Tanulmány a szalmonellafertőzés megelőzéséről a tejsavbaktériumok összesítési jellemzőinek felhasználásával

Absztrakt

A szalmonella az egyik fő kórokozó baktérium, amely ételmérgezést okoz. Ez a tanulmány azt vizsgálta, hogy a hőkezelt és az élő Lactobacillus megvédi-e a gazdanövényt a Salmonella-fertőzéssel szemben. Élő és hő által elpusztított Lactobacillusacidophilus-t adtunk orálisan Sprague-Dawley patkányoknak 2 hétig, mielőtt a patkányokat Salmonellával oltottuk be. A testhőmérséklet emelkedése mérsékelt volt a hő elölt baktériumokkal kezelt csoportban a Salmonella kontroll csoporthoz képest. Az egyes patkányok átlagos takarmányfelvétele és vízfogyasztása a hő által elpusztított baktériumok csoportjában majdnem normális volt. A széklet-szalmonellák száma összehasonlítható volt az élő és a hő által leölt L. acidophilus csoportok között. Ez a megállapítás azt mutatja, hogy a L. acidophilus elősegíti a szalmonella kiválasztódását. Ezenkívül a pro-gyulladásos citokinek szintje, beleértve a tumor nekrózis faktor (TNF) -alfa és az interleukin (IL) -1 bétát, a hő által elejtett L. acidophilus csoportban szignifikánsan alacsonyabb volt, összehasonlítva a Salmonella kontrollcsoport szintjével. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az életképtelen tejsavbaktériumok szintén fontos szerepet játszhatnak az enterális kórokozók, például a Salmonella által okozott fertőzések megelőzésében.

BEVEZETÉS

A szalmonella enterális baktérium kórokozó és fő kórokozó baktérium, amely ételmérgezést okoz. A fertőzés útjai közé tartoznak a szennyezett ételek és a víz. A szalmonella gram-negatív bacillus, ételmérgező kórokozóként paratifa-lázat, hematosepszist és gasztroenteritist okoz (1,2), és ezek a kórokozók gyakran ellenállnak az antibiotikumoknak, például a tetraciklinnek, a trimetoprim-szulfametoxazolnak és a sztreptomicinnek (3,4). A szalmonelláról ismert, hogy körülbelül 2500 szerotípusa van, köztük a leggyakrabban előforduló Typhi és Typhimurium. A Typhi egy Salmonella szerotípus, amely emberben szalmonellózist okoz. A Salmonella typhimurium, amelyet ebben a vizsgálatban alkalmaztak, szalmonellózist okoz egerekben, ezért hasznos törzs, amelyet gyakran találnak állatok bakteriális fertőzésében (5).

Az immunrendszerben a makrofág felelős az immunválaszokért, beleértve a veleszületett és adaptív immunválaszokat a fertőzésekkel szemben az összes gazda védelmi rendszerében. Amikor a kórokozó megközelíti az epitheliális gátat, a makrofág citokineket termel olyan fagocitózis kiváltására, mint a tumor nekrózis faktor (TNF) -alfa (6). Különösen a TNF-alfa játszik fontos szerepet a gazda immunválaszaiban és a gram-negatív bakteriális fertőzésekben (7). Fontos paraméterként használják a Salmonella fertőzés állatmodelljeiben is. A szalmonellával fertőzött csecsemőknél magas a TNF-alfa szint (8).

Tejsavbaktériumok (LAB) alkalmazásával végzett szalmonella-gátlási vizsgálatok gyakran a következő témákra összpontosítottak: ételmérgezéses kezelések kórokozókat gátló bakteriocinnal (9), a LAB és a bél hámsejtjei közötti immunológiai kommunikáció révén megszerzett immunitás (10) és ételmérgezés kezelése vagy megelőzése a kórokozók vastagbél-tartózkodásának gátlásával koaggregáció, autoaggregáció, bélsejt-tapadás és baktériumok szénhidrogénekhez való tapadásával (11).

Ebben a vizsgálatban az élő és a hő által elpusztított (hk) LAB koaggregálását hidrofóbia alkalmazásával végeztük, és a legjobb koaggregációs képességű LAB-kat választottuk ki a Salmonella-fertőzés megelőzésének vizsgálata céljából állatmodellben.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

LAB és S. typhimurium készítmény. A LAB esetében a Lactobacillus acidophilus 11869BP-t, amelyet ebben a vizsgálatban két nap alatt egyszer alkalmaztunk és orálisan adtunk be, a CELLBIOTECH Co. Ltd.-től (Gimpo, Korea) tenyésztettük. A LAB-ot MRS-táptalajba (Difco, Detroit, MI, USA) oltottuk be, és 37 ° C-on tenyésztettük 18 órán át.

24 órán át, majd kétszer steril sóoldattal mossuk a hozzá kapcsolódó anyagcsere-anyagok eltávolításához. Ezt követően autoklávozással 121 ° C-on 15 percig megölték. a hk LAB oldatot fagyasztva szárítottuk, és használat előtt sóoldatban oldottuk (12). A Salmonella typhimurium NCCP 10725 értéket használtuk ebben a vizsgálatban. Ez a törzsrázás (200 fordulat/perc sebességgel) agyszívó infúziós táptalajban (Difco, Detroit, MI, USA) 18–24 órán át 37 ° C-on, aerob körülmények között, centrifugálással (3200 × g, 4 ℃, 20 perc), utána egyszer rázogatták - egyszer azonos típusú friss táptalajban tenyésztették.

Sejtkultúrák. A HT-29 humán vastagbél adenokarcinóma sejtvonalat (KCLB 30038; Seoul, Korea) sejtvonalakat tenyésztettük RPMI1640-ben, amelyet 10% -os marha magzati szérummal (FBS; HyClone, Logan, UT, USA) és 1% penicillin/sztreptomicinnel egészítettünk ki. (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). A sejteket 37 ° C-on tenyésztettük 5% CO2 és 95% levegő atmoszférában.

A koaggregációs képesség in vitro vizsgálata. A koaggregációs elemzést Handley és mtsai. (13) A LAB élő és hk baktériumok és a Salmonella koaggregációs képességeinek mérésére a LAB baktériumok és a Salmonella minden OD-jét elkészítettük 0,5-nél. A Salmonella typhimurium és az élő vagy hk LAB baktériumok keverékeit két órán át tenyésztettük OD szintjük mérésére (14). Ezután a koaggregációs képességeket mértük a következő egyenlet segítségével.

A: abszorbancia 600 nm-en, sal: Salmonella typhimurium, lac: lactobacillus acidophilus

Tapadásvizsgálat. Az adhéziós vizsgálatot Jacobsen és mtsai. (15) Egy 12 üreges szövetkultúra lemez minden egyes lyukába beoltottuk HT-29 sejteket. 500 μl szérum és antibiotikumok nélküli DMEM-et adunk minden üregbe, és 37 ° C-on, 5% CO2-on inkubáljuk 1 órán át. A probiotikumokat és az S. typhimuriumot egy éjszakán át tenyésztettük. A baktériumkultúrákat megfelelően hígítottuk (10x) DMEM-mel, hogy körülbelül 108 sejt/ml baktériumkoncentrációt kapjunk. Ezzel egyidejűleg Salmonella-t és élő vagy hk LAB-t adtunk hozzá 1 óra inkubálásig. 1 órás inkubálás után az összes edényt háromszor mossuk foszfáttal pufferolt sóoldattal a meg nem kötött baktériumok felszabadítása érdekében. A lyukat grammfestő készlettel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) festjük és mikroszkóppal (× 1000) figyeljük meg.

Kísérleti állatok. Nyolc hetes fehér hím Sprague-Dawley patkányokat az Orient Bio-tól (Seongnam, Korea) vásároltak. Ketrecbe tették őket öt fős csoportokban. Az egy hetes alkalmazkodási időszak alatt a patkányokat arra késztették, hogy szabadon vegyenek pellet típusú táplálékot és vizet 24 ± 2 ℃ hőmérsékleti, 40 ± 20% relatív páratartalom és 12 órás megvilágítási ciklus mellett. Miközben monitorozták egészségi állapotukat, székletüket Salmonella-shigella lemezen (Difco, Detroit, MI, USA) tenyésztették S. typhimurium szelektív táptalajjal, mielőtt a fertőzött patkányokat szkríneléssel szelektálták volna.

A LAB orális beadása. Az LAB orális alkalmazásának a patogén baktériumok szaporodására gyakorolt gátló hatásainak vizsgálatához hat kísérleti csoportot készítettünk, az 1. táblázat szerint, és mindegyik csoporthoz kilenc patkányt rendeltünk. Az összes csoportot úgy kezeltük, hogy három napig antibiotikus eljárással (ampicillin: 4 g/l) megzavarják az eredeti bélflórát. Ezután a L. acidophilus él és hk baktériumokat készítettek. Két héttel a kórokozó baktériumok beadása előtt 1 × 10 9 és 1 × 10 10 CFU 1 ml LAB-t adtak be orálisan a patkányoknak egy héten keresztül minden nap.

Asztal 1.

A kísérleti csoportok kialakítása a probiotikumok beadása alapján

CsoportokAz alkalmazás feltételeProbiotikumok kezelése

NC	Nem adminisztráció	-
SA	Nem adható be, a kórokozó beoltása után	-
L.1.0E + 9	Adagolás előtt, naponta 2 héttel a kórokozó beoltása előtt	élőben 10 9 CFU
L.1.0E + 10	Adagolás előtt, naponta 2 héttel a kórokozó beoltása előtt	élő 10 10 CFU
hk.1.0E + 9	Adagolás előtt, naponta 2 héttel a kórokozó beoltása előtt	hőölve 10 9 CFU
hk.1.0E + 10	Adagolás előtt, naponta 2 héttel a kórokozó beoltása előtt	hőelölt 10 10 CFU

Testtömeg és testhőmérséklet. Az egyhetes adaptációs periódus után LAB-t adtunk a patkányoknak, és testtömegüket hetente mértük. A Salmonella által kiváltott hasmenés előtt (0 óra) és (24 óra) után a patkányok testtömegét mértük, hogy megerősítsék változásukat. A patkányok testhőmérsékletét a szalmonella okozta hasmenés előtt (0 óra) és után (1, 3, 6, 9, 12 és 24 óra) mértük egy állati rektális hőmérővel a változások megerősítésére.

A takarmányfelvétel és a vízfogyasztás mérése. A Salmonella orális beadása előtt minden patkány takarmányának és vízmennyiségének mennyiségét megerősítették. A Salmonella-fertőzött hasmenés előtti és utáni takarmányfelvétel mennyiségének összehasonlításához a takarmány mennyiségét napi 200 g-ra korlátoztuk. A vízmennyiséget napi 500 ml-re is korlátozták.

Az élő szalmonella baktériumok számítanak. A kórokozó baktériumok szaporodásának igazolására a kísérleti állatok ürülékét aszeptikusan gyűjtöttük a metabolikus ketrecben 24 órán át. Az egyes patkánycsoportok székletének egy grammját 9 ml sóoldatban homogenizáltuk, és sorozatosan hígítottuk PBS-sel. Homogenizálás után a széklet anyagát sorozatban hígítottuk, és MacConkey agarra (BD Biosciences, San Jose, Kalifornia, USA) szélesztettük. Az agarlemezeket 37 ° C-on 24 órán át inkubáltuk, és a baktériumokat CFU/g széklet anyagnak számoltuk. A Salmonella kolónia morfológiája tiszta kultúrában és fertőzött ürülékben hasonló volt (16).

Citokinvizsgálat. Három órával a patogén S. typhimurium baktérium orális beadása után vérmintákat vettünk a patkányok pályájáról. Az összegyűjtött vérmintákat két órán át szobahőmérsékleten hagytuk, majd a szérum elválasztására centrifugáltuk (4 ° C, 1500 × g, 15 perc). A mintákat a citokinanalízis elvégzéséig -80 ° C-on tartottuk. A szérumot felolvasztottuk a szérum citokinanalíziséhez, és a gyulladásgátló citokin TNF-alfát és IL-1bétát (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) ELISA-val igazoltuk. Mértük i-Mark műszerrel (Bio-Rad Laboratories, CA, USA).

Mikroszkópos megfigyelés. A bélminták kóros vizsgálathoz való előkészítéséhez a bélszövetet levágtuk, 24 órán át 10% -os formalinban rögzítettük és vízzel mostuk. A szövetet alkoholban (1 órán át 70, 80, 90 és 100% -ban) és xilolban (3 lépés, 1 óra minden lépésnél) dehidratáltuk, és paraffinba ágyazottuk. A paraffinblokkot 7 μm vastagságban szeleteltük, hematoxilin-eozinnal (H&E) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) festettük, majd ismét grammfestő készlettel festettük (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ) és mikroszkóppal (× 1000) figyelték meg.

36,7 ml tisztított vízbevitel, ami kevesebb volt, mint az SA csoport (4. ábra B).

VITA

A szalmonellózis elleni antibiotikum-kezelés legsúlyosabb problémája az elhalt Salmonella által okozott másodlagos kár (17). Az antibiotikumokkal szemben ellenálló Salmonella újabb problémát jelent (18). E problémák leküzdése érdekében az antibiotikumokat diszkréten kell használni, és a salmonella eltávolításán túl felül kell hárítani az elhalt Salmonella másodlagos károsodásait is. Ebben a vizsgálatban a Salabella gátlásában és eltávolításában a fent említett feltételeknek megfelelő LAB teljesítményét megerősítették a Salmonella megelőzésében és kezelésében a LAB segítségével.

A takarmányfelvétel mennyiségének vizsgálata során az SA csoportban az összeg hirtelen csökkent. Ez az eredmény egybeesett az előző vizsgálat eredményével (19). A LAB élő és hk baktériumcsoportok esetében a takarmánybevitel mennyiségének csökkenése enyhe volt, majdnem ugyanazon a szinten maradt, mint a normál csoporté. Wang és munkatársai tanulmánya szerint. 1993-ban (20) a Salmonella beadása utáni vízbevitel mennyisége megnőtt a Salmonella endotoxinok hatása miatt (20). Ebben a vizsgálatban minden SA-csoportba tartozó patkány 39,3 ml vizet vett be, míg mindegyik Salmonella és hk (1010) LAB-csoportba tartozó patkány 32,6 ml-t vett fel, ami megerősíti, hogy a Salmonella-fertőzés utáni vízfelvétel mennyisége normalizálódott. Ez az eredmény azt jelzi, hogy a LAB hk baktériumok az alvadási tulajdonságok miatt eltávolították a szalmonellát és szinte a salmonella melléktermékeit, így a vízbevitel mennyiségének növekedése veszélybe került.

E vizsgálat legnevezetesebb eredménye a Salmonella élő baktériumok számának különbsége volt az élő és a hk LAB csoport székletében. Az előző vizsgálatokban a szalmonella növekedését a tejsav savas stressz körülményei között gátolták (21). Ebben a vizsgálatban a széklet-Salmonella élő baktériumok a LAB élő baktériumok kezelési csoportjában szignifikánsabban gátoltak, mint az SA-csoportban. Ez összefüggésben lehet azzal a L. acidophilus-szal, amelyet ebben a vizsgálatban felhasználtak tejsavval a bél pH-jának megváltoztatására és a Salmonella proliferáció gátlására. A LAB hk baktériumokat kezelő csoportban a székletből származó Salmonella élő baktériumok számának változásának megfigyelése eredményeként nagy mennyiségű szalmonella maradt fenn a székletben. A bélben maradt Salmonella a hk LAB aggregációja miatt ürült. Mint említettük, a szalmonella-kezelések antibiotikumokkal szembeni rezisztenciáját és a szalmonella-endotoxinokat legyőzöttnek tekintik.

A patkányok gyulladásszintjének vizsgálatához a Salmonella beadása után összehasonlították szérum TNF-alfa szintjüket. A LAB élő és hk baktériumcsoport TNF-alfa szintje szignifikánsan csökkent, mint az SA csoportban. Különösen a 10 10 élő és a hk LAB csoportban csökkent a szint, mint a 10 9 LAB csoportban. A Lactobacillus GG alkalmazásával végzett klinikai vizsgálat korábbi tanulmánya szerint a LAB beadása hozzájárult az immunológiai fokozásban részt vevő receptorok expressziójának fokozásához (22). Az állatmodellekhez beadott LAB-okról azt hitték, hogy hozzájárultak a bél immunológiai fokozásához és a gyulladásos citokin TNF-alfa szint növekedésének gátlásához Salmonella-fertőzés esetén. Ezért az élő baktériumokat a bél immunrendszerével szorosabban összefüggőnek tekintették, mint a hk baktériumokat.

Összefoglalva, amikor összehasonlítottuk a LAB élő és a hk baktériumokat a Salmonella-fertőzés megelőzésének szempontjából, a LAB 10 9 csoport élő baktériumcsoportja kimutatta, hogy kiválóan alkalmas a szérum TNF-alfa és Reprezentatív gyulladásos citokinként ismert IL-1béta; és a LAB 10 10 csoportban az élő és a hk baktériumok szintje hasonló volt. Ennek oka az immunológiai fokozódás átmeneti növekedése volt a LAB élő baktériumok beadása után; és amikor több LAB-ot adtak be, hasonló immunológiai javulás következett be. Az előző vizsgálat szerint a szalmonella endotoxinok szomjúságot váltottak ki a patkányokban (20). Ezért az a Salmonella-csoport jelentette a legnagyobb mennyiségű vízfogyasztást, amelynél várhatóan a legtöbb Salmonella-endotoxin volt, míg a Salmonella- és LAB-csoport csökkent mennyiséget mutatott. Figyelembe véve a vízbevitel jelentős csökkenését, különösen a hk LAB csoportban, az LPS okozta csökkent szomjúság hatékonyabb volt a LAB hk baktériumok csoportjában.