Krónikus vesebetegség által kiváltott intesztinális nyálkahártya gátló károsodás, amely a bél oxidatív stressz károsodásával jár

1 Nefrológiai és Reumatológiai Osztály, Sanghaji Tizedik Népi Kórház, Tongji Egyetem Orvostudományi Kar, Sanghaj 200072, Kína

intesztinális

2 Általános sebészeti osztály, Zhongshan Kórház, Fudan Egyetem, Sanghaj 200032, Kína

3 Patológiai Osztály, Sanghaji Tizedik Népi Kórház, Tongji Egyetem Orvostudományi Kar, Sanghaj 200072, Kína

4 Általános Sebészeti Osztály, Sanghaj tizedik népkórház, Tongji Egyetem Orvostudományi Kar, Sanghaj 200072, Kína

Absztrakt

1. Bemutatkozás

A krónikus vesebetegség (CKD) gyakori krónikus betegség, és gyakran fokozatosan a végstádiumú vesebetegségként fejlődik ki [1]. Az átlagos túlélési időszak 4,25 év az urémiás betegeknél, az 1 éves, 3 éves és 5 éves túlélési arány 88%, 68% és 46% [2]. Úgy tűnik, hogy a CKD 1990-ben a 27. a globális halálozások oka volt, de 2010-ben a 18. lett, és a szám az elmúlt években is növekszik [3]. A klinikai gyakorlatban a CKD-ben szenvedő betegeknek több orvosi és szociális ellátásra van szükségük, növelve az orvosi költségeket és befolyásolva az életminőséget [4–7]. Ezért a modern nefrológiában népszerű tevékenység a betegség progressziójának késleltetése és a szövődmények csökkentésére szolgáló hatékony kezelések feltárása.

Ezenkívül, mint tudjuk, sok urémiás toxin található a CKD-s betegek testében, különösen a belekben [23]. Ezek az urémiás toxinok oxidatív stressz károsodást okozhatnak a szervekben vagy a szövetekben, amikor a megnövekedett szabad gyökök oxigénfajtái elnyomják a szervezet normális képességét azok eltávolítására [24, 25]. A malondialdehid (MDA) a lipid peroxidáció végterméke az oxidatív stressz folyamatában, és a szuperoxid-dismutáz (SOD), a kataláz (CAT) és a glutation-peroxidáz (GSH-PX) a fő antioxidáns enzim, amely megvédi a testet az oxidatív stressz okozta sérüléstől . Ezeket a biomarkereket gyakran használják az oxidatív stressz értékelésére számos kutatásban [26–28]. Mindazonáltal mindeddig nem ismert, hogy az oxidatív stressz károsodás részt vesz-e a bél nyálkahártya gátjának károsodásában a CKD progressziójában.

Jelen tanulmányunkban ezért azt a célt kívánjuk megvizsgálni, hogy a bél nyálkahártya gátja sérült-e vagy sem a CKD progressziójában, és az oxidatív stressz állapota felelős-e a mögöttes mechanizmusért.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Állatok és etikai nyilatkozat

Egészséges felnőtt hím Sprague-Dawley patkányokat (súlya 170-200 g) a kínai Sanghaji Sanghaji Tizedik Népkórházból szereztünk be. A patkányokat laboratóriumunkban, hőmérséklet és páratartalom szabályozott környezetben helyeztük el. Valamennyi patkányt normál 12 órás fény/sötét ciklus alatt helyeztük el, és az ételhez és a vízhez ad libitum hozzáférést kaptunk. Ezt az állathasználati és gondozási protokollt és kísérleti eljárásokat a Sanghaji Tizedik Népi Kórház Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága vizsgálta felül és hagyta jóvá. A kísérleteket a Nemzeti Egészségügyi Intézet laboratóriumi állatok felhasználására vonatkozó irányelveinek megfelelően is elvégezték.

2.2. Kísérleti protokoll és mintagyűjtés

Egy hét adaptációs periódus után hatvannégy patkányt véletlenszerűen két csoportra osztottak: egy kontroll csoportra és egy uremia csoportra, mindegyikből 32. Az urémia patkánymodelljét 5/6 vese reszekció indukálta, az előző vizsgálatban leírtak szerint [29]. Röviden, 2% pentobarbitál-nátrium (3,5 ml/kg) szubkután injekcióval történő teljes érzéstelenítés után az urémiás csoportba tartozó patkányok laparotómiát hajtottak végre 2 cm hátsó metszéssel, majd a bal vese 2/3-át eltávolították, és hét napokkal később az egész jobb vesét eltávolították. A kontrollcsoport ugyanazt a két eljárást hajtotta végre, de minden vese reszekció nélkül. A műtéti eljárásokat aszeptikus környezetben, szabályozott hőmérséklet és páratartalom mellett végezték.

A posztoperatív 4., 6., 8. és 10. héten véletlenszerűen nyolc patkányt választottak ki az egyes csoportokból, és az állatok teljes érzéstelenítése után vér- és bélszövetmintákat vettek. Vérmintákat nyertünk az alsó vena cava-ból, és a szérumot 1500 fordulat/perc sebességű centrifugálással készítettük 15 percig 4 ° C-on, majd a szérumot -80 ° C-on tároltuk a citokinek és a D-laktát elemzéséhez. (D-LA) szintek és a diamin-oxidáz (DAO) aktivitás. A terminális ileumot a bélpermeabilitás, az oxidáns és antioxidáns szint, valamint a hisztopatológia elemzésére gyűjtöttük. Megjegyzendő, hogy a terminális ileum vizsgálati helyként való kiválasztása a korábbi tanulmányokon alapult [30–32]. Ezek a tanulmányok azt mutatták, hogy a terminális ileum a fő hely a bél nyálkahártya gátjának károsodásának megfigyelésére különböző betegségek esetén. Azt javasoljuk, hogy a terminális ileum a bélrendszer legérzékenyebb szakasza [33].

2.3. Alfa szérum tumor nekrózis faktor (TNF-α), Az interleukin-6 (IL-6) és az IL-10 meghatározása

A citokinek tumor TNF szintje-α, A szérumban található IL-6 és IL-10 értékeket ELISA készlet alkalmazásával határoztuk meg patkányok számára (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) a gyártó utasításainak megfelelően. Az értékeket pg/ml-ben fejeztük ki a szérumban.

2.4. Szérum D-LA és DAO meghatározása

A szérum D-LA szintjét és DAO aktivitását patkányok ELISA készleteivel határoztuk meg (D-LA, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA; DAO, Nanjing Jiancheng Biocompany, Nanjing, Kína) a gyártó utasításainak megfelelően. . A D-LA szintet mmol/l-ben fejezték ki a szérumban, és a DAO-aktivitást U/ml-ben fejezték ki a szérumban.

2.5. Béláteresztés meghatározása

A bélpermeabilitást a fluoreszcein-izotiocianát-dextrán (FD4) bél clearance-jének mérésével határoztuk meg, amint azt korábbi tanulmányainkban közöltük [15, 30, 34]. Röviden, egy 8 cm hosszú terminális ileum szegmenst gyűjtöttünk össze, és a nyálkahártyát óvatosan kifordítottuk. Az egyik végén a bélszekciót ligáltuk, a másik végéből pedig egy bélzsákot készítettünk 1,0 ml Krebs-Henseleit-hidrogén-karbonát-puffer injektálásával. A megtöltött zsákot ezután 0,5 mg/ml FD4-et (átlagos molekulatömeg: 4000) tartalmazó oldatban inkubáltuk kontrollált hőmérsékleten, 37 ° C-on. A fürdőoldatot 5% CO2 és 95% O2 tartalmú gázkeverékkel történő óvatos buborékoltatással is levegőztetjük. Harminc perccel később a nyálkahártya felületének értéke (

) mértük. Ezután az oldat fluoreszcenciáját fluoreszcencia spektrofotométerrel mértük, és az FD4 bél clearance-ét a következő képlet szerint számítottuk:

Ebben a képletben az FD4 nyálkahártya és szerózis közötti clearance-e μL · min −1 · cm −2, az FD4 koncentráció a bélzsákból leszívott szerosális folyadékban a 30 perc periódus végén, az FD4 koncentráció a bél tasakból leszívott nyálkahártya folyadékban a 30 perc periódus, a bélzsák hossza és a bélzsák átmérője.

2.6. Bél MDA, SOD, CAT és GSH-PX meghatározása

A terminális ileumot homogenizáltuk és 4000 fordulat/perc sebességgel 15 percig 4 ° C-on centrifugáltuk, majd a felülúszót kaptuk. Az MDA szintjét és az SOD, CAT és GSH-PX aktivitását a felülúszókban a kereskedelmi elemző készletek (Nanjing Jiancheng Biocompany, Nanjing, Kína) felhasználásával határoztuk meg a gyártó utasításainak megfelelően. Az MDA szintet nmol/mg-ban fejeztük ki a szövetben, és az SOD, CAT és GSH-PX aktivitást U/mg-ban fejeztük ki a szövetben.

2.7. Szövettani megfigyelés

A terminális ileumot 10% pufferolt formaldehiddel rögzítettük és paraffinba ágyazottuk. 4 szelet μm vastagságúakat készítettünk, hematoxilinnal és eozinnal (H&E) festettük, majd két patológus megfigyelte ezt a vizsgálati tervet fénymikroszkóppal. A gyulladásos sejtek, például a neutrofilek behatolását alkalmazták a bélnyálkahártya és a submucosa bélgyulladásának felmérésére [30]. A bél nyálkahártya sérülésének mértékét kvantitatívan értékelték Chiu és mások által közölt pontrendszerrel. [35].

2.8. Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SD-ként fejeztük ki. A statisztikai elemzéseket az SPSS 17.0 szoftver (SPSS Inc., Chicago, USA) segítségével végeztük. Az adatok először homogenitási tesztet kaptak a variancia szempontjából, majd a Student's segítségével elemezték őket

-teszt, kivéve Chiu pontszámait egyirányú varianciaanalízissel, majd a legkevésbé szignifikáns különbség tesztet a többcsoportos összehasonlításokhoz. A különbségeket statisztikailag szignifikánsnak tekintették, amikor

3. Eredmények

3.1. Általános észrevételek

Valamennyi patkány túlélte az egész kísérletet. A műtét után négy héttel sikeresen kiváltották az uremia kifejezett patkánymodelljét, amelyet a szérum kreatinin-koncentráció és a vér karbamid-nitrogén növekedése jelez (1. ábra). A kontroll patkányokhoz képest az urémiás csoportban a táplálékfelvétel és a mozgásszervek nyilvánvalóan csökkentek.


, kontra kontrollcsoport.

3.2. A citokinek TNF szérumszintje-α, IL-6 és IL-10

Az eredményeket a 2. ábra mutatja. A TNF szérumszintje-α, Az uremia csoportban az IL-6 és az IL-10 az idő múlásával növekvő tendenciát mutatott, és ezek a citokinszintek minden vizsgált időpontban magasabbak voltak, mint a kontroll csoportban. A proinflammatorikus citokin TNF-hez-α, a posztoperatív 10. héten szignifikáns különbség volt az urémiacsoport és a kontrollcsoport között (). Az IL-6 proinflammatorikus citokin esetében a két csoport közötti különbség a posztoperatív 8. és 10. héten ért el jelentőséget (). Ezenkívül a posztoperatív 8. és 10. héten az uremia csoport gyulladásgátló citokin IL-10 szérumszintje szintén szignifikánsan emelkedett, összehasonlítva a kontroll csoportéval ().


, a kontrollcsoporttal szemben ugyanabban az időpontban.

3.3. Szérum D-LA szintek és DAO aktivitás

Az eredményeket a 3. ábra mutatja. A szérum D-LA szintek és a DAO aktivitás az uremia csoportban az idő múlásával növekvő tendenciát mutattak, és ezek a biomarker szintek minden vizsgált időpontban magasabbak voltak, mint a kontroll csoportban. A D-LA esetében szignifikáns különbség volt az urémiás csoport és a kontrollcsoport között a posztoperatív 6., 8. és 10. héten (). A DAO esetében a két csoport közötti különbség a posztoperatív 8. és 10. héten ért el jelentőséget ().


, a kontrollcsoporttal szemben ugyanabban az időpontban.

3.4. Béláteresztő képesség

Az eredményeket a 4. ábrán mutatjuk be. Az uremia csoportban az FD4 bél clearance-e az idő múlásával növekvő tendenciát mutat, és ezek a biomarker-szintek minden vizsgált időpontban magasabbak voltak, mint a kontroll csoportban. A posztoperatív 8. és 10. héten az uremia csoport FD4 bél clearance-e szignifikánsan megnőtt, összehasonlítva a kontroll csoportéval ().


, a kontrollcsoporttal szemben ugyanabban az időpontban.

3.5. Hisztopatológia

Az eredményeket az 5. ábra mutatja. Az urémiás csoport és a kontrollcsoport közötti bélszövetben nem figyeltünk meg nyilvánvaló szerkezeti sérülést az összes vizsgált időpontban. Ugyanakkor ödémát és gyulladásos sejteket figyeltek meg a bél nyálkahártyájában és a submucosában az uremia csoportban, összehasonlítva a kontroll csoportéval. Ezenkívül, amint az a 6. ábrán látható, az urémia csoport a Chiu pontszámának növekedését mutatta az idő múlásával, és a posztoperatív 8. és 10. hét pontszáma magasabb volt, mint a posztoperatív 4. héten ().



, versus uremia csoport POW 4-ben.

3.6. Az MDA, SOD, CAT és GSH-PX bélszintje

Az eredményeket a 7. ábra mutatja. Az uremia csoportban az MDA, SOD, CAT és GSH-PX bélszintje idővel növekvő tendenciát mutatott, és ezek a biomarker szintek a vizsgált időszakban magasabbak voltak, mint a kontroll csoportban pontokat. Az MDA és a SOD esetében ezek közötti különbségek az uremia és a kontroll csoport között a posztoperatív 8. és 10. héten értek el jelentőséget (). Ezen túlmenően a posztoperatív 10. héten az urémiás csoport GSH-PX bélszintje szignifikánsan megemelkedett a kontrollcsoportéval összehasonlítva (). Az uremia csoport CAT bélszintje azonban nem emelkedett szignifikánsan a kontroll csoportéval összehasonlítva az összes vizsgált időpontban (


, a kontrollcsoporttal szemben ugyanabban az időpontban.

4. Megbeszélés

A CKD gyakori krónikus betegség, és gyakran fokozatosan a végstádiumú vesebetegségként fejlődik ki [1]. A klinikai gyakorlatban a CKD-ben szenvedő betegek gyakran szenvednek különböző szövődményektől [8, 12], ezért szükségük lehet több orvosi és szociális ellátásra, növelve az orvosi költségeket és befolyásolva az életminőséget [4–6]. A szövődmények csökkentésének fő célja a betegség progressziójának késleltetése. A CKD által követett szövődmények okához azonban korlátozott számú tanulmány kapcsolódik. Mint tudjuk, a különböző fertőző betegségek a CKD egyik fő szövődménye, és a CKD romlásához vezethetnek [8–10]. Például a tüdőfertőzésben szenvedő urémiás betegeknél a halálozás drámaian megnőhet, és a fertőző betegségek a vesék és más szervek vagy szövetek további károsodásához is vezethetnek [12]. Azonban ezeknek a fertőzéseknek a kiindulási helye a CKD progressziója után még mindig nem ismert.

Összefoglalva, eredményeink arra utalnak, hogy az előrehaladott CKD a bél nyálkahártya gátjának károsodását idézheti elő, és tovább szisztémás gyulladáshoz vezethet, és az alapul szolgáló mechanizmus összefüggésbe hozható a bél oxidatív stressz károsodásával. Ezért a bél nyálkahártya gát funkciójának hatékony módszerekkel történő megőrzése potenciális célpontnak tekinthető a CKD progresszióját követő fertőző szövődmények megelőzését célzó terápiákban.

Versenyző érdekek

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek versengő érdekeik.

Köszönetnyilvánítás

Jelen tanulmányt a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (81101414) támogatta. A szerzők köszönetet mondanak a Kínai Sanghaji Tongji Egyetemhez tartozó központi laboratórium, a Sanghaji Tizedik Népkórház személyzetének kiváló technikai segítségükért.

Hivatkozások