Hosszan tartó standardizált étrend hatása az 1, 2, 3 emberi metabolom normalizálására

Társított adatok

Absztrakt

Háttér: Habár tanulmányozták az akut étrendi beavatkozások emberi metabolomra gyakorolt hatásait, még nem vizsgálták, hogy a metabolom mennyire normalizálható kiterjedt étrendi szabványosítással.

Célkitűzés: Megvizsgáltuk egészséges emberi alanyok metabolikus profilját kiterjesztett étrendi standardizálás után, hogy lássuk, csökkenthető-e az emberi metabolómában rejlő variáció.

Tervezés: 10 egészséges önkéntesből álló kohorszot 2 hetes étrend-standardizálás céljából felvettek egy klinikai kutatóközpontba. Napi szérum- és vizeletmintákat, valamint szérummintákat gyűjtöttek egy 2 hetes utólagos látogatáson. A mintákat 1H magmágneses rezonancia (NMR) spektroszkópiával és többváltozós statisztikai elemzéssel elemeztük.

Eredmények: Az NMR-spektrumokat összegyűjtöttük a nagyobb koncentrációjú metabolitok (> μmol/L koncentrációk) globális profiljára. Metabolikus változásokat figyeltek meg egyes szérummintákban az 1. nap vagy a 2 hetes követési látogatás után. Minden alany esetében az összes többi nap mintái hasonló profilúak voltak. A vizelet metabolomja nem tükrözte az étrend standardizálásának hatásait. Összevont 24 órás vizeletmintákat vizsgáltak, amelyek azt jelezték, hogy bármely normalizálódás, amely bekövetkezik, ezt 2-ben elvégezné) 25,8 (tartomány: 19,9–32,4). A három d kohort 55 alanyból állt (23 nő és 32 férfi). Az átlagos alany kor 31 év volt (tartomány: 18–58 év), az átlagos BMI pedig 25,8 (tartomány: 19,1–39,6). Az alkoholfogyasztástól, gyógyszerektől, vitaminoktól, étrend-kiegészítőktől vagy gyógynövényektől (kivéve a fogamzásgátló tablettákat vagy antidepresszánsokat) tartózkodó betegek legalább 2 hétig a felvétel előtt. További kizárási kritériumok közé tartoztak a kóros májenzimek kórtörténete, krónikus alkoholfogyasztás, krónikus májbetegség vagy az anamnézisben szereplő acetaminofen 3 hónapon keresztül történő alkalmazása a szűrés előtt.

Egységesített étrend

Az alanyok állandó makrotápanyag-étrendet kaptak, amely reggelire, ebédre, vacsorára és a lefekvés előtti snackből kétnapos ciklusban változott. Az ételeket minden nap egységes időpontokban biztosították. A 35 kalóriát/testtömeg-kilogrammot tartalmazó étkezéseket az alany tényleges testsúlya alapján bocsátották rendelkezésre, ha a BMI értéke 30. A makrotápanyagok lebontása 15% fehérjét, 30% zsírt és 55% szénhidrátot tartalmazott. Az étrendeket a testtömeg fenntartása érdekében úgy módosítottuk, hogy az energiafogyasztást 300 kalóriával/nap emeltük, ha az alany súlya 1 kg-mal csökkent, és az energiafogyasztás 200 kalóriával/nap csökkent, ha az alany súlya 1 kg-mal nőtt. Más ételeket nem engedélyeztek; az alanyok vizet, koffeinmentes diétás szódát, valamint koffeinmentes fekete kávét és teát fogyaszthattak ad libitum.

Az egyes élelmiszerekhez tartozó ételeket és mennyiségeket az 1. kiegészítő táblázat tartalmazza (lásd az online kiadás „Kiegészítő adatok” részét). Az élelmiszer-helyettesítéseket akkor hajtották végre, ha az alany nem tudta elviselni egy adott ételt.

Minta kollekció

Az éheztetett vérmintákat naponta 0800-kor vették, a 24 órás vizeletmintákat pedig összegyűjtötték és -80 ° C-on lefagyasztották a vizsgálat során. Az alanyok 2 hét múlva tértek vissza a kiutalás után, utánajárás céljából és éhomi vérmintára. (A 4. és 11. nap összes mintáját külön gyűjtöttük a farmakokinetikai elemzésekhez való felhasználás céljából, és nem voltak elérhetőek ezzel a vizsgálattal.)

A minta előkészítése

A fagyasztott szérum- és vizeletmintákat egy éjszakán át 4 ° C-on felolvasztották. 540 μl szérum alikvot részeket adtunk 5 mm-es NMR-csövekhez, amelyek 60 μl nehézvíz (D2O) oldatot tartalmaztak, amely 26,5 mmol formiátot/l tartalmaz kémiai eltolódási referenciához és 0,2% NaN3-ot a baktériumok növekedésének gátlásához. 540 μl vizelet alikvot részeit adtuk az 5 mm-es NMR-csövekhez, amelyek 60 μl 924 mmol foszfáttal pufferolt D2O oldatot/l tartalmúak voltak, pH-ja 6,14. A D2O oldat 4,6 mmol trimetil-szilil-propionátot (TSP) tartalmazott kémiai eltolódás referenciaként, 92 mmol imidazolt pH-referencia értékként és 0,2% NaN3-ot a baktériumok szaporodásának gátlásához.

1H-NMR-spektroszkópia

Az összes NMR spektroszkópiai mérést Varian INOVA spektrométer (Varian Inc., Palo Alto, CA) alkalmazásával végeztük, amelyet 399,80 MHz-en (1 H frekvencia) és 25 ° C-on működtettünk. Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) impulzusszekvenciát használtunk a spektrumok összegyűjtésére. A szérummintákat 2,5 másodperces elővásárlási késéssel, majd 2,0 másodperces oldószeres előtelítettséggel, 90 ° -os impulzussal és 100 ms-os CPMG késleltetési idővel vettük fel. A szabad indukciós bomlásokat 2,56 másodperc alatt sikerült elérni, 4389,8 Hz seprési szélességgel és 16 384 ponttal. A vizeletmintákat 4,1 mp-es újrafeldolgozási késleltetéssel vettük, amely magában foglalta a 4,0 s H2O előszaturációt. 20 ms-os CPMG késleltetési időt alkalmaztunk a maradék vízcsúcs szűkítésére. A 6388 Hz sávszélességet 16 360 ponttal digitalizálták, ami 2,56 s felvételi időhöz vezetett. Összesen 256 vizsgálatot (azaz a pulzusszekvencia ismétlését) gyűjtöttük össze mind a szérum-, mind a vizeletmintákról.

Spektrális feldolgozás

Az összes NMR spektrumot ACD/1D NMR Manager 8.0 (Advanced Chemistry Development Inc, Toronto, Kanada) alkalmazásával dolgoztuk fel. Az első 2 pont lineáris előrejelzését, 0,3 Hz-es exponenciális vonalszélesedést és nulla kitöltést 32 768 pontra alkalmaztunk mindegyik spektrumra. Fourier-transzformáció után mindegyik spektrumot manuálisan fázisoztuk, és az alapvonal korrekciót alkalmaztuk. A szérum spektrumok kémiai eltolódásait a formiát csúcsra, 8,47 ppm-re, a vizelet spektrumokat pedig a TSP csúcsra, 0,00 ppm-re vonatkoztattuk. A 0,00 ppm felfelé és a 10,00 ppm lefelé mutató spektrum régióit eltávolítottuk az elemzésből, mert csak zajt tartalmaztak. A maradék vízcsúcs körüli 4,50 és 5,10 ppm közötti régiót szintén kizártuk az elemzésből. A vizelet és a szérum spektrumokat külön csoportként dolgoztuk fel.

A spektrumokat az Intelligent Bucketing módszer alkalmazásával integráltuk az ACD szoftverbe, 0,02–0,06 ppm méretű tálcákkal. A zaj negatív hatásainak csökkentése érdekében kizárták a csak zajt tartalmazó kukákat. Ezeket a tartályokat úgy azonosítottuk, hogy figyelembe vettük egy adott tartály értéktartományát az összes spektrumban. A szemeteseket a növekvő tartálytartomány szerint rendezték, és egy küszöbértéket úgy határoztak meg, hogy a küszöbnél alacsonyabb tartományú kukákat zajnak tekintsék.

Többváltozós statisztikai elemzés

Az NMR-adatokat a SimcaP + -ba importáltuk (11.5 verzió; Umetrics, Umeå, Svédország). Az adatokat átlag-középre állítottuk, és Pareto-szórásra (1/√SD) skáláztuk. Ezután a kapott adatokon elvégeztük a fő komponensek elemzését (PCA). Az így kapott kétdimenziós pontszámdiagramok mindegyik mintát olyan tengelyeken mutatják be, amelyek megfelelnek az adatok fő szóródási forrásainak. Ezzel a módszerrel hasonló minták csoportosulnak egymás közelében, míg az eltérő minták távolabb vannak egymástól.

EREDMÉNYEK

A tipikus vizelet- és szérumspektrumok, valamint néhány metabolit-hozzárendelés a 1.ábra .

Példák az ebben a vizsgálatban használt egészséges önkéntesek vizeletéből (A) és szérumából (B) származó 1 H magmágneses rezonancia spektrumokra. Jelentős metabolit-hozzárendeléseket mutatunk be. A spektrumokat a Tantárgyak és módszerek leírás szerint szereztük be és dolgoztuk fel. VLDL, nagyon alacsony sűrűségű lipoprotein koleszterin; LDL, LDL koleszterin; Gly, glicin; Hipp, hippurate; Trig, trigonellin, TMAO, trimetil-amin-oxid.

Szérum

A szérumadatok PCA-pontszám diagramjait a 2A. Ábra . Az első 2 fő komponens az adatok variációinak> 80% -át magyarázza. A pontszámdiagramon hasonló spektrumú és ennélfogva hasonló metabolomikus profilú alanyok helyezkednek el egymás közelében. Az egyes alanyok spektrumai általában ugyanabban a régióban helyezkednek el. Az egyes alanyokból származó minták eloszlása az alanyon belüli variációt képviseli. Az alanycsoportok közötti elválasztás a szubjektumközi változatot jelenti. Amint az az ábrán látható, az alanyok közül 5 rendelkezik 1 vagy 2 ponttal, amelyek kiemelkednek a fő csoportjukból. Az ellipsziseket a fő csoportok köré rajzolják, és egy nyíl a kiugró felé mutat, vagy attól távol esik. Minden esetben a kiugró értékek vagy az első naptól, vagy a 2 hetes utólagos látogatástól származnak. Az első nap mintáit egy éjszakai böjt után vettük, csakúgy, mint az utólagos látogatások során. Az a tény, hogy az összes többi minta ugyanabban a régióban található, arra enged következtetni, hogy egyetlen nap biztosítja az étrend standardizálásával lehetséges összes normalizálást. Az első nap után az alanyok a PCA-diagram ugyanazon általános régiójában maradnak, amelyet metabolikus térüknek neveznek a klinikai vizsgálat ideje alatt.

A fő komponensek a szérum 1 H magmágneses rezonancia spektrum adatait ábrázolják. A szimbólumok az egyes tantárgyakat jelölik, és mindegyikükben 12 idõpontot tartalmaznak (az 1–13. Nap plusz a 2 hetes követés, a 4. és a 11. napot kizárva). V: 5 alany pontjait ellipszis zárja be, hogy megmutassák a csoportosításokat; a kiugró értékeket nyilakkal jelöljük. Az ellipszisek felé mutató nyilak az 1. napnak felelnek meg, az ellipszisektől távolra mutatóak pedig a 2 hetes követésnek felelnek meg. B: Ugyanazon 5 alany anyagcsere pályája látható, mint az A panel, és egyértelmű, hogy az első napon vagy az azt követő napon kívül a vizsgálat folyamán nincs következetes irány a pontok felé. Az első és a második fő komponenst t [1], illetve t [2] -ként jelöljük.

Az egyes klasztereken belül a két héten át tartó napok pályáját megvizsgálták a trendek szempontjából. A 2B. Ábrán ugyanazon 5 alanynak a 2A. Ábrán kiemelt mintái összekapcsolódnak az idő folyamán. Az egyes alanyok mintáit megvizsgáltuk, hogy a 2 hetes periódus alatt konzisztens anyagcsere pálya látható-e. Világos volt, hogy az első és az utolsó ponton kívül semmilyen trend nem volt megfigyelhető. Arra számíthattunk, hogy kiterjesztett táplálkozási szabványosítással az egyes alanyok metabolomjai hasonlóbbá válnak, és így a főkomponensek ábráján egy közös helyre mutatnak, de ez nem így van. Az egyes alanyok pontjai az ő metabotípusa alapján maradnak anyagcsere-terükben. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a kiterjedt étrendi standardizálás nem vezethet zavaró variációs forráshoz a klinikai vizsgálatokban, mivel a metabolomák új homeosztázist fejlesztenek ki.

Az 1. nap vagy az utánkövetési minták elválasztásának biokémiai alapjainak vizsgálatához az 5 kiugró értékű alany közül 2-t választottunk példaként, és egyedileg modelleztük őket. 2 tantárgy fő komponenseinek pontszámait és járulék diagramjait mutatjuk be 3. ábra . A pontszámok mindegyikében egy-egy nap egyértelműen túlmutat a főcsoporton. A járulékdiagram hasonlít egy terhelési diagramhoz, de a modellben szereplő változók (a spektrumtartályok) feltárására szolgál, amelyek kifejezetten felelősek a kiugró értékek és a főcsoport elkülönítéséért. Az oszlop nagysága a függőleges tengely mentén jelzi az adott spektrális tartály fontosságát a csoport többi tagjától való eltérés megkülönböztetésében, a jel pedig azt, hogy az adott tartály magasabb vagy alacsonyabb-e a kiugró mezőben. A 3B. Ábra hozzájárulási diagramja azt mutatja, hogy az adott alany metabolikus profilja magasabb volt lipidekben, laktátban és glükózban a következő napokhoz képest. A 3D ábrán látható járulékdiagram magasabb glükózszintet és alacsonyabb lipid- és laktátkoncentrációt mutat a metabolomikus profilban a követési napon, mint a következő napokon.

A fő összetevők pontszámai és hozzászólási ábrái 2 alanyból származnak, amelyek egyetlen napot mutattak, amely egyértelműen elkülönült a többitől. V: Ennek az alanynak a pontszámdiagramját fel kell tüntetni az egyes minták napjaival, és nyilvánvaló, hogy az 1. nap a csoporton kívül esik. B: A járulékdiagram azt mutatja, hogy ez nagyrészt annak köszönhető, hogy az 1. napi mintában megemelkedett a glükóz és a lipid. C: A pontszámdiagram ebből a témából azt mutatja, hogy az utánkövetési (FU) nap egyértelműen különbözött. D: A járulékdiagram azt mutatja, hogy ez a C. panelen látható különbség a lipidek csökkenésének és a glükóz emelkedésének köszönhető. Az abszcissza a járuléktáblán a főkomponens-elemzési modellben alkalmazott spektrumtartályokból áll. Az egyes pontszámdiagramok első és második fő komponensét t [1], illetve t [2] jelöléssel látjuk el.

Vizelet

A vizelet adatait a PCA plot pontszámok mutatják 4A. Ábra . Mivel az összes vizeletmintát 24 órás gyűjtésekben egyesítették, és ez a fajta gyűjtés nem volt lehetséges a 2 hetes követés során, a 2 hetes követés vizeletmintáit nem használták. Általánosságban elmondható, hogy a plot pontszámok a minták szélesebb eloszlását mutatják, ami magasabb interszubjektum-variációt jelez. 5 alany idõpontját ellipszisek határolják a 4A. Ábrán. Ugyanezen 5 alany pontjai összekapcsolódnak a 4B ábrán, hogy megmutassák, hogy a 2 hetes periódus folyamán nincs következetes pálya.

A fő komponensek a vizelet 1 H magmágneses rezonancia spektrumának adatait ábrázolják. A szimbólumok egyedi alanyokat jelölnek, és 11 időpontot tartalmaznak (1–13. Nap, kivéve a 4. és 11. napot; nem gyűjtöttek két héten át követő mintákat). V: 5 alany pontjait ellipszis határolja, hogy bemutassák a csoportosításokat. B: Ugyanazon 5 alany anyagcserepályái egyértelművé teszik, hogy a 2 hét múlva nem történik normalizáció. Az első és a második fő komponenst t [1], illetve t [2] -ként jelöljük.

Mivel a korábbi adatok azt sugallják, hogy a szabályozott étrend miatt bekövetkező metabolom-standardizálás 1 napon belül bekövetkezik, 55 alany vizeletmintáit vizsgálták, akiknek csak 3 napos étrend-standardizálásuk volt. A vizsgálat ezen részéhez az összes alany szérummintája nem állt rendelkezésre. Úgy gondolták, hogy a minták számának növelésével a metabolom finomabb változásai detektálhatók, és így kiderülnek az étrend standardizálásának 3 d-jének bizonyos normalizáló hatásai. Ezeknek az adatoknak a PCA pontszámdiagramjait a 5. ábra . Nyilvánvaló, hogy a minták nincsenek szignifikánsan elválasztva az 1., 2. vagy 3. naptól. Ehhez az adatokhoz felügyelt részleges legkisebb négyzet modellt készítettek (az adatokat nem mutatják be), és az eredmények megerősítették, hogy nincs statisztikailag érvényes elválasztás a napok.

A fő összetevők 55 alany vizeletadatait ábrázolják a vizsgálat 1-3. Napján. Ebben a cselekményben a napokat különböző szimbólumok képviselik. A minták szegregációjának hiánya a 3 d-ből azt jelzi, hogy ennél a nagyobb kohorsznál nem volt kimutatható normalizáció. Az első és a második fő komponenst t [1], illetve t [2] -ként jelöljük.

VITA

Ezt a tanulmányt arra a kérdésre tervezték, hogy az étrend és a környezet gondos ellenőrzésével mennyi normalizálás érhető el az emberi metabolomban. Más vizsgálatok az akut étrend standardizálásának hatásait vizsgálták egészséges emberekben. 2006-ban Walsh és munkatársai (16) 30 egészséges ember alanyának vizeletét, plazmáját és nyálát vizsgálták 4 külön napon, 1 hónap alatt. Megállapították, hogy az étrendi kontrollok nem befolyásolták a szérum és a nyál metabolomáit, de az utolsó látogatás előtti napon a standard vizeletprofil után a vizeletprofilokban csökkent az interszubjektum variáció.

Lenz és munkatársai (14) egy másik tanulmányában 12 egészséges férfit vizsgáltak két külön napon, 14 d különbséggel. Ez a tanulmány nagyobb diverzitást talált az első ürített vizeletek spektrumában, összehasonlítva a 0–12 és 12–24 órás mintákkal. Arra a következtetésre jutottak, hogy az első ürített vizeletek voltak a leginkább változékonyak, és valószínűleg a vizsgálat előtt az alanyok kontrollálatlan étrendje és aktivitása befolyásolta őket.

A szérum metabolom esetében a fent említett vizsgálatok arra a következtetésre jutottak, hogy az étrendi standardizálás a mintavétel előtti napon vagy annak napján nem eredményezett megfigyelhető normalizálódást. Az étrendi beavatkozás kiterjesztésével eredményeink azt mutatják, hogy az alanyok majdnem felénél az 1. naptól kezdődő metabolikus pálya azt jelzi, hogy a metabolom bizonyos mértékű normalizálódása a standardizált étrend egyetlen napjával valósul meg. A kiugró értékek vizsgálata azt mutatta, hogy egy éjszakai böjt után a glükóz- és egyes lipidkoncentrációk eltérnek a standard étrenden 24 óra múlva elértektől. Úgy tűnik, hogy a kalóriakontrollált, szabványosított étrend 24 óra elteltével új homeosztázist teremtett a lipidek és a glükóz számára abban az 5 alanyban, akiknek mintája volt. Két lehetséges oka van annak, hogy ezt a hatást tanulmányunkban láthattuk, és nem a másik 2 vizsgálatban: 1) az étrendi szabványosítás kiterjesztésével tisztább képet kapunk minden ember anyagcsere-teréről, és ezért a kiugró napok jobban elkülönülnek; és 2) a fekvőbeteg vizsgálatok által biztosított szigorúbb étrendi és környezeti ellenőrzések lehetővé tehetik a finomabb hatások megfigyelését.

Walsh és munkatársai (14) és Lenz és mtsai (16) munkájában a vizelet metabolomjának kimutatható normalizálódását figyelték meg akut étrendi standardizálás után. Vizsgálatunkban nem figyeltünk meg standardizálást, de ez nem vitatja Walsh és mtsai, valamint Lenz és mtsai (14, 16) eredményeit. Összegyűjtöttük a 24 órás vizeletmintákat, míg a Walsh és Lenz csoportok az első üreges reggeli és esti gyűjtések jóval változóbb mintáit elemezték. Ésszerű, hogy ezekben az időközpontú mintavételekben az akut étrendi hatások jobban megkülönböztethetők. Lényegében ezeket a hatásokat szó szerint hígítja 24 órás gyűjteményeink. Az a tény, hogy a meghosszabbított étrendi standardizálás nem mutatott további normalizáló hatást a vizelet metabolomjára, azt mutatja, hogy a szérumhoz hasonlóan az étrend normalizáló hatása 24 óra múlva teljes.

Tudomásunk szerint ez a tanulmány az eddigi legmagasabb fokú étrendi és környezeti kontrollt biztosította egy humán metabolomikai kísérlet során. Ezt a vizsgálatot globális NMR-alapú profilalkotás segítségével végezték el, ezért figyelembe kell venni az NMR eredendő érzékenységi korlátjait. A metabolom mikromoláris koncentráció alatti részeit az ebben a vizsgálatban használt analitikai platform nem mutatta ki. Lehetséges, hogy alacsony koncentrációjú komponenseket (pl. Fitokemikáliákat vagy vitaminokat) érzékenyebb módszerrel, például célzott folyadékkromatográfia – tömegspektrometriával lehet kimutatni. A jövőbeni metabolomikai vizsgálatok során úgy tűnik, hogy az egyetlen napig tartó standardizált étrend elegendő lehet az emberi metabolomban elérhető összes normalizálás biztosításához.

Kiegészítő anyag

Köszönetnyilvánítás

A szerzők felelőssége a következő volt: JHW: elvégezte a metabolomikai kísérleteket és a többváltozós statisztikai elemzéseket; MGB: hozzájárult a klinikai vizsgálat megtervezéséhez és segített az eredmények értelmezésében; PBW: megtervezte a klinikai vizsgálatot; és a TMO: megtervezte és megtervezte a metabolomikai kísérleteket, irányította az adatok értelmezését és a kézirat szerzője. A szerzők közül egyiknek sem volt összeférhetetlensége.