p-nitrofenil-foszfát (PNPP)
A p-nitrofenil-foszfát (PNPP) egy nem fehérjeszerű, nem specifikus szubsztrát, amelyet fehérje, lúgos és savas foszfatázok meghatározására használnak.
- Használható a fehérje-foszfatáz aktivitás gyors elemzésére bármilyen körülmények között
- Előnyös egy radioaktív vizsgálathoz, mert a szubsztrát koncentrációja sokkal magasabb lehet, mint a Km
- Az aktivitást folyamatos vagy egypontos spektrofotometriás vizsgálattal mérik, amely a foszfatázok azon képességén alapul, hogy katalizálják a PNPP hidrolízisét p-nitrofenolra, amely kromogén termék, amely maximálisan abszorbeál 405 nm-en.
A p-nitrofenil-foszfát (PNPP) egy nem fehérjeszerű, nem specifikus szubsztrát, amelyet fehérje, lúgos és savas foszfatázok meghatározására használnak. A PNPP-foszfatáz aktivitást folyamatos vagy egypontos spektrofotometriás vizsgálattal mértük, amely a foszfatázok azon képességén alapul, hogy katalizálják a PNPP hidrolízisét p-nitrofenollá, kromogén termékké, amelynek abszorbanciája 405 nm-en (1). Az assay felhasználható a fehérje-foszfatáz aktivitás gyors elemzésére bármilyen nem standard körülmények között.
A PNPP foszfatáz aktivitás vizsgálatának előnye, hogy a radioaktív vizsgálattal ellentétben a szubsztrát koncentrációja sokkal magasabb lehet, mint a Km. A kezdeti sebesség rögzíthető a folyamatos vizsgálatban, de a vizsgálat térfogata nagyobb, mint egy radioaktív vizsgálatban (kb. 1 ml 1 ml-es spetrofotométer küvetta töltésére) (1,2). Az egypontos vizsgálatban a reakció térfogata nagyon kicsi lehet, mert a reakciót annyi NaOH mennyiséggel állítják le, hogy elegendő legyen a küvetta megtöltéséhez (1,3,4).
Reagensek szállítva
A termékhez a következő reagensek tartoznak:
Molekuláris tömeg
A PNPP-foszfatáz aktivitást 50 mM PNPP-t és szükség esetén további komponensekkel kiegészített protein-foszfatáz-puffert tartalmazó reakcióelegyben (50 μl) vizsgáljuk. A reakciót enzim hozzáadásával indítjuk, és 5-10 perc múlva leállítjuk 1 ml 1 N NaOH (vagy 1 ml 0,5 M EDTA Mn2 + -függő fehérje-foszfatázok, Lambda PP és PP1) hozzáadásával. A termék, a p-nitrofenol mennyiségét az abszorbancia 405 nm-nél történő leolvasásával és 18 000 M-1 cm-1 (16 000 M-1 cm-1 0,5 M EDTA-hoz) moláris extinkciós együttható alkalmazásával határozzuk meg (1, 3). A fehérje-foszfatáz-aktivitás egy egységét az az enzimmennyiség határozza meg, amely 1 nanomol PNPP-t hidrolizál egy perc alatt 30 ° C-on, 50 μl teljes reakciótérfogatban, standard reakciókörülmények között. A fehérje-foszfatáz aktivitás pontos becsléséhez elengedhetetlen a defoszforiláció lineáris kinetikájának biztosítása.
| ||||||||||||||||||