A kodonfelismerés leállítása ciliátusokban: Euploték a felszabadítási tényező nem reagál az újból kiosztott UGA kodonra

Unité de Biochimie Cellulaire, CNRS FRE 2219, Université Pierre et Marie Curie, 9 quai Saint-Bernard, 75005 Párizs, Franciaország

Engelhardt Molekuláris Biológiai Intézet, Orosz Tudományos Akadémia, 119991 Moszkva, Oroszország

Unité de Biochimie Cellulaire, CNRS FRE 2219, Université Pierre et Marie Curie, 9 quai Saint-Bernard, 75005 Párizs, Franciaország

Engelhardt Molekuláris Biológiai Intézet, Orosz Tudományos Akadémia, 119991 Moszkva, Oroszország

Unité de Biochimie Cellulaire, CNRS FRE 2219, Université Pierre et Marie Curie, 9 quai Saint-Bernard, 75005 Párizs, Franciaország

Stéphanie Kervestin 1, ‡,
Ludmila Frolova 2, ‡,
Lev Kisselev 1 és
Olivier Jean ‐ Jean 1

1 Unité de Biochimie Cellulaire, CNRS FRE 2219, Université Pierre et Marie Curie, 9 quai Saint-Bernard, 75005 Párizs, Franciaország
2 Engelhardt Molekuláris Biológiai Intézet, Orosz Tudományos Akadémia, 119991 Moszkva, Oroszország
‡ S. Kervestin és L. Frolova egyformán járultak hozzá ehhez a munkához

*Levelezési cím. Tel .: +7 95 1356009; Fax: +7 95 1351405; E-mail: [e-mail védett]

Az eukariótákban az 1 polipeptid felszabadulási faktor (eRF1) mind a három stop kodonban részt vesz a transzláció terminációjában. A stopkodonok dekódolásának mechanizmusa azonban ismeretlen. Az eRF1 közvetlen kölcsönhatását feltételezték a stop kodonokkal. A legújabb tanulmányok az eRF1-re összpontosítanak a ciliátusokból, amelyekben néhány stop kodont újból hozzárendelnek az érzékelő kodonokhoz. Egy in vitro emlős riboszómákon alapuló vizsgálat megmutatja, hogy az eRF1 a csillóból származik Euplotes aediculatus stop kodonként reagál az UAA-ra és az UAG-ra, és hiányzik a képessége az ebben a szervezetben a ciszteint kódoló UGA-kodon megfejtésére. Ez az eredmény határozottan azt sugallja, hogy az variábilis genetikai kóddal rendelkező csillóknál az eRF1 nem ismeri fel az újból hozzárendelt kodonokat. Az eRF1 által a stop kodon megkülönböztetést leíró legújabb hipotézisek nem teljesen összhangban állnak az eddig rendelkezésre álló eRF1 szekvenciákkal, és közvetlen kísérleti tesztet igényelnek.

Bevezetés

A fehérjeszintézis befejeződését egy stop kodon jelenléte határozza meg a riboszomális A helyen és a polipeptidlánc felszabadulási faktorok (RF) (Kisselev és Buckingham, 2000 áttekintése). Az eukariótákban egyetlen faktor, az eRF1 dekódolja mind a három stop kodont, az UAA, az UAG és az UGA, míg a prokariótákban az RF1 reagál az UAA-ra és az UAG-ra, míg az RF2 reagál az UAA-ra és az UGA-ra.

A terminációs kodonok dekódolásának mechanizmusát feltételező hipotézisek egyike sem bizonyított közvetlenül. Feltételezzük, hogy a riboszómán belüli stop kodonokat az RF1, RF2 és eRF1 osztályú végződési tényezők ismerik fel (lásd Nakamura et al., 2000). A fő érv az 1. osztályú RF-k és a riboszómán belüli stopkodonok közötti nagyon szoros kapcsolat, amelyet fotokristályosodás mutat be mind a prokariótákban (Brown és Tate, 1994; Poole et al., 1997) és eukarióták (Chavatte et al., 2001). Egy másik érv olyan kísérletekből származott, amelyek azt mutatták, hogy az 1. osztályú RF szekvenciák mutagenezise a stop kodon felismerési mintázatuk módosítását eredményezte (Bertram et al., 2000; Ito et al., 2000). Alternatív megoldásként azt javasolták, hogy a stop kodonok a riboszomális RNS-ek specifikus szekvenciáival ismerhetők fel (lásd Arkov és Murgola, 1999; Ivanov et al., 2001).

Egyes csillófajok figyelemre méltó jellemzője az alternatív nukleáris genetikai kódok használata, amelyek esetleg egymástól függetlenül is felmerültek, akár a ciliátok egyetlen osztályán belül is (Baroin-Tourancheau et al., 1995). Az ismert változások a stop kodonok érzékelő kodonokhoz történő hozzárendelésére vonatkoznak. Például, Tetrahymena és Paramecium, és a hipotrichok Stylonychia és Oxytricha, fordítsd le az UAA-t és az UAG-t glutaminként, az UGA az egyetlen stopkodon, míg a hipotrich Euploték lefordítja az UGA-t ciszteinnek, és az UAA-t és az UAG-t stopkodonként használja (áttekintést lásd a Lozupone-ban et al., 2001). Azt feltételezték, hogy a tRNS-ek változásain túl a stop kodon újracsatlakozásának magában kell foglalnia az eRF1 szerkezetének megváltoztatását is. Jelentős erőfeszítéseket tettek a sorrendre eRF1 variáns genetikai kódú csillófajokból származó gének (Karamyshev et al., 1999; Inagaki és Doolittle, 2001; Liang et al., 2001; Lozupone et al., 2001). Azzal a hipotézissel összefüggésben, hogy az eRF1 N-terminális doménje szerepet játszik a stop kodon felismerésben (Bertram et al., 2000), több szekvencia összehangolást elemeztek, hogy megpróbálják megjósolni, hogy az eRF1 mely aminosavai vesznek részt a stop kodon felismerésben. Az alkalmazott eRF1 szekvenciák számától függően azonban az N-terminális domén különböző aminosavmaradék-csoportjait választották (Lehman, 2001; Lozupone et al., 2001; Muramatsu et al., 2001).

Ebben a tanulmányban igazoltuk azt a feltételezést, hogy a variáns genetikai kóddal rendelkező ciliate-ből származó eRF1 nem ismeri fel az újra hozzárendelt stopkodont. Eredményeink azt mutatják Euplóták Az eRF1 nem reagál az UGA-ra, amelyet cisztein-kodonként használnak ebben a szervezetben. Megmutattuk azt is, hogy új eRF1 szekvenciák bevezetése az eRF1 összehangolásba megkérdőjelezte az eukarióták stop kodonfelismerésével kapcsolatos legújabb hipotéziseket.

Eredmények

A. Izolálása Euplotes aediculatus az eRF1-et kódoló gén

A kibocsátási tevékenység Euploték eRF1 in vitro

A tisztított ember felszabadító aktivitása és Euploték eRF1 (Eu‐ERF1) a három stop kodonnal és a közeli rokon triptofán UGG kodonnal mértük egy in vitro RF vizsgálat. Mint egy korábbi tanulmányból ismert (Frolova et al., 1994), a humán eRF1 az adott vizsgálati rendszerben reagál a három stop kodonra (1. táblázat). Ugyanakkor ugyanazon feltételek mellett, Eu‐ERF1 csak az UAA-ra és az UAG-ra reagált, az UGA-ra azonban nem, amely a ciszteint kódolja Euploték. Az észlelt UGG kodonnal nem tapasztaltunk aktivitást, mindkét tényező (1. táblázat) a diszkriminációs képesség fenntartását mutatta Eu‐ERF1 és az emberi eRF1 a közeli rokon kodon felé. Mint a gerinces eRF1-ek esetében (Frolova et al., 1994; Zhouravleva et al., 1995), EuAz ‐eRF1 aktív volt eRF3 és GTP nélkül, megerősítve azt a következtetést, hogy ezek az összetevők nincsenek érintettek a peptidil-tRNS hidrolízisében. Nyúl riboszómákkal a Eu‐ERF1 valamivel alacsonyabb volt, mint az emberi eRF1 (1. táblázat). Ez a jelentéktelen különbség összefüggésbe hozható egy heterológ rendszer alkalmazásával, amelyben a EuAz emlős riboszóma -eRF1 nem lehet teljesen tökéletes.

eRF1 f [35 S] Met felszabadul, kb. UGAA UAGA UAAA UGGA

Exp.1 Ember	5590	4640	5120
Euploték	0	3050	4030
Exp.2 Ember	9440	6420	7920
Euploték	0	3200	4580

Az összes értékből kivontuk a tetraplet hiányában felszabaduló f [35 S] Met mennyiségét (háttér 500–800 cpm). Az 1. és 2. kísérletet különböző f [35S] Met-tRNS készítményekkel hajtottuk végre. Mindegyik kísérletben három független mérés átlagát mutatjuk be. A mérések szórása 11% volt.

Vita

Az emberi és béka eRF1 mind a három stop kodont felismeri, és más tényezők és GTP nélkül megkülönbözteti őket a közeli rokon UGG kodontól. in vitro transzlációs terminációs rendszer nyúl újra asszociált riboszomális alegységekkel (Frolova et al., 1994). Egyelőre azonban nem állnak rendelkezésre adatok az eRF1-ek stopkodon-specifitására a variáns genetikai kódokkal rendelkező organizmusokról. Ezekben az organizmusokban a stop kodon egy sens kodonhoz való hozzárendelését vagy kizárólag a rokon antikodont hordozó szuppresszor-szerű tRNS szabályozza, vagy egy rokon tRNS és egy módosított eRF1 együttes jelenléte, amely elvesztette képességét az újra hozzárendelt kodon felismerésére. stop kodont, vagy akár önmagában a riboszómát. Az előbbi esetben a szuppresszor tRNS-ek versenye miatt, amelyek képesek megfejteni a stop kodont és az eRF1-et (Drugeon et al., 1997; Le Goff et al., 1997), a teljes hosszúságú fehérjék szintéziséhez nagy mennyiségű szuppresszor tRNS és csökkentett mennyiségű eRF1 szükséges. Ez utóbbiban a riboszóma egyik komponensét be kell vonni a stop kodon felismerésbe.

E lehetőségek megkülönböztetésére egyesítettük in vitro emlős riboszómák eRF1-gyel E. aediculatus amelyben az UGA ciszteint kódol, és csak az UAA és az UAG marad terminációs jelként. Így arra a kérdésre kerestük a választ, hogy két vagy három kodont dekódolnak-e ebben a heterológ rendszerben. Az 1. táblázat eredményei azt mutatják, hogy az UGA-t nem dekódolja stop kodonként Eu‐ERF1 ebben a rendszerben, ezt bizonyítva Euploték Az eRF1 elvesztette a képességét, hogy reagáljon az újból hozzárendelt UGA-ra, és hogy az UGA átrendelését nem az eRF1-gyel versenyző tRNS közvetíti a riboszómán belül. Ezenfelül ezek az eredmények azt is bizonyítják, hogy a stop kodon specifitást a terminációs faktor és nem maga a riboszóma vagy riboszomális komponensek tárják fel. A képessége EuAz -eRF1 működése emlős riboszómában azt jelenti, hogy a kanonikus és variáns genetikai kóddal rendelkező organizmusok közötti eRF1-ek közötti nagy szekvencia-eltérés ellenére az eRF1-ek riboszóma-kötő helyei jól konzerváltak, és lehetővé teszik a riboszómák és az evolúciótól távoli fajokból származó faktorok keresztreaktivitását.

Az eRF1 N-terminális doménje valószínűleg utánozza a tRNS antikodon karját (Song et al., 2000). Ha igen, akkor egy „protein anticodon” felismerési modellt feltételezhetünk a stop kodonok (Ito et al., 2000; Nakamura et al., 2000). Bertram et al. (2000) az élesztő eRF1 mutációit azonosította, amelyek fokozták az UAG vagy az UGA szuppressziót. Valamennyi mutáció az eRF1 N-terminális tartományában volt, megerősítve, hogy ez a tartomány felelős a stop kodon diszkriminációért. Ezután a kihívás az volt, hogy azonosítsuk az eRF1 aminosavakat, amelyek kölcsönhatásba lépnek a stop kodonnal, hasonlóan ahhoz, mint amit a bakteriális 1-es osztályú RF-k esetében (Ito et al., 2000). A stratégia az eRF1 kristályszerkezet adataira és számos, egymástól nagyon eltérő eukarióta fajból származó eRF1 szekvencia összehasonlítására épült, ideértve a ciliátákat is (1. ábra). Feltételeztük, hogy a stop kodon használatának változását az eRF1 stopkodonokkal kölcsönhatásba lépő aminosavai közvetítik. Úgy gondolták, hogy a konzervált NIKS motívum (61–64. Pozíció) részt vesz a stop kodon felismerésében (Knight és Landweber, 2000). Ezt a feltevést elvetették, amikor eRF1 szekvenciákban a Stylonichia és Oxytricha, két csilló, ugyanazon variáns genetikai kódot használva, mint Tetrahymena thermophila, a NIKS (nem NIKD, mint a T. thermophila) motívumát azonosították (Lozupone et al., 2001).

A feltételezett „protein anticodon” régióban az eRF-ekben található egyes maradványok konzerválódnak az összes eukariótákban, kivéve a ciliátákat, ahol az UAR kodonok glutamint kódolnak, azaz I35V, M51L és L126F (Lozupone et al., 2001) és L126I Euplóták, ahol az UGA a ciszteint kódolja (1. ábra). Az a tény, hogy a 35. és 126. maradványok közel vannak egymáshoz a térszerkezetben (Song et al., 2000) összhangban áll a stop kodon felismerésben való potenciális részvételükkel (Lehman, 2001). Azonban a mikrosporidiumok eRF1 szekvenciája Encephalitozoon cuniculi, amely kanonikus genetikai kódot használ, a 126. pozícióban metionin található (1. ábra). Hogyan alkalmazható ez a változás a fent leírt modellel?

Muramatsu et al. (2001) azt javasolta, hogy az E55, a G57/T58 és az S60/N61 ismerje fel a stop kodonok első, második és harmadik bázisát. Szekvenáltuk a eRF1 gén származik P. tetraurelia (S. Kervestin, publikálatlan), és ennek a szekvenciának a többi eRF1-hez való igazítása (1. ábra) azt mutatja, hogy az 55., 57., 58. és 60. pozícióban megfigyelt eltérések nem illenek jól ehhez a modellhez. Például a Tetrahymena, Stylonichia és Oxytricha, az 57. pozíciót a szerin foglalja el, míg Paramecium Az eRF1 alanin van ebben a helyzetben. Ezek a szubsztitúciók nincsenek összefüggésben a ciliáris eRF1-ek kodon-újrafelosztásával, összehasonlítva az univerzális genetikai kóddal rendelkező organizmusok eRF1-eivel. A Ciliate eRF1-ek magas evolúciós sebességgel rendelkeznek, ami a változó pozíciók számának növekedésében tükröződik (Inagaki és Doolittle, 2001; David Moreira, személyes kommunikáció). Így nem zárható ki, hogy az eRF1 stopkodon felismerésben részt vevő maradékai különböző változó pozíciókat foglalhatnak el a csillószekvenciákban, vagy a változó pozíciók néhány rögzített helyzetben módosítják a funkcionális korlátokat. További eRF1 szekvenciák, különösen ciliáris fajokból, segíthetnek kiválasztani a stop kodon felismerésben szerepet játszó aminosavakat.

Adataink a Eu-RF1, hogy reagáljon az UGA-ra, határozottan alátámasztja azokat a feltételezéseket, amelyek szerint (i) az összes variáns genetikai kóddal rendelkező csillónál az eRF1 nem reagál az újból kijelölt stopkodonokra; (ii) ezekben az organizmusokban az eRF1 aminosav szekvenciák módosítása felelős a stop kodon felismerés mintázatáért; és (iii) feltehetően a ciliátusokból származó riboszómák ugyanúgy képesek támogatni a három stop kodon terminációját, mint a hagyományos genetikai kóddal rendelkező organizmusok riboszómái.

Mód

Plazmidok, könyvtári szűrés, génmanipulációk, DNS-szekvenálás és PCR-amplifikáció.

A E. aediculatus eRF1 gént (2. ábra) az A. Baroin-Tourancheau (Université Paris-Sud) által biztosított makronukleáris DNS pUC18 könyvtárból izoláltuk. Mivel a csillócsontok eRF1-ei nagyon eltérnek más eukariótáktól, a eRF1 tól től P. tetraurelia (S. Kervestin, publikálatlan) mintát alkalmaztunk a könyvtár szűrésére. A könyvtári szűrést és a génmanipulációkat a szokásos eljárásokkal (Sambrook et al., 1989). A Hybond N + szűrőkön (Amersham-Pharmacia Biotech.) Átvitt baktériumtelepeket hibridizációval detektáltuk nem szigorú körülmények között (1 óra 60 ° C-on, majd lassú lehűlés 30 ° C-ra) és 2x SSC-ben (0,3 M NaCl, 0,3 M NaCl 30 mM nátrium-citrát) és 0,1% SDS 35 ° C-on. Az inszertek teljes nukleotidszekvenciáját mindkét szálon meghatároztuk. A DNS PCR-amplifikációját 25 μl reakcióelegyben hajtottuk végre, amely 1 ng plazmid DNS-t, 100 pmol primert, 200 μM minden dezoxinukleozid-trifoszfátot, 1x kereskedelmi PCR puffert és 2,5 U Pwo DNS polimerázt (Roche) tartalmazott. Az amplifikációkat 20 cikluson keresztül (94 ° C, 30 s; 50 ° C, 30 s; 72 ° C, 1 perc) futtattuk egy hőciklusban.

Helyre irányított mutagenezis.

Ezt a keret négy kereten belüli UGA kodonjának átalakítására hajtották végre E. aediculatus eRF1 gént a kanonikus cisztein UGC kodonjába a Transformer hely-irányított mutagenezis készlet segítségével (Clontech). A kapott módosított eRF1 A DNS-t (az AUG iniciációs kodontól az utolsó kodonig) ezután PCR-rel amplifikáltuk megfelelő oligonukleotidokkal, amelyek restrikciós helyeket tartalmaztak (Ndeén és HátsóIII) közvetlen klónozáshoz a pET21b-be (Novagen). A végső konstrukció, pET‐ névenEu‐RF1 ‐ His6, tartalmazza E. aediculatus eRF1 ORF a T7 promóter ellenőrzése alatt.

Az eRF1 expressziója és tisztítása.

A teljes hosszúságú emberi eRF1-et kódoló cDNS-t inszertáltuk NdeÉN-XhoA pET23b (+) (Novagen) I helyei. EuA -eRF1 és a humán eRF1, amely His-tag-ot tartalmaz a C-terminálison, kifejeződik Escherichia coli BL21 (DE3) törzset, és Ni-NTA gyantával, Superflow (Qiagen) tisztítottuk, a leírtak szerint (Frolova et al., 1994, 2000).

Riboszómák.

A nyúl retikulocita riboszomális alegységeket P. Simonenko (Pushchino Protein Kutató Intézet) szívesen biztosította. A 0,5 M KCl-dal mosott 80S riboszómákat puromicinnel és GTP-vel kezeltük az alegységekbe történő disszociáció céljából, majd ezt követően centrifugálással oldottuk meg 10-25% (w/v) szacharóz gradiensben, amely 0,3 M KCl, 3 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitolt és 20 mM Tris – HCl, pH 7,6. Az inkubációs keverékek hozzáadása előtt az alegységeket ekvimoláris arányban egyesítettük.

In vitro RF vizsgálat.

Az eRF1 aktivitást a leírás szerint mértük (Caskey et al., 1974; Frolova et al., 1994) a három stop-kodont tartalmazó tetraplet egyike vagy a triptofán kodonját tartalmazó UGGA tetraplet telítettségi szintjén (50 μM). Az inkubációs keverék (25 μl) 20 mM Tris-HCl-ot (pH 7,5), 15 mM MgCl2, 8 mM NH4Cl, 1,5 pmol f [35S] -Met-tRNAf Met –AUG – riboszóma komplexet és eRF1-t (0,2-0,3 μg) tartalmazott. Az AUG-t és a ribotetrapleteket A. Veniaminova és M. Ryabkova szintetizálták (Novoszibirszk Biorganikus Kémiai Intézete).