Hasonló testsúlycsökkenés esetén az étrendi összetétel meghatározza a glikémiás javulás mértékét az étrend okozta elhízott C57BL/6 egerekben

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, hivatalos elemzés, finanszírozás megszerzése, módszertan, validálás, vizualizáció, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Krónikus betegségek, anyagcsere és öregedés osztálya, KU Leuven, Leuven, Belgium, Leuveni Egyetemi Kórházak Endokrinológiai Tanszék, Leuven, Belgium

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, formális elemzés, módszertan, vizualizáció, írás - áttekintés és szerkesztés

Krónikus betegségek, anyagcsere és öregedés tagsági osztálya, KU Leuven, Leuven, Belgium

Szerepek Adatkúra, formális elemzés, vizsgálat, módszertan, írás - áttekintés és szerkesztés

Krónikus betegségek, anyagcsere és öregedés tagsági osztálya, KU Leuven, Leuven, Belgium

Szerepek Adatmegőrzés, vizsgálat, módszertan, írás - áttekintés és szerkesztés

Krónikus betegségek, anyagcsere és öregedés tagsági osztálya, KU Leuven, Leuven, Belgium

Szerepek Módszertan, források, írás - áttekintés és szerkesztés

Leuven, Leuven, Egyetemi Kórházak Hasi Sebészeti Osztálya, Belgium

Szerepek Adatmegőrzés, formális elemzés, módszertan, erőforrások, szoftver, írás - áttekintés és szerkesztés

Társulás Département d'Anatomie Pathologique, INSERM U773, Universidé Paris Diderot, Párizs, Franciaország

Szerepek vizsgálata, módszertan, projekt adminisztráció, felügyelet, validálás, írás - áttekintés és szerkesztés

Hepatológiai Laboratórium, KU Leuven, Leuven, Belgium, Gasztroenterológiai és Hepatológiai Tanszék, Leuveni Egyetemi Kórházak, Leuven, Belgium

Szerepek Módszertan, Projekt adminisztráció, Források, Felügyelet, Validálás, Írás - áttekintés és szerkesztés

Krónikus betegségek, anyagcsere és öregedés osztálya, KU Leuven, Leuven, Belgium, Endokrinológiai Tanszék, Leuveni Egyetemi Kórházak, Leuven, Belgium

Szerepek Adatmegőrzés, formális elemzés, módszertan, szoftver, ellenőrzés, írás - áttekintés és szerkesztés

Krónikus betegségek, anyagcsere és öregedés tagsági osztálya, KU Leuven, Leuven, Belgium

Szerepek Finanszírozás megszerzése, Módszertan, Projekt adminisztráció, Források, Validálás, Írás - áttekintés és szerkesztés

Krónikus betegségek, anyagcsere és öregedés osztálya, KU Leuven, Leuven, Belgium, Endokrinológiai Tanszék, Leuveni Egyetemi Kórházak, Leuven, Belgium

Szerepek konceptualizáció, finanszírozás megszerzése, módszertan, szoftver, felügyelet, validálás, írás - áttekintés és szerkesztés

Krónikus betegségek, anyagcsere és öregedés osztálya, KU Leuven, Leuven, Belgium, Endokrinológiai Tanszék, Leuveni Egyetemi Kórházak, Leuven, Belgium

Szerepek Finanszírozás megszerzése, módszertan, források, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

Krónikus betegségek, anyagcsere és öregedés osztálya, KU Leuven, Leuven, Belgium, Endokrinológiai Tanszék, Leuveni Egyetemi Kórházak, Leuven, Belgium

Szerepek Adatmegőrzés, módszertan, szoftver, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

Krónikus betegségek, anyagcsere és öregedés tagsági osztálya, KU Leuven, Leuven, Belgium

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, forrásszerzés, módszertan, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

Krónikus betegségek, anyagcsere és öregedés osztálya, KU Leuven, Leuven, Belgium, Endokrinológiai Tanszék, Leuveni Egyetemi Kórházak, Leuven, Belgium

Roman Vangoitsenhoven,
Miranda van der Ende,
Katrien Corbeels,
João Paulo Monteiro Carvalho Mori Cunha,
Matthias Lannoo,
Pierre Bedossa,
Schalk van der Merwe,
Ann Mertens,
Ina Gesquiere,
Ann Meulemans

Ábrák

Absztrakt

Háttér

A fogyás elérése az elhízás, különösen a glükóz-intolerancia metabolikus következményeinek kezelésének sarokköve.

Célkitűzés

Annak meghatározása, hogy a glükózkontroll javulása függ-e az étrend makroelem-összetételétől az étrend azonos fogyásakor.

Anyagok és metódusok

Huszonkét hetes, étrend által kiváltott, elhízott C57BL/6 egerek lefogytak a normál chow (R-NC) vagy a magas zsírtartalmú étrend (R-HF) kalóriakorlátozása révén. A kontroll egereket normál chow-val (LEAN) vagy magas zsírtartalmú étrenddel (OBESE) ad libitum etették. A testsúlyt és az összetételt 8 hetes étrendi beavatkozás után értékeltük. A glükóz homeosztázist intraperitoneális glükóz tolerancia tesztekkel (IPGTT) értékeltük. Az epididymális fehér zsírszövetet (eWAT) és a májszöveteket immunhisztokémiai és RT-qPCR analízissel elemeztük.

Eredmények

30 hetes korára az R-NC-n (31,6 ± 1,7 g, átlag ± SEM) és az R-HF (32,3 ± 0,9 g) egerek testtömege hasonló volt a LEAN egerekhez (31,9 ± 1,4 g), míg az OBESE az egerek súlya 51,7 ± 2,4 g. Az R-NC-ben a glükóz tolerancia jobb volt, mint a LEAN egereknél (69% AUC IPGTT, P 0,0168), míg az R-HF egerek az azonos súlyvesztés ellenére lényegesen kevésbé voltak glükóz toleránsak (125% AUC IPGTT, P 0,0279 vs LEAN). Az eWAT párnák és az adipocita mérete hasonló volt a LEAN és az R-NC egereknél, míg az R-HF eWAT párna mérete az R-NC 180% -a (P 1. táblázat. Makrotápanyagok összetétele.

Ételbevitel és testösszetétel

A 8 hetes étrendi beavatkozási szakaszban az összes egeret egyedül tartották és hetente lemérték. Az ad libitum csoportoknak (LEAN, OBESE) hetente egyszer, a korlátozott csoportoknak (R-NC és R-HF) napi egyszeri ételt szállítottak. A kalóriabevitelt hetente mértük az ad libitum csoportok számára, levonva a fennmaradó étkezési pelletek súlyát az adott héten szállított összes élelmiszer tömegéből. A korlátozott csoportok esetében a kalóriabevitelt a napidíj összegének kiszámításával, levonva az előző napok esetleges maradványait. Az intervenciós periódus átlagos napi kalóriabevitelét úgy számítottuk, hogy a teljes bevitelt elosztottuk a kísérleti napok számával. A teljes test testösszetételét, a koponya kivételével, kettős energiájú röntgenabszorpciós módszerrel (DXA; PIXImus densitométer; Lunar, Madison, WI; szoftveres verzió 2.10.041) elemeztük altatott egerekben (fenobarbital 50 mg/kg, Sanofi Santé Animale, Brüsszel, Belgium).

Közvetett kalorimetria

Az egereket egyenként automatizált ketrecekben helyezték el közvetett kalorimetriához (TSE Phenomaster Calocages, Bad Homburg, Németország) 22 ° C környezeti hőmérsékletű és 12 órás sötét/világos ciklusú helyiségben, a leírtak szerint [15]. Minden egérnek ad libitum hozzáférése volt a vízhez és az élelemhez, kivéve az R-NC és R-HF egereket, akiknek az élelmiszer-kosárnyílása automatikusan összekapcsolódott, hogy kinyíljanak a szomszédos ketrecekben lévő ad libitum táplált egerek tényleges ételfogyasztása után. Ez megakadályozta a kompenzációs túlzott bevitelt korlátozott csoportokban. A táplálékfelvételt, az oxigénfogyasztást, a szén-dioxid-termelést és az ambuláns tevékenységet 48 óra alatt regisztrálták, de csak az elmúlt 24 órát használták a számításokhoz, hogy kizárják az új ketreci környezet torzítását. A légzési csere arányt (RER) és a hőtermelést a leírtak szerint számoltuk [16].

In vivo glükóz homeosztázis tesztek

Az intraperitoneális glükóz és inzulin tolerancia teszteket (IPGTT és ITT) 28, illetve 29 hetes korban végeztük. 6 órás éhgyomorra (8: 00-14: 00) után megmértük az egereket, és az éhomi glikémiát meghatároztuk a farokvén vérén (Accu-Chek Aviva glükométer, Roche Diagnostics, Vilvoorde, Belgium). Glükózt (2 g/testtömeg-kg) vagy inzulint (0,75 mU inzulin/g testtömeg, Actrapid, NovoNordisk, Dánia) adtunk be, majd 15, 30, 60, 90 és 120 perc múlva mértük a glikémiás szinteket [17].

Szérum- és szövetanalízisek

30 hetes korban meghatározták a farokvénás glikémiát, és az egereket széndioxid-gázzal feláldozták, majd vért vettek szívszúrással, valamint az epididymális fehér zsírszövet (eWAT) betétjeit és a máját. A szérumot 10 percig végzett centrifugálással kaptuk 2000 g-nál. Az inzulinszintet kereskedelmi ELISA készlet (Mercodia, Huissen, Hollandia) segítségével határoztuk meg Victor Multilabel Counter-en (Perkin Elmer, Wallac, Finnország). A szérum alanin-minotranszferáz (ALT) szintjét AU640 biokémiai analizátorral (Beckman Coulter Inc., Brea, CA) határoztuk meg. A máj triglicerid (TG) szintjét a triglicerid mennyiségi készlet kitermelésével határoztuk meg (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság).

Szövettan és immunhisztokémia

A máj és az eWAT mintáit 4% paraformaldehidbe rögzítettük, és paraffinba ágyazottuk. Az 5 μm vastag metszeteket hematoxilinnal és eozinnal (H&E), a májrészeket pedig Sirius Red-rel festették a májfibrózis miatt. A mikroszkópos felvételeket (20-szoros nagyítás zsírra, 10-szeres májszövetre) Zeiss Axiovert mikroszkóppal készítettük Axiovision szoftver segítségével (Zeiss, Zaventem, Belgium).

Az adipocita sejtméretet 3 különböző mikroszkopikus mezőben határoztuk meg zsírpárnánként, legalább 100 sejt megszámlálásával ImageJ szoftver (NIH, Bethesda, MD) alkalmazásával „elemzés-beállított skála”, „folyamat – kivonás háttér”, „kép-küszöb” parancsokkal., „Processz-make bináris” és „Makró mérése és címkézése”, a leírtak szerint [18].

Az összes májmintát egy szakértő májpatológus elemezte, megvakult az étrendi állapot vagy a műtéti beavatkozás miatt. A steatózist, az aktivitást és a fibrózist félkvantitatív módon pontozták a NASH-Clinical Research Network kritériumai szerint [19]. A steatosis mennyiségét (a zsírcseppeket tartalmazó hepatociták százalékos aránya) 0 (33–66%) és 3 (> 66%) értékre osztották. A hepatocita léggömbözés 0 (nincs), 1 (kevés) vagy 2 (sok sejt/kiemelkedő ballonozás) kategóriába került. A lobularis gyulladás fókuszait 0 (nincs góc), 1 (4 góc/200 × mező) pontozással értékeltük. A fibrózist F0 stádiumként (nincs fibrózis), F1a stádiumként (enyhe, 3. zóna, perisinusoidális fibrózis), F1b stádiumként (mérsékelt, 3. zóna, perisinusoidális fibrózis), F1c stádiumként (portál/periportális fibrózis), F2 stádiumként (perisinusoidoid és portál)/periportális fibrózis), F3 stádium (áthidaló fibrózis) és F4 stádium (cirrhosis).

Kvantitatív polimeráz láncreakció

Az eWAT és a májszövet teljes RNS-ét 50 mg szövetből extraháltuk RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen, Hilden, Németország) vagy SV Total RNS Izolációs Rendszer (Promega, Madison, WI) alkalmazásával. Az első szálú cDNS-t a Superscript II RT (Life Technologies, Ghent, Belgium) alkalmazásával szintetizáltuk. A qRT-PCR-t StepOne valós idejű PCR rendszerrel (Applied Biosystems, Ghent, Belgium) és Fast SYBR Green Mastermix (Qiagen) vagy TaqMan mastermix (Life technológiák) alkalmazásával hajtottuk végre, a ΔΔCt kvantifikációs módszer alapján. Az értékeket a 60S riboszomális fehérje L27 és a hipoxantin-guanin foszforiboziltranszferáz geometriai átlagához normalizáltuk. Az alapozó szekvenciákat az S2 táblázat tartalmazza.

Statisztika

Az adatokat átlag ± SEM formájában adjuk meg, hacsak másként nem jelezzük. A statisztikai elemzéseket a GraphPadPrism 6.0 (GraphPad Software, San Diego, CA) alkalmazásával végeztük. Az adatokat egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) hasonlítottuk össze, amelyet post hoc elemzés követett Bonferroni többszörös összehasonlító teszttel, hacsak az ábrákban nem szerepel másképp. Az asszociációk feltárására Pearson-korrelációs tesztet hajtottak végre. A különbségeket P-nél statisztikailag szignifikánsnak tekintettük. 1. testtömeg és testösszetétel.

A testtömeg alakulása (a) és a kalóriabevitel (b) LEAN (fehér körök), R-NC (világosszürke felfelé mutató háromszögek), R-HF (sötétszürke lefelé mutató háromszögek) és OBESE (fekete körök) egerek. N = 11 LEAN és OBESE esetén, n = 15 R-NC és R-HF esetén. Testtömeg (c) és testösszetétel, zsírszázalékban (d) és sovány tömegben (e) kifejezve, DXA-val mérve, 30 hetes korban (n = 6 csoportonként). Az adatokat átlag ± SEM * P formában mutatjuk be. 2. ábra: Energia expedidure komponensek, amint az automatizált ketrecekben származik a közvetett kalorimetriához.

Légzéscsere (a), oxigénfogyasztás (b), hőtermelés (c) és ambuláns tevékenység (d) (n = 6–8 csoportonként). Az adatokat átlag ± SEM * P 2, P 2 formájában adjuk meg R-NC egerekben, 625 ± 39 μm 2 R-HF egerekben; mind P 3. ábra Az epididymális fehér zsírszövet (eWAT) jellemzői különböző súlycsökkentő beavatkozások esetén.

Az eWAT betétek relatív súlya (n = 11–15 csoportonként) és OBESE (f) egerek (20-szoros nagyítás, a méretarány 100 μm-t mutat). Átlagos adipocita felület az eWAT szövetmintákban (n = 6–9 csoportonként, G) és a TNF-alfa (g) és az MCP-1 (h) relatív mRNS expressziós szintje az eWAT-ban (n = 6–8, csoportonként). Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be. * P 4. ábra. A májszövet jellemzői különböző súlycsökkentő beavatkozások esetén.

Relatív májtömeg (n = 11–15 csoportonként) ). A máj szöveteinek H&E-vel festett szakaszai LEAN (d), R-NC (e), R-HF (f) és OBESE (g) egerekből (10-szeres nagyítás, a skála oszlopai 200 μm-t jeleznek). Steatosis (h), gyulladásos aktivitás (i) és fibrózis (j) pontszám és a májbetegség relatív gyakorisága (n = 11-15 csoportonként) (k); A TNF-alfa relatív mRNS-expressziós szintje (n = 6–8 csoportonként) (l). Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be. * P 5. ábra. A glükóz homeosztázis paramétái a fogyókúrás beavatkozások során.

Vércukorszint (n = 11–15 csoportonként) (a) és a szérum inzulinszint (n = 6 csoportonként) (b) 6 órás éhgyomri után. Intraperitoneális glükóz tolerancia teszt és számított AUC (n = 8 csoportonként) (c, d) Inzulin tolerancia teszt és számított AUC (n = 6 csoportonként). Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be. * P 2. táblázat: A testösszetétel, a glükózparaméterek, az epididymális fehér zsírszövet (eWAT) mérete, a máj steatosis és az ALT szint közötti összefüggés.