Továbbfejlesztett i.p. gyógyszeradagolás bioadhéziós nanorészecskékkel

  • Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
  • Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
  • Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
  • Levelezés céljából: [email protected]

Szerkesztette: Joseph M. DeSimone, Észak-Karolinai Egyetem, Chapel Hill and Carbon, Chapel Hill, NC, és jóváhagyta 2016. augusztus 19-én (2015. november 22-én kapott felülvizsgálatra)

IR-780 jodid

Jelentőség

A platina-alapú kemoterápiákkal és a paklitaxellel szembeni rezisztencia mind a magas fokú petefészek-, mind az endometrium rákos megbetegedéseknél megismétlődik. A paclitaxel-rezisztencia összefüggésben van a III. Osztályú β-tubulin túlzott expressziójával, amely az epotilonok, mikrotubulus-stabilizáló szerek preferenciális célpontja. Az Epothilone B (EB) sokszor hatékonyabb, mint a paklitaxel, de a klinikai alkalmazást korlátozzák a mellékhatások. A mellékhatások csökkentése érdekében az EB-t bioadhéziós nanorészecskékbe (BNP) kapszuláztuk, azzal az indoklással, hogy az epotilon B-vel (EB/BNP) töltött bioadhezív nanorészecskék kölcsönhatásba lépnek a hasi szövetekkel, és fokozatosan felszabadítják az EB-t a peritonealis rákimplantátumok közelében, így fenntartva az EB-koncentrációt a hatás helye és a szisztémás expozíció és a toxicitás korlátozása. Kísérleteink az EB/BNP-k magasabb terápiás aktivitását és korlátozott toxicitását mutatják az EB-vel vagy hordozó nélküli EB-vel megrakott nem tapadó nanorészecskékhez képest.

Absztrakt

Az i.p. Kemoterápia beadása petefészek- és méhszérum-karcinómában szenvedő betegeknél biológiailag lebontható nanorészecskékkel nagyon hatékony módszert jelenthet a peritonealis carcinomatosis elnyomására. A kemoterápiás szerekkel megrakott nanorészecskék hatékonyságát azonban jelenleg gátolja a nyirokelvezetéssel történő gyors kitisztulás. Itt megmutatjuk, hogy a bioadhéziós nanorészecskék (BNP) egyedülálló összetétele kölcsönhatásba léphet a hasüreg mezoteliális sejtjeivel, és jelentősen meghosszabbíthatja a nanorészecskék visszatartását a peritonealis térben. Erős kemoterápiás szerrel [epothilone B (EB)] töltött BNP-k szignifikánsan alacsonyabb szisztémás toxicitást és magasabb terápiás hatékonyságot mutattak i.p. kemoterápiára rezisztens méh serózus carcinoma eredetű xenograftok összehasonlítva az EB-vel töltött szabad EB és nem BNP-kkel.

A magas fokú petefészek és a méh szerous carcinoma (USC) biológiailag agresszív daganatok, amelyek általában a hasüregbe terjednek, a hasi és kismedencei hashártya mentén terjednek, és peritoneális áttéteket eredményeznek. Bár ezek a daganatok gyakran reagálnak a kezdeti citoreduktív műtétre és a platina-paclitaxel kemoterápiára, a legtöbb beteg kiújul, és végül a kemoterápiára rezisztens betegség progressziójában hal meg (1).

A lebontható polimer nanorészecskéknek számos potenciális előnyük van a mikrorészecskékkel és a hidrogélekkel szemben a rákterápiában (12 ⇓ ⇓ ⇓ –16). A nanorészecskék (~ 100 nm) kicsiek a mikrorészecskékhez képest (~ 10–100 µm), ezért egyenletesebben kell eloszlaniuk a hashártyán. Ezenkívül a nanorészecskék elég kicsiek ahhoz, hogy a tumorsejtek be tudják internalizálni őket (17, 18), lehetővé téve számukra a kapszulázott gyógyszerek felszabadítását a biológiai cél közelében, amely gyakran a sejtmagban van. Bár számos tanulmány kimutatta, hogy a nanorészecskék ígéretes hordozók a kemoterápiás szerek bejuttatására preklinikai in vivo modellekben, a nanorészecskék alkalmazása i.p. a szállítást továbbra is akadályozza a hasüregből való gyors kiürülésük, elsősorban a nyirokelvezetés következtében (19).

Az NNP-kből származó BNP-k átalakítását, valamint az NNP-k és BNP-k sorsát i.p. szállítás. A BNP-k átalakíthatók NNP-kből NaIO4 kezeléssel. Után i.p. szállítás, a (bal) NNP-ket nyirokelvezetés útján tisztítják, de a (jobb) BNP-ket a peritoneális üregben tartják, bioadhéziós tulajdonságuk miatt.

Eredmények

(A) DiD/NNP-k, (B) DiD/BNP és (C) DiD/NNP-R (DiD/NNP-k NaBH4-kezeléssel csökkentett DiD/NNP-k) TEM képei. (Méretjelek: 200 nm.) (D) Az aldehidek koncentrációja a BNP-ken az NaBH4-gyel végzett inkubációs idő függvényében. (E) A BNP-k visszatartása a (polil-lizin) bevonatú lemezeken az NNP-khez és az NNP-R-ekhez képest. * P Tekintse meg ezt a táblázatot:

  • Soron belüli megtekintése
  • Felugró ablak megtekintése

Nanorészecskeméret-mérések

BNP-k, NNP-R-ek és NNP-k illusztrációja. (A) A BNP-k átalakítása NNP-R-ekké NaBH4-kezeléssel. (B) Az NNP-k felületi szerkezete.

(A) Az IR-780 jodid festék in vitro visszatartása NNP-kben, i.p. folyadék 10 nap alatt. Az adatok átlagként ± SD (n = 3) vannak feltüntetve. (B) A (bal) IR-780 jodid/NNP és (jobb oldali) IR-780 jodid/BNP visszatartása élő képalkotással 10 nappal i.p. szállítás.

Az (A) IR-780/NNP és (B) IR-780/BNP TEM képei. (Méretarány: 200 nm.)

A BNP-k eloszlása ​​a peritoneális üregben, amelyet IR fluoreszcencia képalkotással szemléltetünk. (A) Kontroll (injektálatlan) egér és (Jobb) egér élő képalkotása 18 órával 1 mg IR-780/BNP injekció után. IR-780 jodid BNP-kkel (B) injektált egér (balra) kontroll-egér és (Jobb) egér IR-fluoreszcens képalkotása (B) előtt és (C), miután a peritoneális üregben lévő összes szervet eltávolították.

Az EB/BNP jellemzése. (A) EB/BNP és (B) EB/NNP TEM képei. (Méretjelző oszlopok: 200 nm.) (C) Az EB felszabadul az EB/BNP-kből és az EB/NNP-kből 24 órás PBS-ben történő inkubálás alatt. Az adatok átlagként ± SD (n = 4) vannak feltüntetve. (D) Az USC sejtek életképessége 3 napig tartó szabad EB, EB/NNP és EB/BNP inkubálás után. Az adatokat átlag ± SD (n = 8) formájában mutatjuk be. (E) Az USC sejtek életképessége vak BNP-kkel és NNP-kkel 3 napig tartó inkubálás után. Az adatokat átlag ± SD (n = 8) formájában mutatjuk be. (F) EB retenció a peritoneális üregben i.p. ingyenes EB, EB/NNP és EB/BNP adminisztrációja. Az adatok átlagként ± SD (n = 3).

Az üres BNP-k hatása több sejtvonalra. (A) A HeLa és az emberi köldökvénás endothelsejtek (HUVEC) életképessége vak BNP-kkel és NNP-kkel 3 napig tartó inkubálás után. Az adatokat átlag ± SD (n = 8) formájában mutatjuk be. (B) Több sejtvonal életképessége vak BNP-kkel és NNP-kkel végzett inkubálás után 3 napig. Az adatok átlagként ± SD (n = 8).

Hipotézisünk az, hogy az EB/BNP-k megvédhetik a peritoneumot a lebegő rákos sejtek tapadásától a peritonealis folyadékban; ezt a védelmet BNP retenció biztosítja a fehérjében gazdag hashártya felületeken, és képesek lokálisan juttatni az EB-t a tapadó sejtek kezelésére (1. ábra). Szimulálni azt a mikrokörnyezetet, amelyben a nanorészecskék várhatóan i.p. injekcióval értékeltük a felülettel immobilizált EB/BNP in vitro hatékonyságát az USC sejtek szaporodásának elnyomásában. Itt poli (l-lizinnel) bevont mikroszkóp tárgylemezeket használtunk, és szabad EB-vel, terheletlen nanorészecskékkel vagy EB-vel töltött nanorészecskékkel inkubáltuk őket (5A. Ábra). A tumorsejtek növekedésének szignifikáns szuppresszióját csak az EB/BNP-vel előkezelt tárgylemezekben figyeltük meg (5. ábra B és C). Sem a vak BNP, sem az EB/NNP kezeléssel kezelt felületeken nem tapasztaltuk a tumor növekedésének elnyomását. Bár ez egy in vitro modellrendszer, és hiányzik belőle az i.p. környezetben ezek az eredmények azt sugallják, hogy a BNP-k a tárgylemezek lizinnel bevont felületén maradnak meg biotapadó tulajdonságaik miatt, és hatékonyabban képesek EB-t lokálisan juttatni a szomszédos sejtekbe, mint bármely más nanorészecske-készítmény.

Az EB/BNP terápiás hatékonysága egereken, amelyek i.p. USC daganatok. (A) Kaplan – Meier túlélési görbék EB-kezelésekhez 2,5 mg/kg dózisban. (B) A toxicitás mértékeként az A szerint kezelt egereket hetente kétszer lemértük. (C) Kaplan – Meier túlélési görbék EB-kezelésekhez 0,5 mg/kg dózisban. (D) A C-ben kezelt egereket hetente kétszer lemértük. A és C esetében az x tengely jelzi a gyógyszerek első adagjától számított napok számát. B és D esetében az átlagos tömeg az első gyógyszeradagtól számított napok függvényében jelenik meg. A statisztikai elemzést a SI-módszerekben leírtak szerint végeztük.

Vita

Ha nincsenek gyógyszerekkel terhelve, a BNP-k nem mérgezőek. Sejtkultúrákban a BNP-k nem mutattak semmilyen citotoxicitást, még nagy koncentrációban sem (azaz legfeljebb 1 mg/ml-ig), és a BNP-vel kezelt egereknek (5 mg BNP ip injekciója hetente egyszer 5 hétig) nem volt bizonyíték a tömegre elvesztés vagy viselkedési változások. Ezenkívül az ismételt i.p. úgy tűnik, hogy a BNP-k injektálása nem vezetett olyan nem specifikus válaszokhoz, amelyek befolyásolták a tumor növekedését vagy az állatok egészségét (6. ábra). A BNP-k alacsony toxicitását több tényezőnek tulajdonítjuk. (i) Bár a szabad kis molekulatömegű aldehidek toxikusak lehetnek (32), a felszíni aldehidcsoportok kovalensen kapcsolódnak a BNP-khez, korlátozva azok diszperzióját. (ii) Várhatóan nagy tolerancia van az aldehidekkel szemben, mivel ezek széles körben jelen vannak az élelmiszerekben, illatanyagokban és metabolitokban, és hatékonyan méregteleníthetők az aldehid-dehidrogenáz enzimmel (33).

Fontos, hogy az EB/BNP-vel kezelt egerekben szignifikánsan javult a túlélés, összehasonlítva a kontrollokkal (Pl-lizin) bevont tárgylemezeket papírtollal (Abcam) öt blokkra osztottuk. Mindegyik blokkot egyenként hozzáadtuk 100 µl EB/BNP-vel (1 mg nanorészecske/1 ml és 0,025 mg EB/1 ml), EB/NNP-vel (1 mg nanorészecske/1 ml és 0,025 mg EB/1 ml), EB-vel (0,025 mg). vak BNP-ket (1 mg/ml) és PBS-t. 30 perces szobahőmérsékleten történő inkubálás után az egyes tárgylemezeket alaposan átmossuk sok PBS-sel, és egy 10 cm-es edénybe tesszük 20 ml, USC-sejteket tartalmazó tápközeggel 2,0 × 105/ml sűrűségben. 24 órán át 37 ° C-on végzett inkubálás után a táptalajt leszívjuk, és a tárgylemezeket négyszer 20 ml PBS-sel mossuk. A sejteket Hoechst-tel (magok esetében kék) és élő/elhalt foltokkal (zöld az élő sejteknél és piros az elhalt sejteknél; Thermo Fisher Scientific) festettük, majd fluoreszcens mikroszkóppal készítettük őket. A sejtek számát magokkal számoltuk ImageJ részecske-analízissel. Az életképességet úgy határoztuk meg, hogy a sejtsűrűséget a 100% -osan életképesnek tartott kontrollhoz normalizáltuk.

Vérkeringés.

Minden állatgondozást és vizsgálatot a Yale Egyetem Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága hagyott jóvá. Az összes nanorészecskét 0,2% DiD-vel töltöttük. Kilenc C57BL/6 egér (n = 7 csoportonként) 150 µl DiD-vel töltött nanorészecskéket (3 mg/ml PBS-oldatban) kapott farokvénás injekcióban. 5 perc, 15 perc, 30 perc, 1 óra, 2 óra, 4 óra, 8 óra, 24 óra, 48 óra és 72 óra múlva minden egyes egérből farokszaggatással 10–20 µL vért vettünk. A vért liofilizáltuk. A vér fluoreszcenciájának számszerűsítéséhez 100 μl DMSO-t és 1 ml acetonitrilt adtunk hozzá, és homogenizátorral homogenizáltuk. A homogenizált oldatot centrifugán centrifugán centrifugáljuk 15 680 x g sebességgel, majd 0,8 ml felülúszót eltávolítunk és hozzáadunk egy Eppendorf-csőbe. Az összes acetonitrilt SpeedVac-tal elpárologtattuk, és a DMSO-ban lévő festéket kvantifikáltuk fluoreszcencia mérésével 670 nm-en, gerjesztő hullámhosszal 644 nm-en, lemezolvasóval.

Az EB retenciós profilja a peritoneális üregben.

A C57BL/6 egereket (5-6 hetes; Charles River Laboratories) három csoportra osztottuk, csoportonként kilenc egérrel és egy csoportra három egérrel. A három egérből álló csoportot vivőanyag-kontrollként használtuk. Szabad EB [5 mg/ml törzsoldat 30 tömeg% PEG 400-ban, 0,5% Tween80, 5 tömeg% propilén-glikol, 64,5% (tömeg/tömeg) víz használat előtt a szükséges koncentrációra PBS-sel hígítva ], EB/NNP-k vagy EB/BNP-k 2,5 mg/kg effektív EB-dózissal ip három csoportban egerekbe injektáljuk. Minden időpontban (6 óra, 1 nap és 3 nap) minden csoportból három egeret és a három állatból egy egeret eutanizáltunk, és a peritoneális üregeket háromszor 5 ml acetonitrillel mostuk. Az acetonitril mintákat 10 percig 9300 x g-vel centrifugáltuk, és a felülúszót összegyűjtöttük. Az acetonitrilt bepároljuk, és a maradékot 0,5 ml EA-ban oldjuk. Örvénykeverés és 10 percig 9300 x g-vel végzett centrifugálás után az EA felülúszóját összegyűjtjük egy Eppendorf-csőben, és az EA-t bepároljuk. Metanolt (0,3 ml) adunk minden bepárolt mintához, és mindegyik mintát vortexeljük. 10 percig 9300 x g sebességgel végzett centrifugálás után a metanol felülúszóját összegyűjtöttük. Az EB koncentrációt HPLC-vel határoztuk meg C18 oszlopon, metanol: víz (7: 3) eleggyel, az UV detektorral 240 nm abszorbancára állítva.

Terápiás tanulmányok.

A BALB/c meztelen egereket (5-6 hetes; Charles River Laboratories) i.p. 1 × 106 USC-sejtet injektáltunk. 1 hét elteltével a gyógyszeres kezeléseket minden csoportban nyolc állattal kezdték meg. Egy kísérlet során három csoportot hasonlítottak össze: (i) PBS (400 µL), (ii) szabad EB-oldat [5 mg/ml törzsoldat 30 tömeg% PEG 400-ban, 0,5% Tween80, 5 tömeg%/tömeg% propilén-glikol, 64,5 tömeg% víz felhasználás előtt a szükséges koncentrációra PBS-sel hígítva; És (iii) EB/BNP-ket PBS-ben szuszpendálva (400 ul). Ebben a kísérletben a kezeléseket i.p. 2,5 mg/kg dózisú EB-vel minden héten 3 hétig. Egy másik kísérletben öt csoportot hasonlítottak össze: (i) PBS (400 µL), (ii) vak BNP-k PBS-ben szuszpendálva (400 µL), (iii) szabad EB-oldat (5 mg/ml törzsoldat 30% (tömeg/tömeg) tömeg) PEG 400, 0,5% Tween80, 5% (tömeg/tömeg) propilén-glikol, 64,5% (tömeg/tömeg) víz felhasználás előtt a szükséges koncentrációra PBS-sel hígítva; 400 µl], (iv) PBS-ben szuszpendált EB/NNP ( (400 µl) és (v) EB/BNP-ket PBS-ben szuszpendálva (400 µL). Ebben a kísérletben a kezeléseket ip-nként 0,5 mg/kg dózisú EB-vel adtuk be minden héten, 5 hétig.

Az egerek testtömegét hetente kétszer mértük. Az állatokat akkor eutanizálták, amikor a testsúlycsökkenés meghaladta a 20% -ot, vagy ha egyéb betegségre utaló jeleket, például légzési problémákat, evés és ivás hiányát, letargiát, súlyos bélelzáródást vagy rendellenes testtartást figyeltek meg. Az állatok túlélését Kaplan – Meier elemzéssel elemeztük. A statisztikai elemzést log rank teszt segítségével végeztük a GraphPad/Prism 6 eszközei segítségével.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Yukun Pannak, Tian Xu-nak, Yu Wu-nak, Yao Lu-nak és Rong Fan-nak a Yale Egyetemen, hogy laboratóriumukban hozzáférhettek a műszerekhez. Ezt a munkát az NIH Grants CA149128 és CA154460 támogatta.

Lábjegyzetek

  • ↵ 1 Kinek kell címezni a levelezést. E-mail: mark.saltzmanyale.edu .