Határok a farmakológiában

Integratív és regeneratív farmakológia

Ez a cikk a kutatási téma része

A biofarmácia terén elért haladás Az összes 25 cikk megtekintése

Szerkesztette
Victor Erokhin

Elektronikai és mágnességi anyagok intézete, Olasz Nemzeti Kutatási Tanács, Olaszország

Felülvizsgálta
Christopher D. Porada

Wake Forest Orvostudományi Kar, Egyesült Államok

Alexander A. Sosunov

Columbia Egyetem, Egyesült Államok

Victor Arvanian

Northport VA Medical Center, Egyesült Államok

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

által

  • Cikk letöltése
    • PDF letöltése
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Kiegészítő
      Anyag
  • Exportálás
    • EndNote
    • Referencia menedzser
    • Egyszerű TEXT fájl
    • BibTex
OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

  • 1 Biológiai Tanszék, Kazan Állami Orvostudományi Egyetem, Kazan, Oroszország
  • 2 Gamaleya Epidemiológiai és Mikrobiológiai Kutatóintézet, Moszkva, Oroszország
  • 3 Fundamentális Orvostudományi és Biológiai Intézet, Kazan Federal Federal (Volga Region) Egyetem, Kazan, Oroszország
  • 4 Kazan Scientific Center, Kazan Biokémiai és Biofizikai Intézet, Orosz Tudományos Akadémia, Kazan, Oroszország
  • 5 Neurológiai Sebészeti Osztály, Mayo Clinic, Rochester, MN, Egyesült Államok
  • 6 Élettani és Orvostechnikai Tanszék, Mayo Clinic, Rochester, MN, Egyesült Államok

Bevezetés

Vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF)

A vaszkuláris endoteliális növekedési faktornak (VEGF) ismert közvetlen neuroprotektív hatása van a patkány gerincvelő neuronjaira, amely közvetíthető in vitro a VEGFR2/Flk-1 receptorokon keresztül (Ding et al., 2005). A VEGF-termelés fenntartásának fontosságát a sérült gerincvelő alacsony szintje szabja meg (Herrera et al., 2009). Kimutatták, hogy a VEGF csökkentheti az idegsejtek másodlagos degenerációját és javíthatja a funkcionális eredményt a kísérleti SCI-ben (Widenfalk et al., 2003). Az idegi őssejtek általi VEGF-bejuttatás fokozhatja a glia progenitorok szaporodását, az angiogenezist és javíthatja a szövetkímélést az SCI után (Kim és mtsai, 2009). Az endogén VEGF-A összes izoformájának expressziójának aktiválására tervezett, adenovirálisan szállított, bioméretű cink-ujj transzkripciós faktor az axonális lebontás gyengülését, az apoptózis csökkent szintjét, az érrendszer jelentős növekedését, a SCI-t követő viselkedési eredmények javulását eredményezte ( Liu és mtsai, 2010; Figley és mtsai, 2014).

Glia származtatott neurotróf faktor (GDNF)

A glia eredetű neurotróf faktor (GDNF) jól ismert tényező az ischaemiát, a neurodegenerációt vagy a neurotraumát követő idegsejtek megmentésére. A rekombináns GDNF gént hordozó rekombináns adenovírus intraspinális injektálása a sérült gerincvelőbe megőrizheti az idegszálakat és elősegítheti a funkcionális helyreállítást az SCI után (Tai és mtsai., 2003). A közelmúltban a SCI patkánymodelljén kimutattuk, hogy az UCB-MC által közvetített GDNF terápia javíthatja a szövetek kímélését, bár a mielinált szálak száma magasabb volt, mint az Ad-GDNF közvetlen injekciója után mért rostok száma (Mukhamedshina et al., 2016b). Sőt, ebben a tanulmányban a gliasejtek különböző populációiban különböző molekuláris reakciókat figyeltünk meg a poszttraumás patkány gerincvelő különböző területein.

Hypoxia-indukálható faktor angiogenin (ANG)

A hipoxia által indukálható faktor angiogenin (ANG) mind a motoneuron túlélését elősegíti in vitro és in vivo Kieran és mtsai., 2008). Az ANG egy neuronálisan szekretált tényező, amelyet az asztroglia endocitál, és parakrin módon közvetíti a neuroprotekciót (Skorupa et al., 2012). Ennek a faktornak a SCI patofiziológiájában betöltött szerepe még nem ismert. Az ANG gerincvelő-regenerációban betöltött szerepéről az ALS-modellekből kaptunk nagyobb adatokat. Így az Ad-VEGF + Ad-ANG kombinációval injektált ALS egerek 2-3 hetes késést mutattak a betegség megnyilvánulásában, magasabb motoros aktivitást mutattak a betegség előrehaladott stádiumában és megnövelték az élettartamukat (Ismailov et al. 2014).

Az L1 molekula

Anyagok és metódusok

Adenovirális vektorok és géntechnológiával módosított UCB-MC előállítása

Ezt a vizsgálatot a „Kazan State Medical University Animal Care Committee” intézményi felülvizsgálati testülete vizsgálta felül és hagyta jóvá, és az összes eljárást a „Munka vérképző őssejtekkel. SMK-MI-02.04-07 ”, FS-16-01-001421 engedély.

Adenovirális vektorok

A VEGF165, GDNF, ANG, NCAM1 és zöld fluoreszcens fehérje (GFP) géneket hordozó adenovírus vektorokat az emberi adenovírus 5. szerotípusán (Ad5) alapuló homológ rekombinációs módszerrel állítottuk elő Gamaleya Epidemiológiai és Mikrobiológiai Kutatóintézetben (Moszkva, Oroszország), korábban leírták (Shcherbinin et al., 2014). Injekcióhoz 2 × 107 Ad5-GFP vírusrészecske 20 μl sóoldatban; 2x107 vírusrészecske Ad5-VEGF165, Ad5-GDNF és Ad5-NCAM1 keveréke 20 μl sóoldatban; és 2x107 vírus részecske keveréket készítettünk Ad5-VEGF165, Ad5-ANG és Ad5-NCAM1 20 μl sóoldatban.

Mononukleáris sejtek

Az emberi köldökzsinórvérből származó mononukleáris sejteket (UCB-MC) szokásos ülepítési technikával izoláltuk sűrűséggátra (Ficoll, 1,077 g/ml), a kazán állam engedélye alapján korábban leírtak szerint (Islamov et al., 2015). Orvostudományi Egyetem őssejtbank. Genetikailag módosított UCB-MC-ket kaptunk, miután a sejteket Ad5-GFP-vel transzdukáltuk MOI 10-nél; az Ad5-VEGF165, Ad5-GDNF és Ad5-NCAM1-gyel egyidejűleg a MOI 10-nél; és egyszerre az Ad5-VEGF165, Ad5-ANG és Ad5-NCAM1-gyel a MOI 10-nél. Injekcióhoz 2 × 10 6 UCB-MC + Ad5-GFP 20 μl sóoldatban; 2 × 10 6 UCB-MC + Ad-VEGF165 + Ad-GDNF + Ad-NCAM1 20 μl sóoldatban; és 2 × 10 6 UCB-MC-t + Ad-VEGF165 + Ad-ANG + Ad-NCAM1 20 μl sóoldatban készítettünk.

A transzgének expressziójának értékelése in Vitro

A kvantitatív reverz transzkripciós PCR (qRT-PCR) elemzéshez az UCB-MC-ket öt nappal az Ad5-VEGF165, Ad5-GDNF és Ad5-NCAM1 transzdukció után gyűjtöttük be. A géntechnológiával módosított UCB-MC-kből származó teljes RNS-t a TRIZOL (Invitrogen) alkalmazásával izoláltuk. A cDNS-t 100 U Maxima reverz transzkriptáz (Thermo Scientific, USA) segítségével nyertük. A VEGF165 expressziós sebességének meghatározásához GDNF és NCAM1 TaqMan módszert alkalmaztunk. A vizsgálatban használt összes primert és próbát az 1. táblázat sorolja fel. Valós idejű PCR-t hajtottunk végre, és az eredményeket CFX 96 RealTime PCR rendszerrel (Bio-Rad) elemeztük. Az mRNS szintjét normalizáltuk 18S rRNS alkalmazásával háztartási génként. Minden mintához a PCR reakciókat három példányban hajtottuk végre. A cDNS-szinteket a standard görbe segítségével határoztuk meg. A standard görbéhez használt standardokat a plazmid DNS sorozatos hígításával állítottuk elő megfelelő cDNS inszertekkel. A naiv (nem transzdukált) UCB-MC-ben a célgének expressziós szintjét 100% -nak tekintettük.

Asztal 1. RT-PCR primerek és TaqMan próbák.

Enzimhez kapcsolt immunszorbens assay (ELISA) alkalmazásával megbecsülték az oldható VEGF szintjét kondicionált tenyésztő táptalajban az Ad5-VEGF165-gyel, Ad5-GDNF-mel és Ad5-NCAM1-del transzdukált UCB-MC inkubálása után. Transzdukció után az UCB-MC-ket 96 órán át 37 ° C-on, nedves atmoszférában inkubáltuk, a táptalajt összegyűjtöttük és 3000 g-vel 10 percig centrifugáltuk, majd 0,22 μm-es szűrőn átszűrtük. A VEGF koncentrációját kondicionált táptalajban VEGF DuoSet ELISA készlettel mértük az R&D Systems-től (# DY293B DuoSet) a gyártó protokollja szerint. Az Ad5-GFP-vel transzdukált UCB-MC-ket 96 órával inkubálás után fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk a zöld fluoreszcens fehérje expressziójának értékelésére.

Állatok és kezelések

Ötnégy nőstény Wistar patkányt (Pushchino Laboratory, Oroszország) használtak, amelyek súlya 250–300 g volt. A patkányokat ketrecenként egy-egy standard laboratóriumi körülmények között tartották, korlátlan hozzáféréshez az élelemhez és a vízhez, 12 órás világos/sötét ütemezéssel. A kísérleti protokoll összhangban volt az Orosz Nemzeti Bioetikai Bizottság Fiziológiai Szakosztályának ajánlásaival. Az összes állatkezelést, érzéstelenítést, műtétet, műtét utáni ellátást, perfúziót és eutanáziát a végpontokban a Kazan Állami Orvostudományi Egyetem Állattenyésztési Bizottsága hagyta jóvá (5. engedélyszám, 2014. május 27-től). A műtét előtt az állatokat véletlenszerűen hét kísérleti csoportba sorolták (2. táblázat).

2. táblázat. Kísérleti csoportok.

1.ábra. Kísérleti terv. (A) Gerincvelő sérülés és intrathecalis injekció; (B) A gerincvelő töredéke (30 mm) három szegmensre oszlik: rostralis (10 mm) és caudalis (10 mm) a sérülés epicentrumától (10 mm); (C) Immunfluoreszcens festéshez használt gerincvelői zónák. Hét gerincvelői területet választottunk ki: ventrális kürt (VH); ventrális kortikospinális traktus (CST); háti gyökér belépési zóna (DREZ); a központi csatorna területe (CC); háti funiculi (DF); a ventrális funiculi (VF); az oldalsó funiculi külső területe a központi csatornán áthaladó vonalon (LF).

A mozgásszervi aktivitás értékelése

Valamennyi állatot a szabadföldi mozgás szempontjából megvizsgáltuk a Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) ​​pontszám alapján. A funkcionális helyreállítás tesztjét a műtét utáni hetedik naptól kezdve végeztük, és napi intervallummal követtük, és 30 dpi-vel fejeztük be.

Szövettani értékelés

Az immunfluoreszcens analízishez a metszeteket PBS-ben 1% Triton X-100 (Sigma) -val mostuk háromszor 5 percig, és 5% normál kecskeszérumban blokkoltuk 1 órán át szobahőmérsékleten (RT). Az immunfluoreszcens jelöléshez a metszeteket egy éjszakán át 4 ° C-on primer antitestek kombinációjával kezeltük (3. táblázat), majd szekunder antitestek keverékében inkubáltuk 2 órán át szobahőmérsékleten. A magok vizualizálásához DAPI-t (10 μg/ml PBS-ben, Sigma) alkalmaztunk. Propidium-jodid oldatot (PI, 5 μg/ml PBS-ben, Sigma) alkalmaztunk mind a sejtmagban, mind a citoplazmában lévő RNS festésére (Nissl anyag neuronokban) (Niu et al., 2015). A feldolgozott metszeteket tárgylemezekre szereltük, glicerinbe ágyazva (GalenoPharm; Szentpétervár, Oroszország), és LSM 510-Meta mikroszkóp alatt (Carl Zeiss; Oberkochen, Németország) figyeltük meg őket.

3. táblázat. Az immunfluoreszcens festés során alkalmazott primer és szekunder antitestek.

Statisztikai elemzések

Immunfluoreszcens festés és in vitro a molekuláris analízis adatait átlagként ± az átlag standard hibájaként (SEM) mutatjuk be. A statisztikai szignifikancia meghatározásához Student-et használtunk t-teszteloszlás vagy egyirányú varianciaanalízis (ANOVA) Tukey-próbával. A 0,05 értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük. Az adatokat az Origin 7.0 SR0 (OriginLab, Northampton, MA) szoftverrel elemeztük. A BBB adatok statisztikai szignifikanciájának meghatározásához U Wilcoxon-Mann-Whitney tesztet használtunk az SPSS Statistics 22 (IBM, Armonk, New York, USA) szoftverrel, ahol o + -VEGF-et expresszáló sejtek (piros) (zöld). (B) HNA + -sejtek (piros), amelyek expresszálják a GDNF-et (zöld). (C) ANG-t expresszáló HNA + -sejtek (piros) (zöld). (D) NCAM-t expresszáló HNA + -sejtek (piros) (zöld). Az indikált sejtek megfelelnek a köldökzsinórvér mononukleáris sejtjeinek morfológiájának, kerek magokkal, körülvett vékony citoplazma peremmel.

Az idegi és a glia molekuláris markerek kifejezése a farok gerincvelőjében

HSP27

A Vsp-ben a Hsp27 expresszió csökkent szabályozását minden terápiás csoportban megtaláltuk, összehasonlítva a sóoldattal (29,56 ± 3,47) (6. ábra). Ez a hatás volt a legszembetűnőbb az UCB-MCs + Ad-VEGF-GDNF-NCAM (13,67 ± 0,85) és az Ad-VEGF-GDNF-NCAM (13,84 ± 0,39) csoportokban. A Hsp27 expresszió csökkenését az UCB-MCs + Ad-GFP csoportban nem igazolták (6. ábra).

6. ábra. Hsp27 expresszió. Felső panel: A farok gerincvelő keresztmetszeteinek immunfluoreszcens festése Abs-vel Hsp27 (piros) ellen caudalisan a sérülés helyéig a kontroll (sóoldat) és a terápiás csoportokban. A magokat (kék) ellenfestettük DAPI-val. Méretarány = 50 μm. Alsó panel: A Hsp27-pozitív sejtek statisztikai elemzésének hisztogramja a VH zónában. Az adatokat SEM átlagként, *o Kulcsszavak: gerincvelő sérülés, gliasejtek, génterápia, emberi köldökzsinórvér mononukleáris sejt, vaszkuláris endoteliális növekedési faktor, gliasejtből származó neurotróf faktor, angiogenin, idegsejt-tapadási molekula

Idézet: Izmailov AA, Povysheva TV, Bashirov FV, Sokolov ME, Fadeev FO, Garifulin RR, Naroditsky BS, Logunov DY, Salafutdinov II, Chelyshev YA, Islamov RR és Lavrov IA (2017) A gerincvelő molekuláris és sejtes változásai, amelyeket Adenoviral Vector váltott ki - és a sejtek által közvetített hármas génterápia súlyos kontúzió után. Elülső. Pharmacol. 8: 813. doi: 10.3389/fphar.2017.00813

Beérkezett: 2017. augusztus 03 .; Elfogadva: 2017. október 26 .;
Publikálva: 2017. november 13.

Victor Erokhin, az Elettronica és a Magnetismo IMEM-CNR anyagának az anyagai, Olaszország

Christopher D. Porada, Wake Forest Orvostudományi Kar, Egyesült Államok
Alexander A. Sosunov, Columbia Egyetem, Egyesült Államok
Victor Arvanian, Northport VA Orvosi Központ (VHA), Egyesült Államok