PCR javítása az Opisthorchis viverrini DNS kimutatására emberi székletmintákban

  • Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
  • Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
  • Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
  • Levelezés céljából: [email protected]

ABSZTRAKT

Az Opisthorchis viverrini fontos élelmiszer-eredetű trematode Délkelet-Ázsiában. A fertőzés jelentős morbiditást okoz a máj- és epebetegségek és a kolangiokarcinóma szempontjából. A tanulmány célja az O. viverrini fertőzés PCR-alapú diagnózisának érzékenységének javítása volt. Új széklet DNS-extrakciós protokollt használtak az O. viverrini DNS kimutatására cetil-trimetil-ammónium-bromid alkalmazásával a PCR-gátló eltávolítására, és összehasonlították a kereskedelmi forgalomban lévő székletkészlet módszerével. Az új teszt érzékenysége 79,3% volt, szemben az előző módszer 44,8% -ával (P 0,05). Az O. viverrini tojásra negatív minták közül (n = 21) 6 (28,6%) volt pozitív PCR-rel. Ha csak azokat a mintákat vettük figyelembe, amelyek pozitívak voltak az O. viverrini tojásokra (n = 58), 46 (79,3%) volt pozitív PCR-rel. A FECT vonatkozásában a módosított PCR általános érzékenysége 79,3%, a specificitás 71,4% volt. A pozitív és a negatív prediktív értékek 88,5%, illetve negatív 55,6% voltak.

javítása

Amint a 2. táblázat mutatja, a különféle O. viverrini intenzitási csoportokon belül a PCR-pozitivitás aránya az ebben a vizsgálatban alkalmazott módosított protokoll szerint következetesen magasabb volt, mint az előző jelentésben (15). Összességében a PCR-vel elért O. viverrini 65,8% -os prevalenciája szignifikánsan nagyobb volt, mint az előző protokoll szerint (35,4%, 79 székletmintából 28) (P 0,05). Két PCR-pozitív eredményt találtunk egy esetben a horogférgek és a S. stercoralis vegyes fertőzésével, valamint egy másik esetben a T. trichiura fertőzéssel. A hookworm-fertőzés három esetben nem tapasztaltak pozitív PCR-t. Mivel a székletvizsgálat nem ideális „aranystandard”, és ebben a vizsgálatban kevés volt az egyparazita fertőzésű minták száma, nem megengedett a PCR diagnózis keresztreaktivitásának átfogó elemzését végezni.

A petesejt- és PCR-analízissel egyaránt pozitív O. viverrinire pozitív minták közül 34 (79%) a könnyű fertőzés csoportjába került (1 000–9 999 EPG). A vizsgálati eredmények eltéréseit azonban 12 olyan mintával sikerült elérni, amelyek pozitívak voltak a tojásra, de negatívak voltak PCR-rel. Nyolc minta (75%) petesejtje 1000 EPG volt. A PCR-teszt és a petesejtek közötti pozitív korreláció tendenciáját hasonlóan figyelték meg egy korábbi jelentés (15). Nem zárható ki azonban annak a lehetősége, hogy az egyes példányokban megfigyelt petesejtek nem O. viverrini, hanem egyéb vékonybélrétegek voltak (6, 7).

Költségét tekintve az ebben a tanulmányban létrehozott új PCR-protokoll gazdaságosabb, mint az előző protokoll, mivel nincs szükség kereskedelmi készletre (15). A PCR-teszt elvégzéséhez szükséges minta-feldolgozási idő tekintetében a protokoll hozzávetőlegesen 8 órát vett igénybe, míg a kereskedelmi székletkészletet használó előző protokoll körülbelül 7 órát vett igénybe. Az új protokoll egy órával hosszabb időre volt szükség a proteináz K emésztéséhez és a fenol-kloroform extrakcióhoz.

Beszámoltak egy alternatív tisztítási módszerről, amely KOH-t, valamint szacharóz és KCl kombinációját alkalmazta, amelyet autoklávozás vagy homogenizálás követett a peték törése érdekében, és a kimutatási határ 10 EPG volt a Clonorchis sinensis PCR diagnózisában (9). Vizsgálatunkban a legkevesebb detektált petesejt-szám 31 tojás-pozitív volt a tojás-pozitív minták esetében, és valószínűleg ennél alacsonyabb a tojás-negatív minták esetében. A tojás-negatív minták PCR-pozitív eredményeinek megállapítása összhangban van a monoklonális-antitest-alapú koproantigén kimutatási módszerrel, amely tojás-negatív esetekben is pozitív reakciókat mutatott (11). Sőt, egy boncolásos vizsgálatban azoknak az embereknek a 30% -a választott ki, akiknél kevesebb, mint 10 felnőtt O. viverrini féreg volt, ürülékükben kimutatható petéket választottak ki, míg többségük (70%) tojás negatív volt (13). Az, hogy látszólag tojás-negatív mintákkal nyertünk PCR-pozitív eredményeket, arra utal, hogy a PCR-módszerünkkel végzett diagnózis érzékenyebb, mint a székletvizsgálati módszer, különösen a könnyű fertőzés csoportjában.

O. viverrini DNS kimutatása emberi székletmintákból PCR-rel. A 2% -os agarózgélben elválasztott PCR-termékek etídium-bromid festését mutatjuk be. a) O. viverrini tojás-pozitív minták. Az M sáv 100 bp jelző, a P sáv pozitív kontroll. 1. sáv, 442 EPG; 2. sáv, 1120 EPG; 3. sáv, 180 EPG; N sáv, negatív kontroll. b) Parazita-negatív minták. M sáv, 100 bp marker; P sáv, pozitív kontroll. Az 1-3. Sáv parazita-negatív mintákból származó DNS-eket tartalmaz. N sáv, negatív kontroll.

Kapcsolat az O. viverrini fertőzés PCR-rel történő diagnosztizálása és a FECT módszer között 79 székletmintában

Az O. viverrini fertőzés diagnosztizálása PCR-rel különböző intenzitási csoportokban az előző a és az ebben a tanulmányban leírt új protokoll alapján

A PCR teszt eredményeinek osztályozása az O. viverrini fertőzés diagnosztizálására a FECT módszerrel meghatározott fertőzés állapota szerint 79 mintában

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezt a kutatást a Liver Fluke és Cholangiocarcinoma Research Center (LFCRC) támogatta; az orvostudományi kar, Graduate School, Khon Kaen Egyetem, Khon Kaen, Thaiföld; és az Európai Bizottság a TREMKIT projekten keresztül (ICA4-2000-10163).