Fejlesztés és in vitro pramipexollal töltött üreges mezoporózus szilícium-dioxid (HMS) részecskék biztonsági értékelése

Cikkek

Teljes cikk
Ábrák és adatok
Hivatkozások
Idézetek
Metrikák
Engedélyezés
Újranyomtatások és engedélyek
PDF

Absztrakt

Ebben a tanulmányban gömb alakú üreges mezoporózus szilícium-dioxid (HMS) részecskéket, átlagos átlagos nagyságuk 550 nm, dopamin-receptor agonista pramipexollal töltöttek be mint modell gyógyszer. Magas gyógyszerterhelést (55%) értek el a HMS tartályszerkezetbe történő beépítésével. Az újonnan kifejlesztett gyógyszer-szállító rendszereket további kettős bevonattal láttuk el bioadhéziós kitozán és nátrium-alginát polimerekkel a tartós felszabadulás elérése érdekében. A kettős kitozán/nátrium-alginát bevonat csökkentette a kezdeti tört hatást és csökkentette a pramipexol felszabadulását két pH-értéknél (1,2 és 6,8), amint azt a in vitro kiadási tanulmányok. A hemolitikus vizsgálat és az MTT-teszt humán neuroblastoma SH-SY5Y sejtekben jó biztonságossági profilt mutatott az új pramipexollal töltött HMS részecskéknél. Ezenkívül a pramipexollal töltött (nem bevont vagy kitozánnal bevont) HMS részecskékkel végzett kezelés során a humán neuroblastoma SH-SY5Y sejtjeinek erőteljesebb védettségét figyelték meg a H2O2 által kiváltott oxidatív károsodás ellen a szabad gyógyszerhez képest. Összegzésként azt tapasztaltuk, hogy a HMS részecskék nagy érdeklődésre tarthatnak számot, mint egy ígéretes gyógyszeradagoló rendszer az pramipexol számára. A biopolimer kitozánnal történő bevonás módosította mind a hatóanyag-leadási folyamatot, mind a in vitro védelem az oxidatív stressz ellen neuroblastoma SH-SY5Y sejtekben.

Bevezetés

Noha a Parkinson-kór (PD) pontos mechanizmusait nem teljesen ismerjük, úgy gondoljuk, hogy a túlzott szabadgyökök képződése, a mitokondriális károsodások, az oxidatív stressz és a környezeti toxinoknak való kitettség az egyik legfontosabb mechanizmus, amely neuronkárosodáshoz vezet. A pramipexol (2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6-propilamino-benzethiazol-dihidroklorid) a PD-k kezelésére javallott, önmagában vagy levodopával kombinálva. Bevezetése a PD-terápiába hatékonyan körülbelül 30% -kal csökkentette a levodopa adagját, ezáltal csökkentve a levodopa kezelés gyakori mellékhatásait [1, 2]. A pramipexol egy teljes belső dopamin-receptor agonista, amely nagyon szelektív a D2 receptorokra [3]. Ezenkívül a pramipexol jelentős neuroprotektív hatást mutat a dopaminerg receptorok agonizmusától független mechanizmusok révén [4–7]. Beszámoltak arról, hogy a pramipexol mitokondrium-célzott antioxidánsként működik, gátolja a mitokondriális hidrogén-peroxid felszabadulást és a mitokondriális akonitáz aktivitás növekedésével [4, 8].

A vitathatatlan terápiás hatékonyság mellett beszámoltak arról, hogy a vízben jól oldódó pramipexol hagyományos formáinak (kb. 200 mg/ml vízoldékonyság 20-25 ° C-on) ismételt napi adagolásával gyakran együtt jár a plazma gyógyszerkoncentrációk ingadozása, ami dózisfüggő mellékhatásokhoz [9]. A probléma leküzdésének sikeres megközelítése a pramipexol beépítése a módosított felszabadulású gyógyszeradagoló rendszerekbe [10]. A tartósan felszabaduló formák lehetséges előnyei elsősorban a beteg beadási rendszerének egyszerűsítéséhez kapcsolódnak, csökkentve a napi bevitel számát és egyes dózisfüggő nemkívánatos események csillapításához.

Itt bemutatjuk egy új gyógyszeradagoló rendszer kifejlesztését, amely a pramipexol HMS szférákban történő betöltésén alapul. A gyógyszerrel töltött HMS részecskéket nátrium-algináttal vagy kitozánnal vontuk be a pramipexol felszabadulási sebességének módosítása céljából. A biztonsági vizsgálatok fontos lépést jelentenek az új gyógyszeradagoló rendszerek jellemzésében. A fizikai-kémiai tulajdonságok, például a részecskék mérete, a töltés vagy a bevonószer típusa korrelálhat a biológiai rendszer sejtjeivel való érintkezést követő toxicitási reakciókkal. Így felléptünk in vitro a pramipexollal töltött HMS részecskék toxicitásának értékelése a vörösvérsejtekkel való lehetséges kölcsönhatásuk meghatározásával (haemolysis assay). Humán neuroblastoma SH-SY5Y sejteken végzett citotoxicitási vizsgálatot a HMS, mint megfelelő gyógyszer-szállító rendszer biztonsági profiljának értékelésére végezték el. Ezenkívül meghatároztuk a pramipexollal töltött HMS részecskék antioxidáns aktivitását a H2O2-indukált oxidatív stressz modelljében neuroblastoma SH-SY5Y sejtekben in vitro biológiai aktivitásának megőrzését bizonyítani.

Mód

A HMS mezoporózus részecskék pramipexol töltése és utólagos bevonása

A gyógyszerbetöltési eljárás az oldószeres impregnálás volt. Az eljárást 37 ° C-os vízben hajtottuk végre, és 0,1 g pramipexolt adtunk 0,1 g HMS-re. 24 órás inkubációs idő után az oldószert (víz) vákuumban bepároljuk, és a gyógyszerrel töltött részecskéket vákuumban, szobahőmérsékleten egy éjszakán át szárítjuk. A részecskéket 95% -os etanollal többször mossuk, vákuumszűréssel elválasztva (0,1 µm), és vákuumban 24 órán át szárítjuk.

Polimer bevonási eljárás: a pramipexollal töltött HMS részecskéket 0,12% -os vizes nátrium-alginát/kitozán oldatban inkubáltuk 2 órán át elektromágneses keverővel. Az inkubációs idő után a HMS/Prami diszperziókat 15 000 fordulat/perc sebességgel (Dragon Lab D2012 centrifuga) centrifugáltuk 15 percig, desztillált vízzel öblítettük, második centrifugálással elválasztottuk, és végül 24 órán át vákuumban szárítottuk. A mintákat HMS/Prami (nem bevont), HMS/Prami/Alg (algináttal bevont), HMS/Prami/Chit (kitozán bevonatú) és HMS/Prami/Chit/Alg (kettős kitozán/alginát bevonattal) rövidítéssel láttuk el. ).

Kábítószer-terhelhetőség

A részecskék (nem bevont és bevont) gyógyszerterhelését úgy számítottuk, hogy meghatároztuk a felülúszóban a be nem kapszulázott pramipexol mennyiségét a betöltési/bevonási eljárás során. A felülúszóban lévő pramipexol mennyiségét spektrofotometriásan határoztuk meg (262 nm, Thermo Scientific Evolution 300). A pramipexol koncentrációját a standard görbe (r > 0,998).

A részecskék jellemzése

A HMS-alapú struktúrák transzmissziós elektronmikroszkópos (TEM) jellemzését egy JEOL JEM 2100 HR STEM (200KV; pontfelbontású 0,23 nm) felhasználásával végeztük.

A fotonkorrelációs spektroszkópiát és az elektroforetikus fényszórást (Malvern Zetasizer Nano ZS, Egyesült Királyság) módszerrel alkalmaztuk a részecskeméret és a zeta-potenciál mérésére. A részecskéket (0,5 mg/ml) közvetlenül a mérések előtt desztillált vízben diszpergáltuk, míg a felméréshez 90 ° és 25 ° C szórási szöget használtunk. A méréseket három példányban végeztük.

A szülő HMS hordozó, valamint a betöltött és bevont minták textúráját alacsony hőmérsékletű nitrogén adszorpcióval vizsgáltuk Quantachrome NOVA 1200e (USA) készülékben. A fajlagos felületeket a Brunauer Emmett Teller (BET) egyenletből határoztuk meg. Az összes pórustérfogatot, a mezopórusméret-eloszlást és az átlagos pórusátmérőt az NLDFT módszerrel kaptuk.

A por röntgendiffrakciós mintázatait egy Bruker D8 Advance diffraktométerrel gyűjtöttük Cu Kα sugárzással és LynxEye detektorral 5,3 és 80 ° 2 között.θ 0,02 ° 2 állandó lépésselθ és a számlálás ideje 52,5 s/lépés.

A csillapított teljes reflexió infravörös (ATR-FTIR) spektrumokat Nicolette 400 spektrométerrel rögzítettük. Az IR spektrumokat abszorbancia módban 400-4000 cm-1 spektrumtartományban kaptuk. .

In vitro kiadási tanulmányok

Az oldódási vizsgálatokat savas és foszfát pufferekben végeztük, pH-értékük 1,2, illetve 6,8 volt. Az oldódási teszteket Paddle módszerrel végeztük, 100 fordulat/perc keverési sebességgel 37 ° C-on (Erweka DT6, Németország). A mintákat megfelelő időközönként kivettük, és friss pufferrel helyettesítettük. A kivett mintákat 15 000 fordulat/perc sebességgel (Dragon Lab D2012 centrifuga) centrifugáltuk 15 percig, és a felszabadult pramipexol koncentrációját ultraibolya (UV) spektrofotometriával határoztuk meg 262 nm hullámhosszon [47].

Haemolysis teszt

A hemolízis vizsgálatot a korábban leírt módon hajtottuk végre [48]. Az emberi eritrocitákat szikes pufferben végzett centrifugálással elválasztottuk a vértől, majd foszfátpufferben (pH 7,4) újraszuszpendáltuk. Különböző koncentrációjú HMS-t (0,025, 0,05, 0,1, 0,2 és 1,0 mg/ml), pozitív (Triton X-100) és negatív (víz) kontrollokat helyeztünk 96 lyukú lemezekre. Ezt követően mindegyik lyukhoz vörösvértest-szuszpenziót adtak. 1 órán át 37 ° C-on végzett inkubálás után a lemezeket centrifugáltuk (500 ° C) g), és a felülúszót új 96 lyukú lemezekre vittük át. A hemoglobin abszorbanciáját 430 nm-en mértük egy Synergy 2 lemezolvasóval (BioTek műszerek). Az eredményeket a pozitív kontrollok hemoglobin abszorbancia értékének% -ában, a negatív kontrollok értékével viszonyítva, nulla hemolízisként fogadtuk el.

Sejtkultúra és tenyésztés

Az SH-SY5Y sejteket Sigma Aldrich-től (ECACC sejtvonalak) kaptuk. Rutinszerűen 10% (v/v) borjúmagzati szérumot, 2 mmol/l glutamint, 50 mg/ml penicillint és 100 mg/ml sztreptomicint tartalmazó RPMI-ben tenyésztettük, és 37 ° C-on, párásított 5% CO2-atmoszférában tartottuk.

MTT-festék redukciós vizsgálat

Az SH-SY5Y sejteket 96 lyukú mikrolemezekre oltottuk 2x104 sejt/üreg sűrűségben, és hagytuk, hogy 24 órán át 37 ° C-on párás atmoszférában, 5% CO2-val a kút felületéhez kapcsolódjanak. Inkubálás után különböző koncentrációjú szabad vagy töltött pramipexolt (1, 10, 20, 100 és 200 µg/ml-nek megfelelő koncentráció) és üres HMS-részecskéket (2,14, 21,75, 43,45, 217,35 és 434,65 µg/ml) adtunk a sejtekhez, és 24 órán át inkubáljuk. Minden koncentrációhoz legalább 8 üregből álló készletet használtunk. A sejtek életképességét MTT-festék (3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolium-bromid) redukciós vizsgálattal becsültük meg [49]. A kezelés után az egyes üregekben lévő oldatot MTT oldattal (0,5 mg/ml táptalajban) helyettesítettük. A mikrotányérokat további 3 órán át 37 ° C-on inkubáltuk, és a kapott formazánkristályokat 100 ul/üreg DMSO-val oldottuk fel. Az abszorbanciát egy többszörös olvasó Synergy 2-ben (BioTek Instruments) mértük 570 nm-en (690 nm-en a háttérabszorpciónál).

H2O2 által kiváltott oxidatív stressz modell in vitro

Az oxidatív stressz modellben az SH-SY5Y sejteket 3 × 104 sejt/mélyedés sűrűségben 1 mmol/l H2O2-nak tettük ki 15 percig, hogy szubmaximális citotoxicitást kapjunk. A védelem becslése érdekében a sejteket szabad vagy töltött pramipexollal (koncentráció, 1, 10, 20, 100 és 200 µg/ml) és üres HMS részecskékkel (2,14, 21,75, 43,45, 217,35 és 434,65 µg/ml) 1 órán át H2O2-val történő kezelés előtt. A sejtek életképességét MTT-festék (3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolium-bromid) redukciós vizsgálattal becsültük meg [49].

Statisztikai analízis

Az elemzett adatpontokat normalizáltuk a megfelelő kontrollcsoportok átlagértékeire, mindegyik megfelelő 96 üregű lemezre. ANOVA-t (egyirányú varianciaanalízis) Dunnett post-hoc teszttel alkalmaztunk a megfelelő koncentrációval kezelt kísérleti csoportok közötti átlagok közötti különbségek kiszámításához. A különbségeket akkor elfogadták jelentősnek, amikor o Fejlesztés és in vitro pramipexollal töltött üreges mezoporózus szilícium-dioxid (HMS) részecskék biztonsági értékelése