tesztelésével kapcsolatos nemzetközi felmérésben. Ezekről a véradásról a szerológiai szűrési módszerek szerint 86 nem reagáltak .

NAT vérszűrési tapasztalatok alacsony erőforrásokkal rendelkező országokban

Felismerve a NAT-teszt szükségességét és előnyeit, az alacsony forrásigényű országok a véradás szűrésére nemzeti vagy központos szintű NAT-teszteket is végrehajtanak. 2007-ben a thai vérközpontban a NAT 486 676 szeronegatív véradást szűrött át. A HIV-1, a HCV és a HBV NAT-hozama 1: 97 000, 1: 490 000 és 1: 2800, 87. Észak-Indiában, egy vérbanknál, 73 898 véradást vizsgáltak HIV, HBV és HCV szempontjából ELISA-val és egyedi donor-nukleinsav-amplifikációs teszttel (ID-NAT). Az összes adományból 1104 (1,49%) adományt talált pozitívnak a multiplex NAT. Ezenkívül 37 HCV, 73 HBV, egy HIV és 10 HBV-HCV együttfertőzött esetről számoltak be NAT-tesztek, akik az ELISA-teszt során 88 nem reagáltak. Indiában a különböző központok különböző csoportjai a NAT különböző hozamrátáiról számoltak be a HCV-fertőzéssel kapcsolatban. Az Agarwal és mtsai 88 által közölt NAT-hozam 610-ből 1 volt. Kumar és mtsai 89 753-ból 1, Mangwana és Bedi 90 pedig 974-ben 1-ben számoltak be. Brazíliában 2005 júliusáig 139 678 adományt szűrtek át 6-12 adományból álló készletben. házon belüli RT-PCR módszer, amelynek érzékenysége 500 NE/ml a HCV mind a hat genotípusára. A 139 678 adományból 315 (0,23%) pozitívnak bizonyult a HCV RNS 91 szempontjából .

A NAT teszt elvégezhető egyéni adományok (ID-NAT) vagy min-poolok (MP-NAT) esetén. Mini medence elkészíthető 6, 8, 16 vagy 24 egyedi adomány összegyűjtésével. Bár a NAT nagyon előnyös a megvalósításához szükséges nagyobb beruházások miatt, az alacsony forrásigényű országok, például India, nem képesek kötelezővé tenni a TTI-k vérvizsgálatához. A vérszűrés költséghatékonyabbá tétele érdekében a különböző megyék és intézmények 6, 8, 16 és 24 tagú mini-medencéket használnak. Németországban az MP-NAT 1997-es bevezetése után 23 HCV, 2 HIV-1 és 43 HBV fertőzött volt körülbelül 31 millió véradás során észleltek véradást 92. A NAT adatelemzése alapján Mathur és mtsai 93 kimutatták, hogy a NAT költséghatékonnyá tehető indiai pooling módszerrel (mini-poolok). Van néhány hátránya a mini-pooloknak a NAT tesztelésében; egyrészt a vírusos kópiaszám hígítása csökkenti az érzékenységet. Másodszor, ha egy készlet reaktívnak bizonyul, akkor az összes egyesített adományt meg kell vizsgálni az egyedi pozitív adomány azonosítása érdekében. Ezért e korlátok leküzdésére az ID-NAT tesztelését javasolták.

A HCV-fertőzés NAT-val történő vizsgálata RNS-detektálására PCR vagy TMA vagy elágazó láncú dezoxiribonukleinsav (bDNS) jelerősítéssel történik. A HCV NAT tesztelési technológiájában a magasan konzerválódott 5 ’UTR HCV genomot használják célszekvenciaként annak kimutatására 94. Ez a régió konzerválódott a HCV összes genotípusa között; ezért a primereket úgy tervezték, hogy hibridizálódjanak a lehető legkisebb eltérésekkel hat különböző HCV genom között. A NAT tesztkészlet-gyártók többsége csak a berendezésükkel kompatibilis vizsgálatot fejlesztett ki. A HCV NAT teszteléséhez minden típusú kézi, félig automatizált és teljesen automatizált platform elérhető. A kutatólaboratóriumokban a kvalitatív HCV-NAT-ot diagnosztizálják a hagyományos RT-PCR alkalmazásával, de a diagnosztikai laboratóriumok elkezdték használni a HCV diagnosztizálására szolgáló készleteket.

A kvalitatív NAT-ot alkalmazták a véradás során a HCV-fertőzés szűrésére és a 95-es betegek virémia megerősítésére. Az ≤50 NE/ml kimutatási alsó határt különböző gyártók állítják kvalitatív molekuláris módszereik miatt. Másrészt a HCV-betegség prognózisának vírusterhelés-meghatározása kvantitatív RT-PCR és bDNS technológiával valósítható meg.

A HCV előfordulása Indiában magasabb volt, mint Nyugat-Európa és az USA 96. Az indiai népesség különböző csoportjai által jelentett HCV prevalencia 4138 90-ből 1, 1997-ben 1 88 és 2536 1 89 .

Bár a NAT csökkenti az indiai környezetben a TTI-k, például a HCV kockázatát, a kötelező végrehajtásának vannak bizonyos korlátai. Indiában a NAT használatát a szokásos gyakorlatokban korlátozták a magas költségek, a technikai igények, például a képzett munkaerő vagy a felszerelés fogyóeszközei miatt 97. 2014-ben a Chandrashekar 98 házon belüli vizsgálatot dolgozott ki a vér biztonságáért, minimális költséggel. Ezt a vizsgálatot megvalósíthatónak találták egy kis molekuláris biológiai egységben, bármilyen típusú vérbankban 98 .

A NAT bevezetése az ablakperiódus-adományok felderítésére 300–3 000 000 véradás során körülbelül három életet menthet meg a fejlett országokban, míg az olyan fejlődő országokban, mint India, ez 300–3000-szer előnyösebb lehet, mint a fejlett országokban 90 .

Következtetés

A HCV nukleinsav-alapú vizsgálata körülbelül egy hétre csökkentette az ablakperiódust. Ez a technika bebizonyította haladását és igényeit a hagyományos szerológiai módszerekkel szemben 99. Ezért a NAT megvalósítása nagy haszonnal jár az alacsony forrásigényű országok számára a HCV magas előfordulása miatt.