Anyagcsere indukció és az egér blasztociszta fejlesztési programozásának korai válaszai az egész életen át tartó egészséget befolyásoló alacsony fehérjetartalmú anyai étrend után

Kapcsolatok Orvostudományi Kar, Southamptoni Egyetem, Southamptoni Általános Kórház, Southampton, Egyesült Királyság, Biológiai Tudományok Központja, Southamptoni Egyetem, Southamptoni Általános Kórház, Southampton, Egyesült Királyság

Biológiai Tudományok Központja, University of Southampton, Southampton General Hospital, Southampton, Egyesült Királyság

Kardiovaszkuláris és anyagcsere-kutatási központ, The Hull York Medical School, University of Hull, Hull, Egyesült Királyság

Egyetemi biológiai tanszék, University of York, York, Egyesült Királyság

Tagság Orvostudományi Kar, Southamptoni Egyetem, Southampton Általános Kórház, Southampton, Egyesült Királyság

Biológiai Tudományok Központja, University of Southampton, Southampton General Hospital, Southampton, Egyesült Királyság

Judith J. Eckert,
Richard Porter,
Adam J. Watkins,
Elizabeth Burt,
Suzanne Brooks,
Henry J. Leese,
Peter G. Humpherson,
Iain T. Cameron,
Tom P. Fleming

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Eckert JJ, Porter R, Watkins AJ, Burt E, Brooks S, Leese HJ és mtsai. (2012) Metabolikus indukció és korai válaszok az egér blasztociszta fejlesztési programozásában az egész életen át tartó egészséget befolyásoló alacsony fehérjetartalmú anyai étrend után. PLoS ONE 7 (12): e52791. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052791

Szerkesztő: Jason Glenn Knott, Michigan State University, Amerikai Egyesült Államok

Fogadott: 2012. szeptember 4 .; Elfogadott: 2012. november 21 .; Közzétett: 2012. december 27

Finanszírozás: A szerzők hálásak a BBSRC finanszírozásáért (BB/F007450/1, BB/I001840/1) a TPF és a JJE számára e kutatási projekt támogatásáért. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Kimutatták, hogy a perikoncepcionális környezet befolyásolja az állatmodellek későbbi fejlesztési programját, amelynek hosszantartó következményei befolyásolják az utódok fiziológiáját és egészségi állapotát [1] - [5]. Így rágcsálókban az in vitro tenyésztési körülmények [6] - [13] és az anyai táplálékfehérje-korlátozás in vivo [14] - [17] a preimplantációs fejlődés során rendellenes posztnatális növekedéssel és a felnőttkori betegség megnövekedett kockázatával társulnak, amelyet különösen szív- és érrendszeri, metabolikus és viselkedési zavarok. Hasonló jelenségeket figyeltek meg a kapcsolódó kérődzők embriómodelljeiben is [18] - [21]. Ezek a korai fejlődési stádiumok környezeti érzékenységei együttesen támogatják az „Egészség és betegség fejlődési eredete” (DOHaD) hipotézis egyik fontos elemét, amely epidemiológiai és kísérleti adatkészletekből származik, és amely a későbbi életben fokozott érzékenységet javasol a fogyatékkal élőktől. méh tapasztalat [22] - [25]. Az embrió környezeti hatásai kihatnak a támogatott fogantatás biztonságára is [26] - [29].

A közelmúltban végzett munkánk az egérfehérje-restrikciós modell alkalmazásával bebizonyította, hogy az alacsony fehérjetartalmú étrenddel (9% kazein) táplált anyák kizárólag a preimplantációs periódus alatt (E0-3,5; Emb-LPD) olyan utódokat hoztak létre, akik egész életen át tartó hipertóniát mutattak ki a kontrollokhoz képest, és gyengített artériás vazodilatációval, megemelkedett tüdő angiotenzin-konvertáló enzimaktivitással, hiperaktív viselkedéssel és fokozott adipozitással [15] - [17]. Adataink azt is jelezték, hogy az átmeneti táplálkozási kihívásra adott korai válasz (vagy a terhesség alatt fennmaradt LPD után) kompenzációs mechanizmusok aktiválódását jelentette a fogalom későbbi növekedésének stabilizálása érdekében. Ez magában foglalta az anya-magzat tápanyag-szállító képességének javulását a zsigeri zsákon keresztül a késői terhesség során, valamint az anyai Emb-LPD következtében a fogamzás és a születési súly megfelelő növekedését [15]. Sőt, a növekedés kompenzációjának korai indukciója kritikusnak tűnt a betegség későbbi kialakulásában, mivel az Emb-LPD utódok perinatális súlya pozitív korrelációban állt a felnőttek testsúlyával, valamint a szív- és érrendszeri és viselkedési betegségekre való hajlammal [15].

Értékeltük az Emb-LPD kezelés hatását az egér anyai szisztémás és reproduktív traktus fiziológiájára, valamint az embrió fejlődésére és a fenotípusra az implantáció időpontjáig. Különösen az AA táplálkozásra gyakorolt hatására összpontosítunk az anyai keringésben, a méhfolyadékban és a blasztocisztákban. Kiértékeljük a diéta blastocystákon belüli mTORC1 jelátvitelre gyakorolt hatását és megvizsgáljuk a blastocysta trophectoderm (TE) törzs lehetséges kompenzációs mechanizmusait is. Vizsgálataink együttesen jelzik az AA és inzulin metabolikus jelátvitel potenciális szerepét az mTORC1-en keresztül a blasztociszta programozás indukciójában, a beültetés időpontjáig tartó kompenzációs válaszban a fokozott TE-proliferáció és az invazív viselkedés bizonyítékaival.

Eredmények

Az Emb-LPD megváltoztatja az anyai szérum metabolitjainak összetételét

Az Emb-LPD és NPD anyák szérum metabolitjait az E3.5 és 4.5 értékeken elemeztük. Az E3.5-nél az Emb-LPD szérum inzulinnal kimerült és a glükóz emelkedett (P 1. ábra. Az anyai szérum metabolitok koncentrációja E3.5 és 4.5 értékeken Emb-LPD és NPD kezelés után.

(A) inzulin, n = 11-16 kezelésenként; (B) glükóz, n = 13–20 kezelésenként; (C) kortikoszteron, n = 11-16 kezelésenként; (D) ösztrogén, n = 6–11 kezelésenként; (E) progeszteron, n = 6–11 kezelésenként. * P 2. ábra. Aminogrammok rekeszekben különböző időpontokban az Emb-LPD és NPD kezelés után.

(A) anyai szérum, (B) méhfolyadék a 2.5, 3.5 vagy 4.5 napon és (C) blastocysták a 3.5 napon, az 1., 2., 3. táblázatból vett.

A méhfolyadék AA-koncentrációját (UF) az anyai étrendhez viszonyítva elemeztük E2,5, 3,5 és 4,5 értéknél (2. táblázat, 2B. Ábra). Nem találtunk különbséget a diétás kezelések között az egyes AA-koncentrációknál E2,5-nél. Az E3.5-nél a három elágazó láncú AA, az izoleucin, a leucin és a valin külön-külön és együttesen is kimerült (P 2. táblázat. NPD-vel vagy Emb-LPD-vel táplált egerek szabad aminosavainak méhfolyadék-koncentrációja 2,5, 3,5 vagy 3,5 4,5 napos terhesség.

Az E3.5-nél összegyűjtött blasztocisztákat gyorsan mossuk, és azonnal feldolgozzuk az AA-összetételhez (3. táblázat, 2C. Ábra). Ez az elemzés feltárta, hogy az egyedi AA aszparagin kimerült (P 3. táblázat. Blastocysta szabad aminosavkoncentráció és relatív% a terhesség 3.5. Napján egerektől, akiket NPD-vel vagy Emb-LPD-vel tápláltak, reggeltől reggeltől reggeltől.

Az AA-k különböző anyai (szérum, UF) és blasztociszta medencéi jelentős koncentrációváltozásokat mutatnak, a blasztociszták a legtöbb AA esetében a legmagasabb koncentrációs szintet mutatják. A 4. táblázatban és a 3. ábrán az egyes és a csoportosított AA-k koncentrációjának változásait ezen poolok között rögzítjük mind az NPD, mind az Emb-LPD kezeléseknél. A blasztociszták és az UF AA-összetétele hasonlóbb volt a szérumhoz képest.

(A) Emb-LPD és (B) NPD kezelések a d3.5. Napon a 4. táblázatból.

Az Emb-LPD megváltoztatja az mTORC1 jelátvitelt a blasztocisztákban

Az mTORC1 downstream célpontok (A – C) S6 fehérje, (a – D) 4E-BP1 fehérje kvantitatív immunblotálása normalizálódott az α-tubulinra. Az (A) összes S6 reprezentatív blotjai; (B) foszforilezett S6; (C) az összes, foszforilezett relatív intenzitása és az S6 aránya az Emb-LPD és NPD blasztocisztákban; (D) összesen 4E-BP1; (E) foszforilezett 4E-BP1; (C) a teljes, foszforilált relatív intenzitás és a 4E-BP1 aránya az Emb-LPD és NPD blasztocisztákban. Az egyes blot sávok közé tartoznak az MW markerek (bal oldalon), valamint az Emb-LPD (L) és az NPD (N) blastociszták mintái (sávonként 25 blastocysta) és a terhelés-szabályozás (LC, sávonként 25 blastocysta összevonása). * P 5. ábra. Az anyai étrend hatása a blasztocisztákra és a kinövésekre.

(A) Emb-LPD és NPD blasztociszta érettség E3.5-nél. n = 13–15 anya kezelésenként. (B) Emb-LPD és NPD blasztociszta sejtek száma E3,5-nél és E3,75-nél a trophectoderm (TE), az ICM és az összes készlet között, * P 125 I RIA készlet (ICN Biomedicals, Egyesült Királyság) és egy 1274 RiaGamma számláló (LKB- Wallac, Finnország). Az ösztrogént a 3. generációs Estradiol RIA kit (DSL, UK) és a progeszteron alkalmazásával határoztuk meg, a 17α-OH progeszteron 125 I RIA kit (DSL, UK) felhasználásával, mindkettőt 1274 RiaGamma számlálóval számolva.

Méh luminalis folyadék gyűjteménye

Embrió gyűjtés és kezelések

Az embriókat az étrendi kezelés során különböző időpontokban gyűjtötték össze az anyáktól méhnyak diszlokációval, a reproduktív traktus boncolásával és az embriók öblítésével 4 mg/ml BSA-val (H6-BSA) kiegészített H6 táptalaj segítségével [9]. A szabad aminosav-összetétel elemzéséhez értékeltük a blasztociszta stádiumát és átmérőjét (korai, közepes, tágult), majd három alapos mosást végeztünk 0,1% PVA-val kiegészített PBS-ben, majd gyorsfagyasztás után 8–10 csoportban (anyánként elválasztva). 10 µl HPLC minőségű vizet a lehető leggyorsabban HPLC-fiolákban, száraz jégen. Ez az eljárás anyánként kevesebb, mint 10 percet vett igénybe, és a mosáscseppek elemzése nem mutatott AA hátteret, vagy annak hátterét még akkor sem, ha az embriókat legfeljebb 30 percig hagyták, arra utalva, hogy a gyűjtési folyamat során nincs vagy elhanyagolható szivárgás.

A sejtek számának meghatározásához az embriókat differenciális nukleáris jelölésnek vetettük alá, miután a trophectoderma [78] módosításokkal végzett komplement-mediált lízise következett be. Röviden, az embriókat 10% tetranitrobenzol-szulfonsavban (TNBS; Sigma, Egyesült Királyság) helyeztük H6 + 0,1% PVA-ban 10 percig, háromszor mostuk H6-BSA-ban, 0,4 mg/ml nyúl anti-dinitrofenilben (anti-DNP) inkubáltuk. ) antitestet (Sigma, Egyesült Királyság) H6-BSA-ban 10 percig, H6-BSA-val mostuk és 25 µl csepp helyreállított Low-Tox tengerimalac-komplementben (1-10 hígítás, Cedarlane, Kanada) 2 µl propidium-jodiddal inkubáltuk. (PI; Sigma, 1 mg/ml) 10 percig 37 ° C-on. Az embriókat H6-BSA-ban mossuk, etanolban és 1% biszbenzimidben (Sigma) 4 ° C-on rögzítjük, friss etanollal mossuk, glicerinbe helyezzük egy üveglemezen, a Zeiss Axiophot függőleges epifluoreszcens mikroszkóppal nézzük, és a Metamoph szoftver segítségével megszámoljuk a magokat. (Változat 6.2r6).

A további fejlődés és a kinövési potenciál értékeléséhez a blastocystákat egyenként 20 µl csepp KSOMufaa-ba helyeztük, 10% FCS-sel (KSOMufaa + FCS) kiegészítve olaj alatt, és hagytuk kapcsolódni és terjedni 120 órán át. A KSOMufaa magában foglalja a KSOM táptalajt (Sigma) kiegészítve az AA-k átlagos összetételével, amelyet az NPD anyák UF-jében azonosítottak az E3.5-nél (2. táblázat). A blastociszták morfológiáját és kötődését napi időközönként Zeiss Axiovert inverz mikroszkóppal, környezeti kamrával felszerelt 37 ° C-on, és 24 óránként készített fényes mezős felvételekkel mértük a Metamorph szoftverrel végzett területmérésekhez. A blasztociszta kinövését specifikus időszakokon keresztül rapamicint (2 vagy 20 µM; LC laboratóriumok, Woburn, USA) vagy vivőanyagot (0,05% DMSO) tartalmazó táptalajjal végeztük az mTORC1 aktivitás gátlására.

Aminosav-elemzés

A 19 AA szérum- és UF-koncentrációját egy Kontron 500 sorozatú automatizált fordított fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás rendszerrel határoztuk meg, amely Jasco F920 fluoreszcencia detektorral és 4,5 mm × 250 mm Hypersil ODS-16 oszloppal volt felszerelve (Jones Chromatography, Glamorgan, UK). A szérum- és UF-mintákat 1/12,5 és 1/112,5 között hígítottuk PBS vagy HPLC minőségű vízzel (Fisher Scientific, Egyesült Királyság), a mintatípustól és a detektálandó AA-któl függően; derivatizált (előoszlop) o-ftaldialdehiddel [51], D-homoserinnel és a-amino-vajsavval; két példányban futtatva, összehasonlítva 10 µmol l -1 AA standardokkal. A blasztociszta AA elemzéséhez 4,6 mm × 250 mm Hyperclone 5u ODS (C18) 120A oszlopot (Phenomenex, Macclesfield, Egyesült Királyság) használtunk. A mintákat 1-1-re hígítottuk HPLC minőségű vízzel, és összehasonlítottuk a 10 µM standardokkal és a negatív kontrollokkal (mosóközeg és HPLC víz). Az abszolút koncentrációk kiszámításához minden minta esetében figyelembe vették a blasztociszta térfogatát.