Továbbfejlesztett árpabroiler takarmány hőstabil (1,3–1,4) -β-glükanázt tartalmazó transzgén malátával

Közreműködött Diter von Wettstein

Absztrakt

Az Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztériumának Országos Agrárstatisztikai Szolgálata (1998) szerint az Egyesült Államokban a brojlercsirkék éves termelése az 1987-es 5 milliárd madárról az 1996-os 7,5 milliárdra nőtt. Az egy főre eső csirkehúsfogyasztás Évente 68–88 font, ami a brojlerfogyasztás 16,9-ről 23,9 milliárd fontra vonatkozó növekedésének felel meg a tízéves időszak alatt. Körülbelül 4,4 lb takarmányra van szükség 1 lb élő csirke előállításához, és az e hústermeléshez felhasznált takarmány túlnyomó része kukorica gabonán alapul. Az árpa elfogadhatatlan összetevő a csirke takarmányában, mivel kevés metabolizálható energiát tartalmaz. Az árpa-diéták baromfinak való táplálása korlátozott tápanyagfelvételhez, lassú kezdeti növekedéshez és ragacsos ürülékekhez tapad a csirke kloakájához és aljához, valamint a tenyészketrecek padlójához.

Az árpa gabona alacsony tápértékének okát akkor fedezték fel, amikor nyers gombás vagy bakteriális enzimeket, vagy 2,5% malátát adtak az árpa étrendjéhez (1–4). Ez javította a súlygyarapodást és enyhítette a ragacsos ürülék problémáit. Rickes és munkatársai megtisztították az első (1,3–1,4) -β-glükanázt a Bacillus subtilis törzséből, amelyet ma Bacillus amyloliquefaciens néven jelölnek, és pozitív növekedési választ mutattak csirkékben, amikor a tisztított enzimet árpa-étrendhez adták. (5) A bakteriális enzim depolimerizált árpát (1,3–1,4) -β-glükánt, és ugyanolyan szubsztrát-specifitással rendelkezett, mint az endogén árpaenzim (6). Az árpa-étrend kiegészítése nyers enzimekkel a Trichoderma reesei tenyésztési szűrletéből GV-P (Grindsted Products, Grindsted, Dánia) és Onozuka 3S (Serva) kereskedelmi készítmények formájában a súlygyarapodás jelentősen növekedését és a ragacsos ürülék enyhítését eredményezte. (7–10). Így világossá vált, hogy a madaraknak hiányzik egy olyan enzim, amely depolimerizálhatja az (1,3–1,4) -β-glükánt, az árpa endospermium sejtfalak fő összetevőjét.

A T. reesei tenyésztési szűrők számos hidrolázt tartalmaznak, amelyek depolimerizálják a cellulóz [(1,4) -β-glükánt], (1,3) -β-glükánt és (1,3–1,4) -β-glükánt (11– (14). A T. reesei endoglucanase I (15) szerkezeti génjének klónozása primer szerkezete alapján cellulázként azonosította. Az árpa szuszpenziós tenyészsejtekben a gén heterológ expressziója a tenyészközegbe történő szekréciójához vezet. A cefrézési kísérletek azt mutatták, hogy ez az enzim depolimerizálja az árpa (1,3–1,4) -β-glükánt, és jelentős hőstabilitást mutat (16). Az árpa endospermiumának falaiban összekevert összekapcsolt (1,3–1,4) -β-glükán 90% poliszacharidláncból áll, amely tisztított árpa (1,3–1,4) -β-glükanáz cellotriozil (G4G4G) hasításakor keletkezik. ) és cellotetraozil (G4G4G4G4) maradékok. Ezeket a (1,4) -kötött β-glikozilcsoportokat egy (1,3) -kötések (17) választják el. A Trichoderma celluláz depolimerizálja az árpa kevert kapcsolt β-glükánt azáltal, hogy hidrolizálja a glükozil 1–4 kötéseket a cellotriozil és a cellotetraozil blokkokban, míg az árpa és a Bacillus (1,3–1,4) -β-glükanázok specifikusan hasítanak egy 1–4 kötés egy 1-3 kapcsolt glükóz mellett (14, 17, 18). Ez magyarázza, hogy mindhárom enzim elősegítheti az árpa diéták táplálkozási javulását.

Az árpa endospermium sejtfalakban található (1,3–1,4) -β-glükánok két frakcióból állnak, az egyik 40–65 ° C-on vízoldható, a másik pedig vízben oldhatatlan. Ez utóbbi savas vagy lúgos hidrolízist vagy nagymértékben tisztított enzimeket igényel a depolimerizációhoz kisebb fragmensekké, amelyek vízoldhatóvá válnak, majd elemezhetők. Woodward és mtsai. meghatározta a vízoldható árpa (1,3–1,4) -β-glükánok (17–19) kémiai szerkezetét és fizikai-kémiai tulajdonságait. Ezek a glükánok olyan molekulák populációjából állnak, amelyek molekulatömege 104 és 107 között mozog, és felelősek a β-glükán oldatok magas viszkozitásáért. A vízben oldódó β-glükánok okozzák a csirketáp, a malátázás és a sör készítését (áttekintés a 14. hivatkozásban). A vízben oldhatatlan frakció nem befolyásolja a viszkozitást. Egy kilogramm maláta- vagy takarmányárpa-gabona általában körülbelül 50 g (1,3–1,4) -β-glükánt tartalmaz száraz körülmények közötti érleléskor, vagy körülbelül 30 g-ot, ha a szemes töltés esős körülmények között történik (20–23). A vízben oldódó rész mennyisége 10, illetve 5 g⋅kg -1 az érés két körülménye között.

Hesselman és Åman (25) követték a keményítő és az (1,3–1,4) -β-glükánok emésztését a csirkék belének különböző szakaszain, miután az árpa diétát depolimerizáló enzimekkel kezelték (1,3–1,4 ) -β-glükánok. A keményítő emésztését az árpa diéta akadályozta a vékonybél felső részein, de nagyon kiterjedt volt, amikor az étrendet enzimmel kezelték. Nem találtunk (1,3–1,4) -β-glükánt a csirkek vakbéljában az étrend enzimmel történő előkezelésével vagy anélkül. Feltételezték, hogy ez a hiány a megnövekedett agresszív mikrobiális flóra miatt következett be, amely a vastagbél szárazanyag-tartalmának növekedését is eredményezte. Úgy gondolják, hogy a cecalis mikroflóra termékei a ragacsos ürülékekért felelősek, nem az (1,3–1,4) -β-glükánokért.

Korábbi közleményünkben (26) két transzgenikus árpanövénykészletről számoltunk be, amelyek egy fehérje által előállított termotoleráns (1,3–1,4) -β-glükanázt kódoló szintetikus kodonnal optimalizált gént expresszálnak. Az egyik készlet a rekombináns enzimet egy endosperm-specifikus gén promoter segítségével állítja elő a fejlődő gabonában, a másik egy aleuron-specifikus α-amiláz gén promoterrel az endospermiumba történő szekrécióhoz szükséges csírázás/malátázás során (27, 28). A termotoleráns (1,3–1,4) -β-glükanáz H (A12-M) ΔY13 (H, hibrid; A, aminosavak a B. amyloliquefaciensből; M, aminosavak a Bacillus macerans-ból) egy hibrid enzim, a két faj enzimjei. Felezési ideje> 4 óra 70 ° C-on (29). Elsődleges háromdimenziós szerkezete nagyon különbözik az endogén árpaenzimétől, fajlagos aktivitása és Vmax értéke ~ 200-szor nagyobb, mint az árpaenzimé. PH-optimuma 6 és 7 között van, és így kiválóan alkalmas a β-glükánok depolimerizációjára a csirke duodenumában, ileumában, végbélében és cecájában, amelyben a tartalom pH-ja 5,7 és 7,0 között van (30). De az enzim alacsony, 4,5–5,0 pH-érték mellett is hatékony, amely a madár termésének, mirigyes gyomrának és zsibbadásának tartalmára jellemző.

Jelen vizsgálatban a rekombináns hőstabil (1,3–1,4) -β-glükanázt tartalmazó malátával kiegészített árpa-étrenddel etetett csirkék növekedését vizsgáltuk, és összehasonlítottuk egy szokásos kukoricalapú étrenddel, árpa diéta hozzáadott maláta nélkül és árpa diéta normál maláta hozzáadásával. A tapadós ürülék gyakoriságát feljegyeztük és a β-glükánokat elemeztük (31, 32) a gyomor-bél traktus különböző részeiben, valamint az ürülékben. Rekombináns enzim jelenlétét a mirigy gyomrában, a belekben, a ceca-ban és az ürülékben aktivitásmérésekkel és diagnosztikai Western blot-okkal követték nyomon.

Anyagok és metódusok

Kísérleti állatok és körülmények.

A csirke próbát 240 Hubbard nagy hozamú brojlerrel (Fors Farms, Puyallup, WA) végeztük. Az egy napos csibéket elektromosan fűtött, emelt padlójú Petersime Brood egységekbe helyezték (Petersime Incubator, Gettysburgh, OH). A négy kísérleti étrendet véletlenszerűen elosztottuk 12 toll és 5 madár között, amelyeket véletlenszerűen egy tollhoz rendeltünk. A takarmány és a víz ad libitum volt elérhető, és a 16 órás nappali fény megmaradt. Az állatokkal végzett összes kísérletet a Washingtoni Állami Egyetem Állattenyésztési és Felhasználási Bizottságának jóváhagyásával hajtották végre. A bizottság követi a Kanadai Állatgondozási Tanács 1980-as irányelveit (33).

Diéta összetétele és elkészítése.

A csirkéket négy őrölt táplálékkal etették az 1. táblázatban megadott összetétellel: kukorica alap, árpa alap (kb. Arany ígéret), árpa diéta Golden Promise malátával, amely nem tartalmaz β-glükanázt, és árpa étrend transzgenikus vonal malátájával, amely hőt tartalmaz -stabil β-glükanáz. A malátát a Washingtoni Állami Egyetem Növénytermesztési és Talajtani Tanszékén beszerezhető mikroszkálájú malátázó berendezések felhasználásával készítettük. Az oltást 45 ° C-on 6 órán át és 80 ° C-on 4 órán át végeztük, hogy a csíráztatott árpában jelen lévő endogén β-glükanázt deaktiváljuk. Az árpa árán malátát adtak hozzá a teljes étrend 6,2% -ában.

A diéták összetétele tömegszázalékban

Adatgyűjtés a tárgyalás során.

Az egyes tollakban levő 5 madarat lemértük a 0., 6., 13. és 20. napon. Az egyes tollak takarmányfogyasztását az egyes tollak kezdeti takarmánytömegének és a meghatározás napján alkalmazott takarmánytömeg különbségének határoztuk meg. A csirkére jutó összesített takarmány-hatékonyságot az elért tömeg és az elfogyasztott takarmány arányában számoltuk. Az ürülék szárazanyag-tartalmát az 5., 8., 11., 14., 17. és 20. napon határoztuk meg ürülék összegyűjtésével és 6 órán át 105 ° C-on történő szárítással. A kloákaterületen lefelé tapadó ragacsos ürülékkel rendelkező csirkék számát ugyanazon a napon jegyezték fel, mint az ürülék.

Béltartalom gyűjteménye.

A kísérlet 21. napján 192 madarat eutanizáltunk CO2-vel, és az újjászületést a nyaki elmozdulás megakadályozta. Körülbelül 2 perc elteltével a has kinyílt, és a csirke gyomor-bél traktusának egyes részeit kivágtuk 4 csirkéből tollanként. A mirigyes gyomor, a belek és a ceca összesített tartalmát öblítettük folyékony N2-ben, és -20 ° C-on tároltuk.

A kísérleti étrend és a béltartalom elemzése.

Ezeket az elemzéseket a Hivatalos Analitikai Kémikusok Szövetségének módszerei szerint (34) hajtották végre, és kiegészítõ adatokként közzéteszik a PNAS honlapján, a www.pnas.org oldalon.

Statisztikai elemzések.

Az ANOVA-t a sas szoftver General Linear Models eljárásával (35) végeztük, és a kezelési eszközöket összehasonlítottuk a legkevésbé szignifikáns különbséggel. A különbségeket szignifikánsnak tekintették a Pd-glükánoknál, az arabinoxilánoknál és a cellulóznál. A kukorica pentozánokat tartalmaz (1,3–1,4) -β-glükánok helyett. Az árpa-étrendben lényegesen több rost extrahálható semleges és savas detergenssel, mint a kukorica-étrendben, és a különbséget hangsúlyozta a maláta hozzáadása. A hőstabil (1,3–1,4) -β-glükanáz mennyisége a transzgénikus vonal malátájában 4,28 μg⋅g –1 oldható fehérje volt, ami 0,47 μg⋅g –1 oldható fehérje tartalmat eredményezett az árpa diétában a transzgén malátával. A Golden Promise malátát tartalmazó étrendben nem észleltek hőstabil β-glükanázt.

Súlygyarapodás, takarmányfogyasztás, takarmányhatékonyság és száraz ürülék.

6,2% transzgén maláta hozzáadása az árpa étrendhez súlygyarapodást jelent, amely egyenértékű a jelenleg alkalmazott kukorica diétával. TL, transzgénikus vonal; Háziorvos, Arany ígéret.

A tapadó ragacsos ürülékkel rendelkező csirkék száma.

A 2. ábra oszlopdiagramjában bemutatjuk a lefelé tapadó ragacsos ürülékkel rendelkező csirkék számának elemzését (5. ábra, kiegészítő adatok) egy adott étrenden lévő 60 között. ragacsos ürülék volt a 14., illetve a 17. napon. Az árpa-diétánként étrendenként 15 és 17 csirke között ragadós ürülék tapadt a kloakarégiójukra a vizsgálat során. A padlóbontások megerősítették, hogy az árpa-étrendet tápláló kutyákban a csirkék kiterjedt ragacsos ürülékkel rendelkeznek. A lefelé tapadó ürülék jelentős csökkenése figyelhető meg, ha az árpa diétát normál árpamalátával egészítik ki. A transzgénikus malátaddíciós árpa 2: 7 gyakoriságra csökkentette az étrendben egy adott napon a 60 csirkében a ragacsos ürülék előfordulását. A hozzáadott transzgén maláta mennyiségének további növekedése valószínűleg teljesen kiküszöböli a nemkívánatos ürülékeket.

A tapadó ragacsos ürülékkel rendelkező csirkék száma.

Az (1,3–1,4) -β-glükánok tartalma diétákban, malátákban és a gyomor-bél traktusban.

Vízben oldódó (100 ° C) és oldhatatlan (1,3–1,4) -β-glükánok a gyomor-bél traktus különböző részein és csirkék ürülékében árpa-étrenden és hőstabil tartalmú transzgenikus malátát tartalmazó étrenden (1,3–1,4) -β-glükanáz.

Hőstabil (1,3–1,4) -α-glükanáz elemzése a gyomor-bél traktusban és az ürülékben.

Hőstabil (1,3–1,4) -β-glükanáz azonosítása specifikus antitestekkel a gyomor-bél traktus különböző részein és az ürülék Western-blotokkal. Az E. coliban expresszált enzim nincs glikozilezve (Mr = 24 000). Az árpában expresszált enzim glikozilezett (Mr = 28 000), ezért alacsonyabb az elektroforetikus mobilitása.

A Digesta viszkozitása a gyomor-bél traktusban.

A mérések megerősítik, hogy az árpa-étrend magasabb viszkozitást eredményez a mirigy gyomrában és a belekben, mint a kukorica-étrend (2. táblázat). Árpa vagy transzgén maláta hozzáadása csökkenti az emésztőrendszer ezen két részének viszkozitását. A kukorica diéta magasabb vakbéltartalom viszkozitást eredményezett, mint az árpa diéta és az árpa diéta, normál maláta hozzáadásával. A transzgén maláta növelte a vakbéltartalom viszkozitását a kukorica étrendjénél megfigyeltnél és azon felül.

A különböző étrendekkel táplált csirkék emésztőrendszerének tartalmának viszkozitása

Vita

Jelentős következtetés vonható le a jelenlegi csirkekísérlet eredményeiből. Lehetséges egyedi rekombináns enzim bevezetése a csirkék gyomor-bél traktusának különböző részeibe transzgén malátával és következésképpen transzgén érett gabonával a választott étrenddel együtt. Így meg lehetett állapítani, hogy a rekombináns (1,3–1,4) -β-glükanáz mennyi halmozódott fel aktív formában az emésztőrendszer különféle részeiben, és milyen hatással volt az anyagcserére (1,3–1,4, 4) -β-glükánok. Hasonlóképpen lehetőség nyílik a hibrid enzimet expresszáló transzgén szemcsék hatásainak tanulmányozására, amelyek kombinálják a hőstabil (1,3–1,4) -β-glükanáz és Erwinia carotovora celluláz katalitikus aktivitását. Kimutatták, hogy ez a multienzim depolimerizálja az egymást követő (1,4) -β-kapcsolt glükóz egységeket, amelyek az (1,3–1,4) -β-glükanáz vegyes kapcsolt árpa β-glükánra gyakorolt hatásából származnak (50). . Az arabinoxilánok fontosságát a csirke étrendben megfelelően meg lehet vizsgálni a rekombinánsan expresszált hibrid enzimmel, amely egyesíti az (1,3–1,4) -β-glükanáz aktivitását az (1,4) -β-xilanáz aktivitásával (51).

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Frank E. Hagie úrnak és Dr. H. Horvathnak a hasznos tanácsokat és az erkölcsi támogatást. Hálásan köszönjük a Washingtoni Technológiai Központ (Grant No. 99 B-1) és az Applied Phytologics (Sacramento, Kalifornia) pénzügyi támogatását. Ez a CSS 010906 tudományos cikk, a Washingtoni Állami Egyetem Mezőgazdasági és Háztartás-kutatási Központjának Pullman-ból (WA).