Guarana (Paullinia cupana) serkenti a mitokondriális biogenezist az egerekben táplált magas zsírtartalmú étrendben

Absztrakt

1. Bemutatkozás

Az elhízás világszerte jelentős közegészségügyi probléma, és összefügg az epigenetikus tényezőkkel, a zsírban és cukorban gazdag feldolgozott élelmiszerek túlzott fogyasztásával és a fizikai aktivitás hiányával. Az Egészségügyi Világszervezet (WHO) a túlsúlyt és az elhízást kóros vagy túlzott zsírfelhalmozódásként határozza meg, amely hozzájárul más betegségek, például cukorbetegség, magas vérnyomás, valamint vese- vagy koszorúér-problémák kialakulásához [1,2].

Az energia-anyagcserét az energiafelhasználás és a táplálékfelvétel határozza meg, amelyeknek egyensúlyban kell lenniük a testsúly fenntartása érdekében. A vázizom a celluláris bioenergetikával összefüggésben célszerv a glükóz homeosztázisban és az inzulinérzékenységben betöltött fontos szerepe miatt [3,4]. Így gyakori, hogy az elhízott alanyok esetében, akik normál esetben növelik a testzsír-tömeget és csökkennek a zsírmentes tömeg, csökken az energiafelhasználás.

Az 1-alfa (Pgc1α) peroxiszóma-proliferátor által aktivált receptor gamma koaktivátor felelős a mitokondriális biogenezis, az oxigénfogyasztás és az oxidatív foszforiláció szabályozásáért, a mitokondriális tömeg növekedésével, az adaptív termogenezis számos kulcsfontosságú komponensének aktiválásával és az energiafelvétel stimulálásával. lehetővé teszi a sejtek és szövetek alkalmazkodását nagy energiaigényű helyzetekhez [5]. A Pgc-1α-t poszttranszlációs módosítással szabályozzuk, ideértve a foszforilezést és a deacetilezést protein-kináz, AMP-aktivált (Ampk) és sirtuin 1 (Sirt1) alkalmazásával [6]. Ez a három gén alkot egy energiaérzékelő hálózatot, amely szabályozza a vázizomzat energiafogyasztását [7].

Az elhízás visszaszorítására számos stratégiát dolgoztak ki, és széles körben alkalmazták a termogén hatású funkcionális ételeket és/vagy bioaktív vegyületeket. A zöld teát összefüggésbe hozták a fogyással, az energiafogyasztás és a zsíranyagcsere modulációjával [8]. A gyömbércsaládba tartozó kurkumin fogyasztása növeli a termogén génexpressziót (például az 1-es fehérje (Ucp1) és a Pgc1a szétkapcsolása), és növeli az inguinalis fehér zsírszövet mitokondriális tartalmát [9]. Ezenkívül a HFD-vel és luteolinnal táplált C57BL6 egerekben természetes borsban, zellerben, kakukkfűben, borsmentában és loncban gazdag flavonoidot figyeltek meg, az oxigénfogyasztás növekedését, valamint a magasabb szén-dioxid-termelést és a légzéscsere arányát figyelték meg [10]. Ezenkívül a resveratrol csökkenteni tudta az oxidatív stresszt, helyreállította a mitokondriális funkcionális aktivitásokat és stimulálta az oxidatív foszforilációt és a mitokondriális biogenezis gén expresszióját magas zsírtartalmú étrendben táplált egerekben [11,12].

A guaranát (Paullinia cupana Kunth) súlycsökkenéssel társították, amely számos védőhatást mutatott a magas vérnyomás, az elhízás és a metabolikus szindróma ellen [13], az élelmiszer-bevitel csökkentésének képességét [14] és az adipogenezissel kapcsolatos gének modulálását [15]. Emellett már bebizonyosodott, hogy a guarana kivonat és a zöld tea keveréke, amely fix dózisú koffeint (200 mg) és változó dózisú epigallokatechin-3-gallátot (EGCG) tartalmaz, növelte az energiafelhasználást (metabolikus kamrában mérve a 24 órás energiafelhasználás) egészséges felnőtteknél [16]. Így vizsgálatunk célja a guaranával végzett orális kezelés elhízásra, anyagcserére és mitokondriális biogenezisre gyakorolt hatásainak és lehetséges mechanizmusainak vizsgálata volt.

2. Anyag és módszerek

2.1. Kísérleti terv

Asztal 1

A magas zsírtartalmú étrend összetétele.

Összetétel: Nagy zsírtartalmú étrendg kg −1 kcal kg −1

Kukoricakeményítő	115.5	462
Kazein	200	800
Szacharóz	100	400
Dextrinált keményítő	132	528
Disznózsír	312	2808
Szójabab olaj	40	360
Cellulóz	50	-
Ásványi keverék	35	-
Vitamin keverék	10.	-
l -cisztin	3	-
Kolin	2.5	-
TELJES	1000	5358

2.2. Közvetett kalorimetria

Az állatok alapenergia-felhasználását közvetett kalorimetriával értékeltük. Az eutanázia előtt 48 órával az egereket 24 órán át akklimatizáljuk egyedi anyagcsere-ketrecekben (OXYLET System - rágcsálók esetében), és további 24 órán át figyeljük. Az elfogyasztott O2 (VO2) és a termelt CO2 (VCO2) mennyiségét 25 percenként, 24 órán át mértük. A légzéscserét (RER) a következő képlet segítségével számoltuk ki: (RER) = VCO2/VO2. Az alapenergia-ráfordítást (EE) a következő képlet segítségével határoztuk meg: kcal/nap/kg 0,75 = 1,44 × VO2 × (3815 + 1232 × RER) [17].

2.3. Állati eljárás és szöveti boncolás

A táplálékfelvételt és a testsúlyt hetente mértük. A glikémiás, triglicerid- és koleszterinszinteket az Accutrend Plus (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Németország) specifikus csíkokkal határozta meg. A 8. hét végén az egereket (12 órás éhgyomorra után) 2% xilazin/10% ketamin (1 μl/testtömeg-gél) 1: 1-es oldatával altattuk, és a vérmintákat szívpunkcióval vettük fel. A zsírszövetraktárakat (szubkután, retroperitoneális, zsigeri és epididimális) feldaraboltuk és lemértük. A Gastrocnemius izom- és barna zsírszövet mintákat boncoltuk és -80 ° C-on tároltuk az elemzésig.

2.4. mRNS (Messenger robonukleinsav) expressziós elemzés

Izom mintákat használtunk a kvantitatív valós idejű PCR elemzéshez. A teljes RNS extrakciót, a komplementer DNS (cDNS) szintézist és a kvantitatív PCR-t a korábban leírtak szerint hajtottuk végre [18], specifikus primerek alkalmazásával (2. táblázat). Először az összes mintát háztartás 18S gén alkalmazásával normalizáltuk, majd a HFD-GUA csoportot HFD csoport normalizálta. A hajtásváltozás kiszámításához a 2 -ΔΔCt egyenletet használtuk.

2. táblázat

Valós idejű PCR-hez használt primerek.

GenePrimerSequence (5 ′ → 3 ′)

Sirt1	Érzék	AGTGGCACATGCCAGAGTC
Antisense	TCCAGATCCTCCAGCACAAT
Creb1	Érzék	TTTGTCCTTGCTTTCCGAAT
Antisense	CACTTTGGCTGGACATCTTG
Ampka1	Érzék	TGAGAACGTCCTGCTTGAATG
Antisense	ATCATTGGCTGAGCCACAGC
Ampka2	Érzék	ACAGGCCATAAAGTGGCAGT
Antisense	GTCGGAGTGCTGATCACGTG
Pgc1α	Érzék	CCGAGAATTCATGGAGCAAT
Antisense	TTTCTGTGGGTTTGGTGTGA
Nrf1	Érzék	CAACAGGGAAGAAACGGAAA
Antisense	CACTCGCGTCGTGTACTCAT
Nrf2	Érzék	AGGACATGGAGCAAGTTTGG
Antisense	TCTGTCAGTGTGGCTTCTGG
Ucp1	Érzék	TCAGGGCTGAGTCCTTTTGT
Antisense	CTGAAACTCCGGCTGAGAAG
Ucp3	Érzék	CTCACTTTTCCCCTGGACAC
Antisense	GTCAGGATGGTACCCAGCAC
18S	Érzék	AAACGGCTACCACATCCAAG
Antisense	CAATTACAGGGCCTCGAAAG

2.5. Mitokondriális DNS mennyiségi meghatározás (Mtdna)

A mitokondriális DNS (mtDNS) mennyiségi meghatározását kvantitatív valós idejű PCR-rel végeztük. Röviden, a DNS (dezoxiribonukleinsav) extrakciót (izom- és barna zsírszövetből) fenol/kloroform módszerrel hajtottuk végre. Ezután a valós idejű PCR-t Platinum ® SYBR GREEN® qPCR Supermix Uracil-DNS-glikoziláz (UDG) (Invitrogen, CA, USA) alkalmazásával végeztük a gyártó protokollja szerint. Az mtDNS kvantifikálásához mitokondriális Cox1-et (citokróm c-oxidáz I alegységet) (FW 5′-GCCCCAGATATAGCATTCCC-3 ′ és RV 5′-GTTCATCCTGTTCCTGCTCC-3 ′) és endogén kontrollként 18S rRGGTAGTTGT ′ És RV 5′-CGCTGAGCCAGTCAGTGT-3 ′). A valós idejű PCR-t 7500 valós idejű PCR-rendszerben (Applied Biosystems Foster City, Kalifornia, USA) hajtottuk végre, és az RQ Study Software (Applied Biosystems) alkalmazásával elemeztük. Az mtDNS-kópiák relatív kvantitatív meghatározását a DNSmt/nukleáris DNS arányával kaptuk meg, és a 18S háztartási génnel végzett normalizálás után a hajtásváltozást a következő egyenlet segítségével határoztuk meg: 2 ΔΔCt módszer.

2.6. Western Blotting elemzés

2.7. Statisztikai analízis

Az adatokat átlagértékekként ± SEM adjuk meg. A GraphPad Prism 5-t használták statisztikai elemzésekhez és grafikákhoz (GraphPad Software, Inc., San Diego, Kalifornia, USA). A kísérleti adatokat Student párosítatlan t tesztjével elemeztük. A testsúly elemzéséhez kétirányú varianciaanalízist (ANOVA) alkalmaztunk.

3. Eredmények és megbeszélés

Korábban bemutatták a guarana (Paullinia cupana) kivonat testtömeg-szabályozásra, táplálékfelvételre, a magas vérnyomás elleni védelemre, valamint az adipogenezis folyamathoz kapcsolódó egyes gének és miRNS-ek modulációjára gyakorolt hatásait [13,14,15]. Ezenkívül ebben a tanulmányban bebizonyosodott, hogy a guarana a termogenezis és a mitokondriális biogenezis fokozásával szabályozhatja a testtömeget.

(A) Testtömeg (g) magas zsírtartalmú étrend (HFD) -csoport (n = 6) és magas zsírtartalmú étrend + guarana (HFD-GUA) csoport (n = 6) kezelés nyolc hete alatt; (B) A HFD-csoport (n = 6) és a HFD-GUA-csoport (n = 6) táplálékfelvétele (g) a kezelés nyolc hete alatt; (C) Nyolc hetes kezelés után a szubkután zsírszövet, a Retro - retroperitoneális zsírszövet, a Visc - a zsigeri zsírszövet és az Epi - epididyimális zsírszövet zsírszövetraktárai (g); (D) Glikémia (mg/dL) 12 óra éhgyomorra; (E) Trigliceridek (mg/dl) 12 órás éhezés után; (F) Koleszterin (mg/dl) 12 órás éhezés után. A fekete vonal/sávok a HFD-csoportnak felelnek meg (n = 6), a szürke vonal/sávok pedig a HFD-GUA-csoportnak (n = 6). * p 2. A ábra), valamint EE (+ 20% a fényciklusban és + 16% a sötét ciklusban, p 2.B, C ábra) a HFD csoporthoz képest. Annak ellenére, hogy az egerek éjszakai aktivitást mutatnak, lehetséges, hogy az EE növekedése a fényciklusban (+ 20%) annak köszönhető, hogy ebben a ciklusban végezzük a szondázást, és nem a sötét ciklusban. Ezenkívül kiszámolták a légzési cserearányt (RER) annak meghatározása érdekében, hogy az elsődleges üzemanyagforrás szénhidrát vagy zsír-e. Ismeretes, hogy a 0,70 RER a zsír oxidációjának túlsúlyát jelzi; A RER 0,85 a zsír és a szénhidrát keverékére utal, és az 1,00 vagy annál magasabb érték a szénhidrát oxidációjára utal [21,22]. Adataink azt mutatták, hogy a HFD-GUA csoportban a fényciklus főként szondázás után (2. D ábra) csökkent a HFD-GUA csoportban (2. E ábra), ami a guaranával kezelt állatokban megnövekedett zsírsav-felhasználást jelez. A sötét ciklusban azonban nem figyelünk meg RER különbséget (2. F ábra). Ennek megfelelően a zöld teával és az EGCG-vel együtt fogyasztott guarana-kivonat képes volt növelni az energiafogyasztást (metabolikus kamrában mérve a 24 órás energiafelhasználást) egészséges felnőtteknél [16]. Ismert, hogy a guaranában magas a koffeinkoncentráció [15,23], és néhány tanulmány már kimutatta, hogy a koffein képes módosítani az anyagcserét és az energiafelhasználást [24,25,26].