Mérsékelt vagy rendkívül elhízott esetekben gazdag a nagy másolatszám-variáció

Absztrakt

CÉLKITŰZÉS Az elhízás egyre gyakoribb rendellenesség, amely számos betegségre hajlamosít, beleértve a 2-es típusú cukorbetegséget is. Megvizsgáltuk, hogy a nagy és ritka példányszám-variációk (CNV-k) megkülönböztetik-e a közepes és a végletes elhízást a soha nem túlsúlyos kontroll alanyoktól.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK Egyetlen nukleotid polimorfizmus (SNP) tömbök felhasználásával 430 elhízott esettel (BMI> 35 kg/m 2) és 379 soha nem túlsúlyos kontrollalanyon (BMI 2) hajtottunk végre egy genomra kiterjedő CNV felmérést. Valamennyi alany európai származású volt, és genotipizálva volt az Illumina HumanHap550 tömbökön ~ 550 000 SNP markerrel. A CNV hívásokat a PennCNV szoftver generálta.

EREDMÉNYEK Az 1 Mb-nál nagyobb CNV-ket felülreprezentálták a kontrollal szemben (esélyhányados [OR] = 1,5 [95% CI 0,5–5]), és a 2 Mb-nál nagyobb CNV-k az esetek 1,3% -ában voltak jelen, de hiányoztak kontroll alanyok (OR = végtelen [95% CI 1,2 – végtelen]). A géneket megzavaró ritka deléciókra összpontosítva még hangsúlyosabb hatásméretek figyelhetők meg (OR = 2,7 [95% CI 0,5–27,1] a CNV-k> 1 Mb esetén). Érdekes módon az elhízott esetek, akik ezeket a nagy CNV-ket hordozzák, közepesen magas BMI-vel rendelkeznek, és nem tűnik szélsőséges esetnek. Számos CNV megzavarja az elhízás ismert jelölt génjeit, például egy 3,3 Mb-os deléció az NAP1L5-et és egy 2,1 Mb-os deléció az UCP1-et és az IL15-et.

KÖVETKEZTETÉSEK Eredményeink azt sugallják, hogy a nagy CNV-k, különösen a ritka deléciók, az elhízás kockázatát jelentik a közepes elhízásban szenvedő betegeknél, és hogy a nagy CNV-k által érintett gének érdekfeszítő jelölteket jelentenek az elhízás szempontjából, ami további tanulmányokat indokol.

Az elhízás világszerte a leggyakoribb egészségügyi rendellenességgé vált. Az elhízás hajlamosít több betegségre, különösen a cukorbetegségre, és becslések szerint ennek eredményeként a várható életkor a következő generációban csökkenhet (1). Számos tanulmány kimutatta, hogy a testtömeget és az elhízást nagymértékben befolyásolják a genetikai tényezők, az örökölhetőség becslése 65-80% között mozog (2). Az egyes génmutációk azonban meglehetősen ritkák, és a gyakori variáció (például az FTO-ban [3] és az MC4R-ben [4]) a családi kockázat kis százalékát teszi ki. A genom egészére kiterjedő asszociációs vizsgálatok (GWAS) legújabb nagyszabású metaanalízise további hat gént azonosított, amelyek társulnak a BMI-vel, de mind a nyolc gén együttesen csak az emberi populációk BMI-variációjának csupán 0,84% -át magyarázza (5). Ezért nem valószínű, hogy a mintaméretek bővítése a GWAS-ban azonosítani fogja azokat a gyakori variánsokat, amelyek fő hatásmérettel rendelkeznek.

A kópiaszám-variációk (CNV-k) vizsgálata újszerű betekintést nyújt a gyakori és összetett emberi betegségek genetikai felépítésébe. A CNV-k kromoszomális szegmensként definiálhatók, amelynek kópiaszáma a populáció egyénenként változó (6). A kóros elhízás eseteinek 0,7% -át jelentik a visszatérő CNV-k, például a 16p11.2 deléciók (7). Ezenkívül számos jelentés kimutatta, hogy a nagy és ritka CNV-k együttesen társulnak a skizofrénia (8–10), a szélsőségesen korán megjelenő elhízás (11) és a BMI variációi (12).

A jelenlegi tanulmányban megvizsgáltuk a ritka variánsok potenciális szerepét az elhízásban, összehasonlító CNV-analízist végezve elhízott esetek és kontroll alanyok esetében, akiket az Illumina single nucleotide polymorphism (SNP) tömbök genotipizáltak. Az eseteknél közepes vagy rendkívüli elhízás volt tapasztalható, a kontroll személyek pedig soha nem voltak túlsúlyosak. Bár mintánk nagysága kizárja az elhízással társuló specifikus CNV-k/gének végleges azonosítását, bebizonyítjuk, hogy a nagy, mégis ritka CNV-k csoportosan együttesen társulnak az elhízással. Ezenkívül azonosítottunk korábban érintett elhízási jelölt géneket ezekben a nagy és ritka CNV-kben, ami különösen vonzóvá tette őket további nyomonkövetési vizsgálatok és funkcionális vizsgálatok szempontjából.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK

Elhízott esetek és kontrollalanyok.

Az esetek elhízottak voltak (BMI ≥35 kg/m 2), életük BMI> 40 kg/m 2. Független kontrollalanyokat választottak ki, akiknek aktuális és élettartama BMI ≤25 kg/m 2 volt. Az összes eset és kontroll alany, aki részt vett a jelenlegi vizsgálatban, egy korábbi jelölt génvizsgálat része volt (13). A minta jellemzőit az 1. táblázatban foglaltuk össze 430 esetben és 379 kontrollal, akik minőségellenőrzésen mentek keresztül. Az elhízás kezdetén a medián életkor 12 év volt, és 90% -uk 26 éves kor előtt volt. Minden alany megalapozott beleegyezést adott, és a protokollt jóváhagyta a Pennsylvaniai Egyetemen az embereket érintő vizsgálatok bizottsága.

A vizsgálati alanyok mintadarabjai a CNV vizsgálatban

SNP genotipizálás.

A DNS-t teljes vérből vagy limfoblasztoid sejtvonalakból extraháltuk magas sótartalmú módszerrel, és az Illumina HumanHap550 SNP tömbökön (Illumina, San Diego, Kalifornia) genotipáltuk. A genotípus-jelek feldolgozásához az Illumina szabványos adat-normalizálási eljárásait és a kanonikus genotípus-fürtözési fájlokat használtuk. Valamennyi eset- és kontrollalany megfelelt a hívási arány (> 95%) mértékének, és genetikailag arra következtettek, hogy európai származásúak, a többdimenziós skálaelemzés alapján (1. ábra az online függelékben, elérhető a http: //diabetes.diabetesjournals címen). org/cgi/content/full/db10-0192/DC1).

CNV hívás.

Az összes marker log R arányának és B allél frekvenciájának mérésével a CNV hívásokat PennCNV szoftver (2009Aug27 verzió) generálta (14). A minőség-ellenőrzési eljárást részletesen a 2. ábra részletesen leírta. Alacsony minőségű jelintenzitás-értékeket tartalmazó mintákat távolítottunk el, így a fennmaradó minták log R aránya 50 kb), az immunglobulin régiókban és a centromerás régiókban történt hívások és telomer régiók (100 kb a kromoszómák elején vagy végén). A CNV hívások átfedő génjeit vagy exonjait a scan_region.pl program segítségével jegyzeteltük, RefSeq gén annotáció alapján (15). Összeállítottunk egy sor közös CNV régiót (cCNVR), amelyek> 1% frekvencián fordulnak elő, majd a scan_region.pl program által a CNV hívást általánosnak vagy ritkának minősítettük: ha a CNV hívás> 50% -a átfedésben van egy cCNVR-rel, közös CNV-ként emlegetik. A CNV hívások számának összehasonlítását az eset és a kontroll alanyok között t-próbával, míg a frakcióminták és a nagy CNV-k összehasonlítását Fisher-pontos teszttel végeztük.

EREDMÉNYEK

CNV hívás és minőségellenőrzés.

Annak megvizsgálására, hogy a CNV-k jelentik-e az elhízás genetikai kockázati tényezőit, elemeztük a CNV-felhívásokat 430 elhízott esetre és 379 kontrollalanyra, akiket az Illumina SNP tömbök genotipizáltak, és minőség-ellenőrző intézkedéseket hajtottak végre a CNV elemzéséhez. A minta jellemzőit az 1. táblázat ismertette. Először összehasonlítottuk a CNV hívások általános jellemzőit az eset és a kontroll alanyok között. Az egy alanyra jutó CNV-k száma nem különbözött az eset és a kontroll alanyok között (5,8 ± 3,3 vs. 6,0 ± 3,1, P = 0,35). A géneket megbontó CNV-k száma alanyonként hasonló az esetekhez képest, mint a kontrollal (3,8 ± 3,1 vs. 4,2 ± 2,7, P = 0,07). Hasonlóképpen, az egyénre jutó exonikus CNV-k száma hasonló az esetekhez képest, mint a kontrollal (3,2 ± 2,9 vs. 3,6 ± 2,6, P = 0,06). Összeállítottuk a közös CNV régiók listáját, és megállapítottuk, hogy a CNV hívások 38,2% -a ritka CNV-k közé sorolható. A ritka CNV-k száma alanyonként nem különbözött az elhízott esetek és a kontroll alanyok között (2,3 ± 2,4 vs. 2,2 ± 1,8, P = 0,41).

A nagy CNV-k felülreprezentáltak elhízott esetekben.

Ezután összehasonlító elemzést végeztünk a CNV hívásokon, méretük, közös/ritka státusuk és törlés/duplikáció státusuk szerint rétegezve. Érdekes módon a növekvő méretküszöböknél erősebb asszociációs tendenciát (esélyhányados [OR]) figyelünk meg a CNV-k és az elhízás között (2. táblázat). Hasonlóan a skizofrénia eseteiről szóló korábbi jelentésekhez (8), azt is megállapítottuk, hogy az esetek 5/427 (1,2%) alanya, de egyik kontrollalany sem hordozza a CNV-t> 2 Mb (OR = végtelen [95% CI 1,16 a végtelenig]), P = 0,04). Vizsgálatunkban a 2 Mb-nál nagyobb CNV-t hordozó elhízott esetek gyakorisága hasonló Kirov és mtsai. tanulmány (16) (471-ből 6, 1,3%) és a Need et al. tanulmány (8) (1401/1013, 1,4%) skizofrénia esetekről. A vizsgálatunkban megfigyelt öt CNV-nél nagyobb, mint 2 Mb, három deléció, kettő pedig duplikáció. A 2. táblázatban felsoroltuk mind a 16 CNV-t, amelyek> 1 Mb voltak az eset- és kontrollalanyok esetében, és a jel intenzitásának mintáit a validálás vizuális eszközeként a 3. ábra szemlélteti. Azt is felmértük, hogy a nagy és ritka gént bontó deléciós CNV-k hajlamosak-e gazdagodni az esettel szemben a kontrollal szemben. Nem meglepő, hogy az elhízás kockázatát jelentő legkülső régiók ennél a CNV-csoportnál még magasabbak (2,7 [0,47–27,1]> 1 Mb CNV esetén, végtelen> 2 Mb CNV esetén) (2. táblázat), bár ez nem éri el a statisztikai szignifikanciát az események ritka jellege miatt.

CNV-t hordozó esetek és kontrollalanyok gyakorisága meghaladja bizonyos méretküszöböket

Több nagy és ritka CNV megzavarja az elhízás jelölt génjeit.

Jelölt gének, amelyeket az elhízott esetekre jellemző nagy CNV befolyásol. V: A 4. kromoszómán a CNV egy 3,3 Mb-os deléció, amely megzavarja a beolvasott NAP1L5 gént, amelyről kimutatták, hogy befolyásolja a születést és a felnőtt testtömegét. B: A 4. kromoszómán a CNV egy két jelölt gént, az UCP1 és az IL15 gént tartalmazó régió 2,1 Mb-os deléciója. Minden CNV esetében az összes markernek (kék pontként) a megfelelő log R arányt és a B allél frekvenciát tüntettük fel. A deléciókat a csökkent log R arány és a heterozigóta SNP hiánya igazolja a B allél frekvenciaértékekben.

Az 1 Mb-nál nagyobb CNV-k leírása eset- és kontrollalanyok esetében

Korábban jelentett, elhízással kapcsolatos CNV-k vizsgálata.

A BMI és a 10q11 CNV kromoszóma közötti összefüggést nemrégiben jelentették egy kínai kohorszban (12). Három esetet figyeltünk meg, akik ezt a CNV-t hordozták (BMI 36, 41, illetve 43 kg/m 2), de a kontroll alanyokban nincs. Két gén ebben a régióban a GPRIN2 és a PPYR1, amelyek nagyobb mintahalmazokban követhető nyomonkövetési vizsgálatokra érdemesek. Ezenkívül a közelmúltban beszámoltak a 16p11.2 erősen behatoló deléciójáról, amely elhízással jár (7,11). Adataink szerint egy elhízott alany (BMI 44,9 kg/m 2) hordozza ezt a törlést, egy kontroll alany (BMI 19,1 kg/m 2) hordozza a kölcsönös duplikációt. Ezért adataink összhangban állnak azzal a lehetőséggel, hogy a 16p11.2 törlés elhízással jár.

VITA

A jelenlegi tanulmányban elhízott esetek és soha nem túlsúlyos kontrollalanyok mintagyűjteményét vizsgáltuk, és erős támogatást találtunk arra vonatkozóan, hogy a nagy és ritka CNV-k hozzájárulnak az elhízáshoz. Összességében elmondható, hogy a vizsgálatunkban megfigyelt OR a nagy CNV-k esetében magasabb, mint a GWAS-ban azonosított közös SNP-k (például az OR az FTO esetében 1,3 [3], az MC4R esetében pedig súlyos gyermekkori elhízás esetén 1,3 [4]), ami arra utal, hogy ritka CNV-k penetránsabb kockázati tényezőket jelenthet az elhízás szempontjából.

Vizsgálatunk egyik érdekes vonzata az elhízás feltételezett genetikai felépítéséhez kapcsolódik. Bár köztudott, hogy az elhízás több genetikai kockázati tényezőből, valamint környezeti tényezőkből fakad, nem világos, hogy mi és hány genetikai kockázati tényezőt érint. A legújabb GWAS-k néhány elhízási gént azonosítottak, de együttesen csak az elhízásban az egyének közötti különbségek kis részét magyarázzák (5). Ezért annak ellenére, hogy a mintaméret növelésével a gyakoribb érzékenységi variánsok azonosíthatók, nem valószínű, hogy ezek a genetikai kockázat jelentős hányadát jelentenék. Másrészt tanulmányunk azt sugallja, hogy a jóval magasabb OR-val rendelkező ritka változatok is hozzájárulhatnak az elhízás kockázatához. Tekintettel a CNV-k ritka jellegére, nem tudtuk megkülönböztetni, hogy e nagy CNV-k közül melyik valóban okozója az elhízásnak, ezért néhány kevésbé penetráns vagy nem okozati nagy CNV hígítja a hatás méretét. Ezért a nagy CNV-knél megfigyelt hatásméretek alulbecsülhetik az elhízás okozati CNV-k valódi hatásméretét.

Egy másik érdekes következmény az, hogy a kvantitatív genetika hogyan viszonyul a betegség fenotípusaihoz. Azt, hogy a különféle allélek, köztük a szerény hatású allélek és a nagy hatású allélek, kölcsönhatásba léphetnek-e a betegség megjelenésével, nem vizsgálták jól. Az elhízás tekintetében, bár sok asszociációs vizsgálatban az FTO következetesen a legerősebb gént képviseli, az elhízás monogén formáinak tanulmányozásából még soha nem vették figyelembe. Hasonlóképpen, bár az MC4R szerepet játszik az elhízás monogén formáiban, a gyakori változatok elemzése nagyon következetlen volt mindaddig, amíg nagyszabású GWAS-okat nem hajtottak végre (4). Ezért valószínű, hogy a ritka allélek a közös allélokkal együtt alakítják az elhízás kialakulását az emberi populációkban, és hogy egyes ritka oksági allélokkal rendelkező gének soha nem mutatkozhatnak meg a közös változatokon végzett vizsgálatokból.

Összegzésként megállapítottuk, hogy nagy, mégis ritka CNV-k jelentik az elhízás fő kockázati tényezőit. Ezen nagy CNV-k egy része magában foglalja az elhízás génjeit vagy a nyomon követési vizsgálatok lehetséges génjelöltjeit. Eredményeink azt is sugallják, hogy a komplex rendellenességek monogén formáinak vizsgálata, a GWAS-okban előforduló közös változatok tanulmányozása és a CNV-k vizsgálata három kiegészítő megközelítést jelent a komplex betegségek genetikai alapjainak kutatásához.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezt a munkát részben az National Institutes of Health Grants R01DK44073, R01DK56210 és R01DK076023 (az R.A.P.-hez) és az American Heart Association (a W.D.L.-hez) Scientist Development Grant (0630188N) támogatta. A genom egészére kiterjedő genotipizálást részben a Philadelphiai Gyermekkórház Intézményfejlesztési díja finanszírozta az Alkalmazott Genomika Központjának (H. H.).

A cikk szempontjából lényeges összeférhetetlenségről nem számoltak be.

K.W. adatokat kutatott és megírta a kéziratot. W.-D.L. adatokat kutatott és szerkesztette a kéziratot. J.T.G., S.F.A.G. és H. H. genotípusadatokat generált, és hozzájárult a megbeszéléshez. R.A.P. megtervezte a tanulmányt, mintákat gyűjtött és szerkesztette a kéziratot.

Köszönetet mondunk minden olyan esetnek és kontrollalanynak, akik vérmintákat adtak genetikai kutatási célokra.