Mareya Micrantha (Benth) Mull antikolinészteráz tulajdonságai

International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology

mull

Napló menü

Kivonatolás és indexelés

Mareya Micrantha (Benth) Mull antikolinészteráz tulajdonságai. Arg. (Euphorbiaceae) és frakciói az izolált nyúl duodenum kolinészteráz modelljén

Cikk információk

Dosso 1 *, T.Y. Soro 2, M. A. Mérleg 1, F. Traore 2, J. D. N’guessan 3

1 Biokémiai-genetikai tanszék, UFR Biológiai Tudományok, Peleforo Gon Coulibaly Egyetem, B.P 1328 Korhogo, Elefántcsontpart

2 Állatfiziológiai laboratórium, UFR biológiai tudományok, Félix Houphouët-Boigny Egyetem, B.P. 22 582 Abidjan22, Elefántcsontpart

3 Laboratóriumi farmakodinamikai biokémia, Biotudományi Tanszék, Félix Houphouët-Boigny Egyetem, 22 BP 582 Abidjan 22, Elefántcsontpart

*Levelezési cím: Mamadou Dosso, Biokémiai-Genetikai Tanszék, UFR Biológiai Tudományok, Peleforo Gon Coulibaly Egyetem, B.P 1328 Korhogo, Elefántcsontpart

Fogadott: 2020. május 20 .; Elfogadott: 2020. június 01 .; Közzétett: 2020. június 05

Idézet: Mamadou Dosso, Tianga Yaya Soro, Michel Archange Libra, Flavien Traore, Jean David N’guessan. Mareya Micrantha (Benth) Mull antikolinészteráz tulajdonságai. Arg. (Euphorbiaceae) és frakciói az izolált nyúl duodenum kolinészteráz modelljén. International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology 11 (2020): 121-130.

Absztrakt

Absztrakt

Az afrikai gyógyszerkönyvben hashajtóként használt növény, a Mareya micrantha antikolinészteráz tulajdonságainak vizsgálatát a nyúl duodenum kolinészterázain végezték. 0,15 mg/ml koncentrációban a vizes kivonat (MAR), annak frakciója (F5) és részfrakciója (F52), a tisztaság állapotától függően, csökkenti a kolinészterázok katalitikus sebességét az acetiltiokolin (ASCh) hidrolízise során, anélkül, hogy jelentősen befolyásolná a Michaelis-állandót. A biovezérelt vizsgálat során a legjobb anti-kolinészteráz- és myostimuláns hatású alfrakció (F52) 25% -kal hatékonyabb, mint a MAR. Az F52 részfrakció nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) kromatogramjának vizsgálata azt mutatja, hogy ez a növény gazdag fenolos molekulákban.

Kulcsszavak

Hashajtó; Mareya micranth; Töredék; Kolinészterázok; HPLC

Cikk részletei

Bevezetés

Anyagok és metódusok

Növényi anyag

A Mareya micrantha friss leveleit Akoupé helységben gyűjtötték össze 2007 júniusában, amelyeket Pr Ake Assi Laurent, a Félix Houphouët-Boigny Egyetem (Elefántcsontpart) Növénytani Tanszékéről azonosított és hitelesített. Azonosítást követően az egyik példányt 1804 szám alatt letétbe helyezték a Félix Houphouët-Boigny Egyetem Nemzeti Florisztikai Központjának herbáriumában.

Állati anyag

Farmakológiai és enzimatikus kísérleteinkhez az Oryctolagus cuniculus (Leporidae) fajba tartozó nyulakat használtuk, Abobo községből (Abidjan, Elefántcsontpart). Súlyuk átlagosan 2 kg volt, és egy héten át környezeti körülmények között (28 ° ± 3 ° C) akklimatizálódtak a Félix Houphouët-Boigny Cocody Egyetem Biosciences Training and Research Unit (UFR) állattartó házában. A fotoperiódus 12/24 óra.

Kísérleti eszköz

A kísérleti eszköz egy termosztáttal szabályozott vízfürdőből, egy Mac Ewen típusú fiziológiás oldattal töltött szigetelt szervtartályból áll, amely a készüléktől 40 cm-re van elhelyezve. Az injekciós üvegekben lévő folyadékokat polivinil-katéterekbe, majd tekercsekbe helyezzük, amelyek lehetővé teszik ezeknek az oldatoknak a felmelegedését 38 ° C-os hőmérsékletre. Ezt a folyadékellátást egy többutas választószelep vezérli. A szigetelt szervedény a készülék alján lévő lefolyón keresztül üríthető.

Mód

Módszer a Mareya micrantha vizes kivonatának előállítására

A Mareya micrantha leveleit levegőn szárítottuk, majd összetörtük. Nyolcvan gramm száraz port összekevertünk két liter desztillált vízzel. Az elegyet szobahőmérsékleten 24 órán át rázattuk keverő (AGIMATIC-N) segítségével. A macerált keveréket vattán átszűrjük. A szűrletet Buchi rotációs bepárlóval 70 ° C-on bepároljuk. A teljes bepárlás után port kapunk, amelynek egy részét vizes kivonatként (MAR) használjuk, a másik részét pedig frakcionáljuk.

A vizes extraktum frakcionálásának megosztási módszere

1,5 g Mareya micrantha vizes extraktumát feloldjuk egy liter 70% -os etanolban (etanol/víz; 70/30; v/v). Az elegyet 6 órán át keverjük, majd 24 órán át egy elválasztólombikban állni hagyjuk. Hidraulikus alkoholos felülúszót (F1) és csapadékot (P) kapunk, külön gyűjtjük össze, majd Buchi rotációs bepárlóval 60 ° C-on bepároljuk. A kapott pelletet szárítószekrényben 50 ° C-on szárítjuk. Az F1 egy részét, amelyet ciklohexán-víz keverékkel (5: 5; v/v) veszünk fel, ugyanezen eljárásnak vetjük alá. Ciklohexán-frakciót (F2) és vizes frakciót (F3) kapunk. A vizes fázisból nyert kivonatot (F3) etil-acetát és víz 5: 5 térfogatarányú elegyével felvesszük. Az oldatot ugyanolyan kezelésnek vetik alá, mint a többi keveréket. Etil-acetát frakciót (F4) és vizes frakciót (F5) kapunk. A biovezérelt vizsgálat által feltárt 1371,42 mg erősségű F5 mutatja a legjobb myostimuláns hatást. Ezért a szilárd-folyékony frakcionáláshoz megmarad.

Szilárd-folyékony frakcionálás módszere az F5 Sephadex G25 gélén

800 mg 10 ml desztillált vízben oldott F5 frakciót vezetünk át egy Sephadex G25 gél oszlopon (50 cmx1,5 cm), desztillált vízzel, mint mozgófázist. Az eluálás sebességét 2 ml/perc értékre állítottuk be. 10 ml térfogatot gyűjtöttünk, majd ccm profiljuk alapján három F51, F52 és F53 alfrakcióba csoportosítottuk. Ezeket a frakciókat csökkentett nyomáson elpárologtattuk BÜCHI 461 Water Bath rotációs bepárlóval. A kapott porokat fiziológiai vizsgálatokhoz használtuk, és a legjobb pozitív inotrop hatású F52-et RP-HPLC (C18) preparatív készülékkel elemeztük.

Eljárás enzimkivonat előállítására

Az enzimkivonat elkészítésének módszere Khoa és Ochillo (1987) (Khoa et al., 1987) módszerén alapszik, amelyet Bahi (1998) vett át. 24 órás böjt után a nyulat ütővel a nyakán megdöbbentik, és gyorsan elvérzik a nyaki artérián. A középvonalas laparotómiát követően négy gramm belet (duodenum) azonnal eltávolítunk, majd 0,5 M mono- és dinátrium-foszfátpufferbe (pH 7,8) merítünk, majd egy T 25 mikrorészmalommal 2500 fordulat/perc sebességgel 2 percig aprítunk. A kapott őrleményt ezután 2500 fordulat/perc sebességgel fél órán át centrifugáljuk egy Alresa centrifugában. A kapott felülúszó képezi az enzimkészítményt.

Ellman-reagens előállításának módszere enzimvizsgálatokhoz

A teljes kolinészteráz aktivitás vizsgálatát Ellman szubsztrátreagensével, acetiltiokolinnal (ASCh) végezzük 0,014 M koncentrációban, 0,4 g acetiltiokolin-jodiddal elkészítve 100 ml foszfátpufferben. Az Ellman-reagenst 100 µl 0,014 M acetiltiokolin-jodid, 100 µl 0,01 M DTNB (ditiobisznitrobenzoát) (0,4 g DTNB 100 ml 0,5 M foszfátpufferben (pH = 7,8) feloldásával) és 800 µL 0,5 M foszfátpuffer, pH 7,8.

Módszer a nyúl duodenum kolinészterázok aktivitásának vizsgálatára az effektor jelenlétében és hiányában

A kolinészteráz aktivitás vizsgálatához 100 µl Ellman-reagenst növekvő koncentrációjú acetil-tiokolin (10–5–10–2 M) koncentrációval adunk a reakcióközeghez. Ez a táptalaj 1 ml foszfátpuffert (0,5 M, pH 7,8) és 50 ul enzimoldatot tartalmaz, amelyet 38 ° C-on 5 percig inkubáltunk. 10 perces inkubálás alatt a kolinészterázok 30 µl effektor jelenlétében vagy hiányában 0,15 mg/ml koncentrációban hidrolizálják az Ellman-reagensből az acetiltiokolint (változó koncentrációban). A hidrolízis termékei acetát és tiokolin, amelyek a DTNB-vel reagálva sárga színt kapnak, amelynek intenzitását spektrofotométerrel mérjük 412 nm-en, enzimoldatot nem tartalmazó kontrollal szemben. Az optikai sűrűség (OD) változása a kontrollhoz viszonyítva, az inkubációs idő (dA/min) függvényében mért és ábrázolt ábrázolja a kezdeti sebességet. A LINERWEAVER-BURK ábrázolás (1/V az 1/S függvényében) ezekből az értékekből épül fel, és a Vmax és KM meghatározására szolgál.

Az izolált szerv eltávolításának és elhelyezésének módszere

A 24 órán át koplaló nyulat kiütik. A középvonalas laparotómiát követően a nyombél 3 cm hosszú szegmenseit azonnal eltávolítják, és életben tartják glükóz- és oxigenizált Mac Ewen-oldatban. Az egyik fragmenst a felvevő készülékre helyezzük egy 250 ml Mac Ewen-t tartalmazó lyukba (mM) Nacl 130; Kcl 2,5; Cacl2 2,40; NaH2PO3 1,18; NaHCO3 11,90; MgCl2 0,24; 2,2-es glükóz (pH = 7,4) folyamatosan oxigénnel és 38 ° C-os hőmérsékleten.

A duodenum töredékének falán áthaladó huzal segítségével egy csomót készítenek a duodenum töredékének egyik végén, amely lehetővé teszi, hogy a szigetelt szervedény belsejébe bekapcsolódjon. A másik végét egy másik huzal köti össze az érintőceruzával, amelynek hegye érintkezik egy fekete füsttel bevont papírral, amelyet állandó sebességű forgatásnak vetnek alá.

Kísérleti protokoll

Osztályozott fecskendővel a vizsgálati anyagokból készített hígítások egy részét 250 ml Mac Ewent tartalmazó edénybe vezetjük. Az egyik tesztről a másikra lépéshez a készítményt alaposan mossuk Mac Ewennel (750 ml), hogy elkerüljük a vizsgált anyagok kumulatív hatását.

Módszer az F52 részfrakció fenolos alkotóelemeinek elemzésére

Az F52 frakció fenolos alkotóelemeinek elemzéséhez a variáns RP-HPLC (C-18) készüléket alkalmaztuk, PDA (fotodióda tömb) detektorral felszerelve. Az injektálási térfogat 20µl, az elemzési hőmérséklet 25 ° C és a szivattyú áramlási sebessége 1 ml/mn. Az elemzés során használt mobil fázisok: víz 0,1% TFA-val az A eluenshez és acetonitril a B eluenshez. Az elemzéshez használt különböző gradiensek: mobil fázis [T = 0: 95% (A), 5% (B) ]; [T = 10: 85% (A), 15% (B)]; [T = 45 70% (A), 30% (B)]; [T = 50: 0% (A), 100% (B)]; [T = 55: 0% (A), 100% (B)].

Statisztikai analízis

A statisztikai adatokat átlag ± standard hibaként (M ± SEM) fejezzük ki (n = 4) külön kísérletből. A kiszámított átlagokat összehasonlítottuk a Student (t) teszttel. Ha p ≤ 0,05, akkor a különbség szignifikánsnak mondható. A görbéket és a statisztikai elemzéseket a Graph Pad Prism 5.01 (San Diego, CA, USA) segítségével végeztük.

Eredmények

A MAR hatása a nyúl duodenum teljes kolinészteráz aktivitására

Az 1. ábra mutatja a 0,15 mg/ml koncentrációjú MAR hatását az összes kolinészteráz katalitikus aktivitására a nyúl duodenumában. MAR jelenlétében a maximális sebesség és affinitás állandóság értéke 83,3 µM/perc (P 1 µM/mn)