Napi 600 gramm gyümölcs és zöldség hatása nincs az egészséges nemdohányzók oxidatív DNS-károsodására és helyreállítására

Absztrakt

Bevezetés

Az epidemiológiai vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy a magas gyümölcs- és zöldségfogyasztás összefügg az egészséges életmóddal és a rák alacsony előfordulási gyakoriságával (1). Valószínűleg számos mechanizmus vesz részt a gyümölcsök és zöldségek jótékony hatásában, beleértve a vitaminokat, a rostokat és számos más, kevésbé jól jellemezhető hatású bioaktív vegyületet. Ezenkívül a zöldségek és gyümölcsök magas antioxidáns-tartalommal rendelkeznek, amelyek képesek eltávolítani a ROS4-et (2), és valószínűleg gátolják a képződésüket is (2, 3) .

Elméletileg a DNS-elváltozások in vivo mutációkká alakulnak, ha a DNS-helyreállító rendszer nem távolítja el őket a genomból. Az emlőssejtekben a DNS-károsodást két különböző típusú DNS-kimetszés-helyreállító rendszerrel lehet kimetszeni, nevezetesen az alapkivágás-javítást és a nukleotid-kimetszés-javítást. Az ERCC1 alapvető szerepet játszik a nukleotidkivágási folyamatban, az 5'-metszésű komplex részeként (9). Az OGG1 bázis excíziós javító enzim elsősorban az oxidált guanint távolítja el a DNS-ből (10). Legjobb tudomásunk szerint az ERCC1 és OGG1 gének kifejeződését korábban nem vizsgálták a gyümölcs- és zöldségbevitel kapcsán.

Ennek a vizsgálatnak az volt a célja, hogy összehasonlítsuk az oxidatív DNS-károsodás és a javulási aktivitás szintjét a fehérvérsejtekben a gyümölcs-, zöldség- és antioxidánshiányos egyedek, valamint a napi 600 g gyümölcs- és zöldségfélékkel vagy megfelelő vitamintartalommal kiegészített alanyok között. és ásványi anyagokat.

Anyagok és metódusok

Tanulmányterv és tárgyak.

A tanulmányt párhuzamos tervezésként hozták létre, az alanyokat három csoportba randomizálták: napi 600 g gyümölcs és zöldség elfogyasztása; vitamintabletták azonos mennyiségű antioxidánssal és ásványi anyaggal; vagy 24 napig nem tartalmaz antioxidánsokat (placebo tabletta). A tanulmányt Koppenhága és Frederiksberg települések tudományos etikai bizottsága hagyta jóvá (01-234/99).

Az elsődleges hipotézis szerint az étkezési antioxidánsok kivonása miatt fokozott oxidatív DNS-károsodás figyelhető meg a placebo csoportban, míg az vitamin-csoportban, valamint a gyümölcs- és zöldségcsoportban az oxidatív DNS károsodása változatlan marad vagy csökken a teljes bevitel miatt. a tanulmány. A DNS-javító gének expresszióját a priori hipotézis nélkül vizsgálták, mivel ezt korábban nem tesztelték diétás intervenciós vizsgálatokban. A vizsgálat előtt megbecsültük, hogy a csoportméretnek 15 alanynak kell lennie ahhoz, hogy 50% -os hatásnövekedést figyelhessen meg a placebo csoportban α = 5% és β = 20% mellett, és 50% -os variációs együtthatót feltételezzünk, amint azt korábban az üstökösvizsgálatnál megfigyeltük. és a vizelettel történő 8-oxodG kiválasztása (11, 12, 13, 14). Úgy ítéltük meg, hogy 50% -os különbség volt ésszerű elvárható, mert az antioxidánsok védőhatásait bemutató tanulmányok közül több az oxidatív DNS károsodásának vagy a H2O2 érzékenységének nagyobb hatásáról számolt be természetes ételekkel vagy multivitamin tablettákkal történő beavatkozás után (15, 16, 17, 18, 19, 20) .

Egészséges, normál testsúlyú hímeket és nőstényeket toboroztak a tanulmányra az egyetemeken és más intézményekben, valamint a helyi újságokban történő hirdetés útján. A kizárási kritériumok a dohányzás, az elhízás, a krónikus betegségek családi kórtörténete, a magas vérnyomás, a gyógyszerek használata és a nehéz testmozgás voltak. Negyvennyolc alanyot vettek fel a vizsgálatba, miután megalapozott beleegyezést adtak. Összesen 43 alany fejezte be a vizsgálatot (22 férfi és 21 nő, 21–56 évesek). Egy alany azért esett ki, mert egy meghatározott időintervallumon belül nem volt képes ebédnél lenni, és 4 alany a tanulmányhoz nem kapcsolódó események miatt esett ki. A vizsgálatot befejező alanyok alapjellemzőit az 1. táblázat tartalmazza .

Az alany jellemzői és a plazma C-vitamin és karotinoid koncentráció a kiindulási három csoportban (átlag és SD) a

A kontrollált étrend megkezdése előtt az alanyok 4 napon át teljes súlyú étrend-nyilvántartást vezettek, és validált étkezési gyakorisági kérdőívet töltöttek ki (21). Ezen adatok szerint a gyümölcsök és zöldségek szokásos bevitele ~ 280 g/nap volt. Az alanyokat a testtömeg, az életkor és a fizikai aktivitás szintje (WHO) alapján fix egyéni energiafogyasztáshoz osztották ki. A vizsgálat során a testtömegeket minden második napon mértük, és ha a testsúly> 1 kg között változott, az alanyokat más energiaszintre osztották be, vagy tájékoztatták őket további energiafogyasztásról (feltéve, hogy a teljes étrendhez hasonló makrotápanyag-összetételű energiatekercsek voltak). . A vizsgálat során az átlagos energiafogyasztás 13 MJ volt (tartomány: 9–17 MJ).

A kísérleti étrend összetétele (gramm friss tömeg/nap) 10 MJ/nap energiafogyasztással

Az éhomi vérmintákat az oxidatív DNS károsodás és az mRNS expresszió elemzéséhez a beavatkozás előtt (−1. Nap), a beavatkozás során a 9., 16. és 24. napon, valamint a beavatkozás befejezése után 4 héttel (52. nap) vettük, amikor a résztvevők folytatták szokásos étrendjüket. Huszonnégy órás vizeletmintát gyűjtöttünk az intervenciós időszak előtt, négy alkalommal, és a beavatkozás befejezése után 4 héttel történő nyomon követéskor.

Oxidatív DNS károsodás kimutatása mononukleáris vérsejtekben és vizeletben.

A 8-oxodG 24 órás vizelettel történő kiválasztását nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás-elektrokémiai detektálással határoztuk meg, az előzőekben leírtak szerint, és nmol/24 órában fejeztük ki (5) .

Mennyisége OGG1 és ERCC1 mRNS expresszió leukocitákban.

A teljes RNS-t 1,5 ml EDTA-stabilizált teljes vérből tisztítottuk Qiagen vér RNS izoláló készlet segítségével, és az OGG1 és ERCC1 mRNS expresszióját, 18S RNS-re normalizálva, valós idejű reverz transzkripció-PCR-rel határoztuk meg, másutt leírva (22). Az OGG1 próbái és primerei a következők voltak: előreindító primer, 714F, 5′-AAATTCCAAGGTGTGCGACTG-3 ’; fordított primer, 796R, 5'-GCGATGTTGTTGTTGGAGGA-3 '; és szonda, 5′-FAM-CAAGACCCCATCGAATGCCTTTTCTCTTT-TAMRA-3 '. Az ERCC1 próbái és láncindítói a következők voltak: előreindító láncindító, 512F, 5′-GGCGACGTAATTCCCGACt-3 '; fordított primer, 576R, 5'-TAGCGGAGGCTGAGGAACA-3 '; és szonda: 5′-FAM-TGTGCTGGGCCAGAGCACCTGT-TAMRA-3 '. A primereket és a próbákat az Applied Biosystems cégtől szereztük be.

A C - és C - vitamin plazmaszintje ford-β-karotin.

A C-vitamin és a karotinoidok, köztük a transz-β-karotin plazmaszintjét elemeztük, amint arról korábban beszámoltunk (23, 24). A plazma antioxidánsok koncentrációjának váltakozásait a három csoportban máshol publikáljuk.

Statisztika.

Eredmények

A kiinduláskor a szénhidrátból, zsírból és fehérjéből származó energiafogyasztás nem különbözött a csoportok között. A csoportok között nem volt különbség az alkoholfogyasztásban vagy a gyümölcsök és zöldségek fogyasztásában (1. táblázat) ⇓. A kiindulási vérminták alapján meghatározva a C-vitamin és a β-karotin plazmatartalma nem különbözött a csoportok között (1. táblázat) ⇓. Emellett nem volt különbség az oxidatív DNS károsodás és a javulás biomarkereinek szintjében a kiindulási csoportok között. Következésképpen ez azt jelzi, hogy a randomizálás sikeres volt.

Az intervenciós periódus alatt a C-vitamin és a β-karotin plazmakoncentrációja 69, illetve 47% -kal csökkent a placebo csoportban, míg a gyümölcs és zöldség és a kiegészített csoportokban a C-vitamin magas plazmakoncentrációja megmaradt (3. táblázat ) ⇓. A plazma β-karotin növekedett a gyümölcs- és zöldségcsoportban, valamint a vitamin tabletta csoportban 3 hét lenyelés után.

A C-vitamin és a β-karotin plazmakoncentrációja a kiindulási értéken és a 24. napon 3 hetes beavatkozás után (átlag és SD)

Az oxidatív DNS károsodásának állandó állapota a mononukleáris vérsejtekben (Comet Assay).

Minden mintamérés magában foglalta az állványtöréseket és a H2O2 érzékenységet, valamint az ENDOIII és az FPG által kimutatott oxidatív DNS károsodást (4. táblázat) ⇓. A diéta beavatkozása a végpontok egyikét sem befolyásolta. Különböző típusú standardizálást próbáltak meg (azaz kivonások a minták és a kontrollok között), de ez nem utalt arra, hogy a napi változások elfednék az elemzés biológiai hatásait. A statisztikai elemzés azt mutatta, hogy a H2O2 által okozott károsodás a 16. napon hatással volt az összes csoportra (P Tekintse meg ezt a táblázatot:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

Az üstökösvizsgálattal kimutatott DNS-szál törések, ENDOIII- és FPG-érzékeny helyek és hidrogén-peroxid-érzékenység mononukleáris vérsejtekben (átlag és SD) a, b

Minden elektroforézis futtatásához krioprezervált mononukleáris vérsejteket vontunk be a szálszakadások és a H2O2 kezelés (150 μm) kimutatására. Az átlag és az SD 29 ± 11 volt a szál töréseknél és 93 ± 21 a H2O2-val kezelt sejteknél (n = 32). A mononukleáris sejtek FPG-érzékeny helyei 62 ± 24, a frissen H2O2-val kezelt (150 μm) mononukleáris sejtek átlaga és SD-je 52 ± 16 (n = 32). A szálszakadások variációja hasonló volt a korábban közölt vizsgálati variációnkhoz (14) és más biomonitoring vizsgálatokban közölt vizsgálati variációhoz (25, 26, 27) .

Vizelet 8-OxodG kiválasztása.

Nem volt különbség a 8-oxodG kiválasztásában a három elfogyasztott étrend között (5. táblázat) ⇓. Volt azonban olyan periódushatás, amikor az intervenciós időszak után vett minták alacsonyabbak voltak, mint a többi mintavételi időpontban (P Tekintse meg ezt a táblázatot:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

24 órás vizelettel történő 8-oxodG kiválasztás szintje (átlag és SD) a

Kifejezései OGG1 és ERCC1 mRNS leukocitákban.

Az OGG1 és ERCC1 kifejezéseit a 6. táblázat lined. Az OGG1 és ERCC1 mRNS expresszióját a vizsgálat során 9 különböző napon határoztuk meg. Az mRNS-kifejezések teljes adatsorának leírását máshol közöljük (22). Az itt bemutatott adatok csak az 5 napos kifejezéseket vázolják fel üstökösvizsgálattal és vizelet 8-oxodG kiválasztási mérésekkel. A két DNS-javító gén mRNS-expressziójának szintje nem volt összefüggésben az elfogyasztott étrenddel, és a nemnek nem volt hatása.

Az OGG1 és ERCC1 mRNS expressziója a 18S-hez képest a teljes vérből izolált leukocitákban (átlag és SD a zárójelben szereplő alanyok számával) a, b

Összefüggések.

Nem volt szignifikáns összefüggés a vizelet-8-oxodG és az üstökösvizsgálat végpontjai, a vizelet-8-oxodG és a DNS-javító gének expressziója, valamint az üstökösvizsgálat végpontjai és a DNS-javító gének expressziója között.

Vita

Ebben a tanulmányban azt tapasztaltuk, hogy a gyümölcs és zöldség kimerülése, vagy 600 g gyümölcs és zöldség elfogyasztása, vagy a megfelelő mennyiségű vitamin és ásványi anyag 24 napon át adott kiegészítése nem változtatta meg a szálszakadások, az oxidatív DNS szintjét bázis károsodás, vagy H2O2 érzékenység mononukleáris vérsejtekben. A báziskivágási javításban (OGG1) és a nukleotid-kivágás helyreállításában (ERCC1) szerepet játszó DNS-javító gének expresszióját az elfogyasztott étrend nem változtatta meg, ami arra utal, hogy az oxidatív DNS-károsodás változatlan szintje nem a DNS-javítási aktivitás változásának köszönhető. Ezt a felfogást tovább erősítik a változatlan 8-oxodG vizelettel történő kiválasztódások, amelyek a 8-oxodG-helyreállítás, a nukleotidkészlet higiénia, a sejtforgalom és az egész test mitokondriális forgalmának összegét jelentik (7). Összességében az adataink határozottan azt sugallják, hogy az alacsony antioxidáns-bevitel időszakában az alanyokban nem keletkezett többlet oxidatív DNS-károsodás.

Összefoglalva: ez a 24 napos gyümölcs- és zöldségfélék intervenciós kísérlete nem mutatott jótékony hatást az oxidatív DNS károsodásra vagy a DNS-javító gének expressziójára. Ez arra utalhat, hogy az antioxidáns tulajdonságok vagy az oxidatív DNS károsodásra gyakorolt hatások alig vagy egyáltalán nem játszanak szerepet a gyümölcsök és zöldségek rákmegelőző hatásában. Alternatív megoldásként lehetséges, hogy a vizsgálatba bevont alanyok nem voltak kitéve semmiféle oxidatív stressznek, amely oxidatív károsodást okozott volna. Figyelembe kell venni azt is, hogy a vizsgálatba kiválasztott alanyok viszonylag magas gyümölcs- és zöldségfogyasztást kaptak, és nemdohányzók voltak. További vizsgálatok szükségesek a gyümölcsök és zöldségek oxidatív stresszhelyzetben bekövetkező oxidatív DNS-károsodására gyakorolt hatásáról, hogy támogassák a gyümölcsök és zöldségek szerepét a rák megelőzésében.

Megjegyzés hozzáadva bizonyítékként.

E cikk benyújtása után Collins és mtsai. (Carcinogenesis (Lond.) 24: 511–515, 2003) első kutatói adatokat közöltek az OGG1 mRNS expressziójáról a kiwi gyümölcs bevitelével kapcsolatban.