Haemolitikus aktivitása és a nematociszta mérgének jellemzése Pelagia noctiluca (Cnidaria: Scyphozoa)

Cikkek

Teljes cikk
Ábrák és adatok
Hivatkozások
Idézetek
Metrikák
Engedélyezés
Újranyomtatások és engedélyek
PDF

Absztrakt

Bevezetés

A medúza a Cnidaria családba tartozik, amely egy ősi állatcsoport, amely a tengeri környezetben számos mechanizmust fejlesztett ki a zsákmány befogásával és védelmével kapcsolatban. Jellegzetes cnidarianus sejttípus a csípős sejt nematocita, főleg a csápokon és a védekező szerveken található meg. A fonálsejtek tartalmazzák a nematociszta organellát, amely viszont egy kapszulából és egy belső üreges tubulusból áll sóoldatban, és toxinokat tartalmaz, amelyek összetételükben különböznek a medúzafajok között (Cheng et al. 2005; Ramasamy et al. 2005a, 2005b) . A nematociszták különféle mechanikai és kémiai ingerekre, valamint alkalmi érintkezésekre képesek kisülni, és az állatvilág legkifinomultabb halálos fegyvereinek tekintik őket (Tardent 1995).

A cnidarianus méreg biológiailag aktív molekulák komplex keverékéből készül, beleértve az 5-hidroxi-triptamint, a hisztamint, a fehérjéket, például proteázokat és foszfolipázokat, valamint a kis peptideket. A nematocyst toxinok számos bioaktivitást fejtenek ki, például hemolitikus, citolitikus, klastogén, enzimatikus, kardiotoxikus, neurotoxikus és inszekticid aktivitást (Mariottini et al. 2002; Li et al. 2005; Yu et al. 2005; Monroy-Estrada et al. 2007; Kang és mtsai (2009; Birsa és mtsai, 2010). Sok esetben a citolitikus, a hemolitikus vagy a neurotoxikus hatásokat számos biológiai vizsgálat mutatta be, amelyek közül a hemolitikus vizsgálat a legalkalmasabb és leggyakrabban használt, nagyon érzékeny és egyszerűen kivitelezhető (Marino és mtsai 2008). A méregkivonatok megszerzésének és tárolásának technológiai nehézségei és labilis jellege miatt azonban a cnidarianvenom jelenlegi megértése korlátozott (Feng et al. 2010). Tanulmányokat végeztek a Messinai-szorosban élő cnidarianok toxikológiai jellemzőiről (Marino et al. 2004a, 2004b, 2006, 2007). A Messinai-szorosban a medúza Pelagia noctiluca bőséges egész évben, különösen tavasszal és nyáron, amikor a planktonikus táplálék nagyobb mennyiségben áll rendelkezésre, ami a nagy „virágzások” átmeneti megjelenéséhez vezet.

Pelagia noctiluca, a Scyphozoa, a Semaeostomeae rendű, Pelagiidae családba tartozó cnidariánus kicsi, pelagikus rózsaszínű medúza, amelynek foszforeszkáló harangja 3–12 cm átmérőjű, és a csápokban, a szájkarokban és a harang felső felületén nematociszták találhatók. E medúza „virágzása” kihat az emberi egészségre, és visszaesik a gazdasági tevékenységekbe, ideértve az idegenforgalmat és a halászatot is. A nematocyst toxinok különféle reakciókat okoznak az emberekben, a helyi elváltozásoktól, vezikuláktól és bőrpírtól kezdve olyan súlyos és veszélyes szövődményekig, mint a kardio- és neurotoxikus hatások és a Guillain-Barré szindróma (Burnett et al. 1986; Pang & Schwartz 1993; Tibbals 2006; Mariottini & Pane 2010).

E tanulmány célja a nyirokméreg izolált nematocisztákból kivont nyers mérgének aktivitásának vizsgálata P. noctiluca a hal vörösvértestének membránjain, a hemolitikus aktivitás és a lizoszomális stabilitás értékelésével, valamint e méreg fehérje összetételének tanulmányozásával HPLC szétválasztással és elektroforézis analízissel, nyúl vörösvértestek felhasználásával, mint a kapcsolódó molekuláris biológiai vizsgálat legjobb célsejtjeinek. Sőt, gátlási kísérletek a P. noctiluca az eritrocita membránok lipid komponenseivel is elvégeztük.

Ez a tanulmány fontos hozzájárulást jelenthet a cnidarian méreg biológiai aktivitásának megértésében és a toxinok sejtcéljainak azonosításában, és ezáltal új, természetes forrásokból származó bioaktív vegyületek felfedezéséhez és alkalmazásához vezethet.

Anyagok és metódusok

Nematocysta izoláció

A szifozoán példányai P. noctiluca gyűltek össze a Messina-szoros szicíliai partjai mentén. A nematocystákat izolálták a marginális csápokról Salleo és mtsai. (1983). Röviden, mindegyik mintából kivágtuk az orális karokat, és hideg desztillált vízbe (4 ° C) helyeztük, hogy lehetővé tegyük a nematociták ozmotikus lízisét és az organoidok bejuttatását. A kapott szuszpenziót planktonhálókkal (40-, 60- és 100 μm-es sziták) többször szűrjük és centrifugáljuk (hűtőszekrényes centrifuga Eppendorf, 1700 g 5 percig) a törmelék eldobására és a méreg kivonásának térfogatának csökkentésére. A nematocisztákat, miután elkülönítettük, felhasználásukig –20 ° C-on tároltuk.

Méregkitermelés

A 90–100 nematocisztát/μL-t tartalmazó mintákat újraszuszpendáljuk [145 mM nátrium-klorid (NaCl), 10 mM foszfát, pH 7,4, ozmotikus nyomás 300 mOsm/kg H2O] oldatban, és jégen ultrahanggal kezeljük. Sonoplus (70 MHz, 20 s, 30-szor) a kapszulacsepp folyadék kinyerésére. A nyers kivonatot ezután centrifugálással elválasztották a zúzott nematocisztáktól (hűtőszekrényes centrifuga Eppendorf, 1700 g 10 percig) és a biológiai vizsgálathoz hajtjuk. A méreg fehérjekoncentrációját Bradford (1976) módszerével határoztuk meg, összehasonlítva a szarvasmarha szérumalbumin (BSA) fehérjekoncentrációs normáival.

Hal vérminták

Halvértesteket vettünk mindkét édesvízi aranyhal öt mintájából Carassius auratus és tengervíz aranysárga márna Liza aurata. Vérmintákat (1,5 ml) vettünk a farokvénából heparinizált ampullákba, és azonnal elemeztük morfológiai megfigyelés, hemolízis vizsgálat és glutation (GSH) mérése céljából. A lizoszomális stabilitás érdekében 1 ml fiziológiás sóoldatot tartalmazó fecskendővel vérmintákat (0,5 ml) gyűjtöttünk.

Morfológiai elemzés

Morfológiai elemzése C. auratus és L. aurata az eritrocitákat heparinizált teljes vér üveglemezre kenésével végeztük. Mindkét faj vérmintáit különböző koncentrációjú nyers kivonattal inkubáltuk 90 percig. A tárgylemezeket éjszakán át levegőn szárítottuk, majd 20 percig abszolút metanolban rögzítettük, majd 15% -ig 10% -os Giemsa-oldattal festettük. Vérkeneteket figyeltek meg az Axio Imager Z1 (Zeiss) fénymikroszkóppal, 63x olajimmerziós objektívvel.

Haemolysis assay

Foszfolipid gátló hatása a hemolitikus aktivitásra

A szfingomielint, a foszfatidil-szerint és a foszfatidil-etanol-amint TBS-ben oldva 25,0 és 250,0 μg/ml koncentrációt kaptunk a reakcióelegyben. Ezek az inhibitorok viszonylag oldhatatlanok voltak a TBS-ben. Ezeknek a vegyületeknek a törzsoldatokat ultrahanggal kezeltük (Branson, B15 modell, Danbury, CT) 4 ° C-on 20 másodpercig, és centrifugáltuk 27000 ° C-on. g 30 percig (Tong & Kuksis 1986).

A különböző koncentrációban alkalmazott inhibitorokat összekeverték az eritrocita szuszpenziókkal, és 20 perc előinkubálás után a méreghez adták a citotoxikus vizsgálatokhoz. A kontroll lízist a korábban leírt módon mértük.

A hal vörösvértestjeinek lizoszomális stabilitása

A hal vörösvértestjeinek lizoszomális stabilitását a semleges vörös retenciós (NRR) vizsgálattal értékeltük, Lowe és munkatársai által leírtak szerint. (1995), némi módosítással. Mindkettőnek C. auratus és L. aurata, hat csövet készítettünk 200 μl vér/fiziológiás sóoldat keverékből, majd a nyers mérget adtuk hozzá 0,4, 4, 8, 20, 28 és 40 μg/ml koncentrációban. A keverékeket 30 percig inkubáltuk, majd 40 μl mintát pipettáztunk a mikroszkóp tárgylemezének közepére, és 15 percig inkubáltuk egy fényálló páratartalmú kamrában, 4 ° C-on, hogy a sejtek tapadhassanak. Ezután az oldat feleslegét óvatosan leöntjük, és 40 μl semleges vörös színezék-oldatot (10 μl 2 ml fiziológiás sóoldatban 20 mg NR törzsoldatból 1 ml dimetil-szulfoxidban) adunk a sejtréteghez. 15 perces inkubálás után egy fedőlapot tettünk a tetejére, és a tárgylemezeket fénymikroszkóppal (40x) vizsgáltuk. A festék retizióját a sejtekben a lizoszómákban 15 percenként, az első órán át, majd 30 perces időközönként rögzítettük, amíg a sejtek több mint 50% -a kimutatta a semleges vörös festék szivárgását a lizoszómákból, egy teljes időtartamig. 180 percig.

Glutation (GSH) mérése nyers méregnek kitett vörösvértestekben

A GSH-t Beutler (1975) módszerével mértük, kis módosítással. 0,1 ml hal teljes véréhez nyers mérget (90–100 nematocysta/μL) adunk 0,4, 4, 8, 20, 28 és 40 μg/ml koncentrációban. 0,2 ml keveréket 30% triklór-ecetsavval (TCA) (1: 3 v/v, vér: sav) kicsapunk és 4500 ° C-on centrifugáljuk. g 5 percig, és 0,5 ml ezt a felülúszót adunk 2,0 ml 0,3 M Na2HPO4 (nátrium-foszfát-nátrium-foszfát) -oldathoz, majd 0,25 ml DTNB-t (5,5-ditiobisz-2-nitro-benzoesav) adunk ehhez az oldathoz. A csökkent GSH-t a minták abszorbanciaértékeinek különbségeként mértük DTNB jelenlétében és hiányában 412 nm-en. A GSH-értéket μmol GSH/g hemoglobin formájában számoltuk.

A hemoglobin-koncentrációt (Hb) egy vérmintában határoztuk meg a GSH méréséhez használt nyers méreg azonos koncentrációival, a Drabkin-oldatot használó cianometahemoglobin képződés alapján (Van Kampen & Zijlstra 1961), spektrofotometrikus abszorbanciával 540 nm-en.

Nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid-gél elektroforézis (SDS-PAGE)

Az elektroforézis elemzést a Mini-Protean II kettős lemezes cellában (Bio Rad) végeztük. A gélek, minták előkészítését és az elektroforézist Laemmli (1970) által leírt körülmények szerint hajtottuk végre. A mintákat denaturáltuk töltőpufferben forralva [25 mM 2-amino-2-hidroxi-metil-propán-1,3-diol (TRIS bázis) 192 mM glicin, 1 tömeg/térfogat% nátrium-dodecil-szulfát (SDS), pH 8,3], amely β-merkaptoetanol, mielőtt a gélre helyezték őket. A fehérjéket megfestettük (Brilliant Blue R G250 0,1%, 40% metanol, 1% ecetsav) és 0,1% ecetsavval, 0,4% metanollal, desztillált vízzel eldesztíroztuk. A géleket standard fehérje molekulatömeggel kalibráltuk (Sigma-Aldrich).

HPLC méretkizárásos kromatográfia

P. noctiluca a nematocisztakivonatot méretkizárásos kromatográfiának vetették alá BioSuite 250, 10 μm SEC, 7,5 × 300 mm oszlopon (Waters) folyadékkromatográfiás HPLC rendszeren (Shimadzu Scientific Instruments, SSI, Észak-Amerika). Az oszlopot TBS-sel mossuk (NaCl 150 mM, TRIS HCl 10 mM, pH 7,4).

200 μl injekciós térfogatot használtunk 1 ml/perc áramlási sebességgel 30 percig. A kromatogramot kettős UV detektorral rögzítettük 280 nm-nél és 220 nm-nél (mAU) TBS-ben.

Az egyes csúcsoknak megfelelő eluátumokat 1 ml/perc frakciókban gyűjtöttük össze. Az összegyűjtött frakciókat 500 ° C-on centrifugálással betöményítettük g mikrokoncentrátorokkal (3K Omega Centrifugal Devices Nanosep), és a végső koncentrált mintákat felhasználásig –80 ° C-on tároltuk.

Statisztikai analízis

Az eredményeket átlag ± szórásként fejezzük ki. Az adatokat varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük, és statisztikailag szignifikánsnak tekintettük a o Haemolitikus aktivitása és a nematociszta mérgének jellemzése Pelagia noctiluca (Cnidaria: Scyphozoa)