Új funkció egy régi enzim számára: A NEP-hiányos egerek késői kezdetű elhízást fejlesztenek ki

Biokémiai Neurobiológiai Tagozat, Leibniz-Institut für Molekulare Pharmakologie, Berlin, Németország

Max-Rubner-Laboratorium, Deutsches Institut für Ernährungsforschung, Potsdam-Rehbrücke, Németország

Hull York Orvostudományi Egyetem, Hull York Orvostudományi Egyetem, Hull Egyetem, Hull, Egyesült Királyság, Kísérleti Kardiológiai Osztály, Kiválósági Klaszter Kardiopulmonális Rendszer, Justus-Liebig-Universität Giessen, Giessen, Németország

Kardiológiai tagozat, Charité-Universitätsmedizin, Berlin, Németország

Affiation Mivenion GmbH, Berlin, Németország

Hull York Orvostudományi Egyetem, Hull York Orvostudományi Egyetem, Hull Egyetem, Hull, Egyesült Királyság, Kísérleti Kardiológiai Tanszék, Kiválósági Klaszter-Pulmonáris Rendszer, Justus-Liebig-Universität Giessen, Giessen, Németország

Matthias Becker,
Wolf-Eberhard Siems,
Reinhart Kluge,
Florian Gembardt,
Heinz-Peter Schultheiss,
Michael Schirner,
Thomas Walther

Ábrák

Absztrakt

Háttér

Az Egészségügyi Világszervezet (WHO) szerint az elhízás világjárványa van, körülbelül 300 millió ember elhízott. Jellemzően az emberi elhízásnak poligenetikus oksági oka van. A semleges endopeptidázt (NEP), más néven neprilizint, számos aktív peptid hormon metabolizmusának egyik kulcsfontosságú enzimének tekintik.

Módszertan/fő megállapítások

A NEP-hiányos egerekben előforduló esetleges megfigyelés a késői, túlzott testtömeg-növekedés volt, kizárólag a zsírszövet mindenütt jelenlévő felhalmozódása miatt. Az emberi poligenetikus elhízásnak megfelelően az egereket a lipid-anyagcsere deregulációjával, magasabb vércukorszinttel, csökkent glükóz toleranciával jellemezték. A NEP kulcsfontosságú szerepét a testtömeg meghatározásában megerősítette a NEP inhibitor kandoxatril alkalmazása vad típusú egerekben, amelyek megnövelték a testsúlyt a megnövekedett táplálékbevitel miatt. Ez egy perifériás és nem központi NEP-művelet az étvágyszabályozó kapcsolón, mivel a kandoxatril nem képes átjutni a vér-agy gáton. Kimutattuk továbbá, hogy a NEP gátlása cachexiás egerekben késlelteti a gyors testsúlycsökkenést. Így a NEP-aktivitás hiánya genetikailag vagy farmakológiailag a testzsír növekedéséhez vezet.

Következtetések/jelentőség

Jelen tanulmányunkban a NEP-t meghatároztuk az elhízás kialakulásának kulcsszereplőjeként. A NEP-hiányos egerek normokalorikus étrend alatt 6–7 hónapos korban kezdnek elhízni, és így ideális modellt jelentenek a tipikus, későn megjelenő emberi elhízáshoz. Ezért a leírt elhízási modell ideális eszköz a pandémiás elhízás kialakulásának, molekuláris mechanizmusainak, diagnózisának és terápiájának kutatásához.

Idézet: Becker M, Siems W-E, Kluge R, Gembardt F, Schultheiss H-P, Schirner M és mtsai. (2010) Új funkció egy régi enzim számára: A NEP-hiányos egerek késői elhízást fejlesztenek ki. PLoS ONE 5 (9): e12793. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012793

Szerkesztő: Alessandro Bartolomucci, Minnesotai Egyetem, Amerikai Egyesült Államok

Fogadott: 2010. március 26 .; Elfogadott: 2010. augusztus 18 .; Közzétett: 2010. szeptember 16

Finanszírozás: Ezt a munkát a Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) támogatása (SI-483/8/1-2 és -3, valamint a WA1441/18/1-2 és -3) támogatta. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: Az MS fizetését a Mivenion GmbH (Berlin, Németország) fizeti. Ez nem változtatja meg a szerzők betartását az adatok és anyagok megosztására vonatkozó PLoS ONE összes politikájához.

Bevezetés

Az emberi elhízás egy nagyon súlyos egészségügyi rendellenesség, amely poligenetikus hajlamú, és drámai egymást követő betegségekkel jár (pl. Magas vérnyomás, fokozott szívizominfarktus, cukorbetegség és ízületi köszvény). Az elmúlt évtizedekben a túlsúly [BMI 25–30] és az elhízás [a BMI meghaladja a 30-at] járványgá vált az ipari országokban [1], [2]. Az Egyesült Királyság 2006-os statisztikái szerint a felnőttek 38% -át túlsúlyosnak, 24% -át pedig elhízottnak sorolták. A 2–15 éves gyermekek 30% -a is túlsúlyosnak vagy elhízottnak minősült. Az iparosodott nemzetek közegészségügyi költségvetésének több mint 5% -át elhízás kezelésére fordítják [3]. Az elhízás orvosi kezelése azonban eddig csalódást okozott, a legnagyobb hatást a bariatrikus műtét jelentette. Következésképpen kritikus szükség van új és innovatív stratégiákra a probléma kezelésére, és a molekuláris célzás az intenzív orvosbiológiai kutatások középpontjában áll. Az emberi elhízásnak poligenetikus oka van [4]. Ebben az összefüggésben a géntechnológiával módosított állatok, különösen több kiütéses egér érdekli leginkább.

Eredmények és vita

NEP-hiányos egerek és vad típusú kontrolljaik felhasználásával patofiziológiai és biokémiai elemzéshez [15] - [17] megfigyeltük, hogy a genetikai NEP-delécióval rendelkező egerekre jellemző a testtömeg-növekedés, amely csak mindkét idős állatban nyilvánvalóvá vált nemek (1a. Ábra). Ennek a hatásnak az első vizsgálata a zsírszövet jelentős felhalmozódását azonosította, amely nem korlátozódott a hasi zsírra (1b és c ábra). A testtömeg egy éven át történő részletes feljegyzése jelentős súlykülönbségeket azonosított mind a nők, mind a férfiak esetében, kb. 7 hónap (Az 1d. És e) a testtömeg-növekedés folytatása miatt, míg a vad típusok elérték a platót. Az emberre extrapolálva ez az időtartam egy egér életében kb. 35–40 év, amikor sok ember túlsúlyossá válik. Annak megvizsgálására, hogy a testtömeg-növekedés összefüggésben van-e a megnövekedett táplálékfelvétellel, példaértékűen mértük nőknél a táplálékfelvételt két különböző időpontban. Amikor mindkét genotípus közötti különbség először (a 7. hónap körül) és az idősebb állatokban (> 11 hónap) jelentkezett, a NEP-hiányos egerek lényegesen többet ettek, mint az életkoruknak megfelelő vad típusú kontrollok (1f. Ábra).

(a) Egy NEP-knockout (NEP -/-) egér összehasonlítása egy életkornak megfelelő vad típusú állattal (NEP +/+). (b) A mellkas és a szív steatosisát egy NEP-knockout egérben. (c) A hasi zsír felhalmozódása egy NEP-hiányos állatnál. A testtömeg életkorfüggő fejlődése (d) nőstények és (e) hímek. Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be. Ahol nem látható, a hibasávok a szimbólumok méretein belül helyezkednek el. Átlag csoportonként 22 egér. Genotípus hatások *** P 11 hónapos nőstény NEP-knockout (NEP -/-) egerek az életkornak megfelelő vad típusú állatokhoz (NEP +/+) képest, * P 2. ábra. Testösszetétel és étrendtől függő súlyfejlődés NEP-hiányos egerekben.

Az alacsony zsírtartalmú étrenddel etetett egerek etetésének NMR-monitorozott hatása az életkorfüggő testösszetételre (a) izomtömegek, (b) szabad testfolyadék, (c) zsírtömeg, és (d) testtömegenkénti zsírtömegek. Hatásai (e) alacsony zsírtartalmú és (f) magas zsírtartalmú étrend a testtömeg alakulására. Az adatokat csoportonként legalább 10 állat átlagaként ± SEM-ként adjuk meg. Kétirányú ANOVA ** P 3. ábra Biokémiai paraméterek elhízott NEP-hiányos egerekben alacsony zsírtartalmú étrend alatt.

(a) Szérum trigliceridek egyéves NEP-hiányos állatokban (-/-) és életkoruknak megfelelő vad típusú kontrollok (+/+). Student t-tesztje *** P 2 0,92 [Pearson-korreláció]). (d) A bázikus glükózértékek összehasonlítása (glükóztolerancia-teszt előtt) NEP-knockout egerek plazmájában vad típusú állatokkal. Student t-teszt ** P 4. ábra: A kandoxatril (Pfizer, UK 79 300) hatása a testtömeg fejlődésére.

(a) Testtömeg alakulása hím C57BL/6 egerekben, 6 hónapos kortól kezdve, standard étrenddel etetve, placebóval (folytonos vonal és négyzetek) vagy a NEP inhibitor kandoxatril [fogyasztás 200 mg/kg/nap] kiegészítéssel (törött vonal) és háromszögek). A 0. kezelés napja a kezelés első napja. A kezelés hatása *** P 30% a 12. és 23. nap között). A kandoxatrillel végzett kezelés a tumor beoltása utáni 9. naptól lényegesen kevésbé kifejezett testtömeg-csökkenést eredményezett a kontroll kezelt egerekhez képest (4e. Ábra). A primer tumor növekedését, valamint a máj, a lép és a vese tömegét a tumor beültetését követő 23. napon nem befolyásolta a NEP gátlás.

Kritikus szükség van az elhízás új kezelési stratégiáira, különösen mivel a jelenlegi orális orvosi kezelésnek alig volt hatása. A molekuláris célzás lehet ilyen megközelítés. Megállapítottuk, hogy a NEP döntő szerepet játszik az élelmiszer-bevitelben és a zsír felhalmozásában. Mivel az elhízás kialakulása a NEP-hiányos egereknél 6–7 hónapnál kezdődik, ez ideális modell a tipikus, későn megjelenő emberi elhízáshoz. Ellentétben az elhízott állatokban az elhízott fenotípus kialakulásához kulcsfontosságúnak leírt egyes gének nagy számával, a NEP teljesíti a kritériumokat, hogy klasszikus célpont legyen az elhízásban, poligenetikus okozati összefüggéssel. Ez a metallopeptidáz számos peptidhormont hidrolizál, és széles körben eloszlik a testben.

Más elhízási modellekkel ellentétben állataink normokalorikus körülmények között elhízott fenotípust fejlesztenek ki. Érdekes, hogy magas zsírtartalmú étrend esetén a két genotípus közötti jelentős különbség csökken, mert a vad típusú egerek is elhíznak. Ez a NEP-hiányos állatokat még relevánsabb elhízási modellgé teszi, mivel egy olyan klasszikus helyzetet tükröz, amikor a normál (akár egészséges) minőségű ételeket fogyasztó középkorúak túlsúlyossá válnak, miközben az étrendjük változatlan. Ezenkívül a NEP-hiányos állatoknál az elhízás kialakulásakor lipid- és glükóz-rendellenességek alakulnak ki, hasonlóan a 2-es típusú cukorbetegséghez.

Erős érv, miszerint a NEP az élelmiszer-bevitel ellenőrzésében középpontba kerül, a megfordítási kísérlet adatai. Ha a NEP aktivitás csökkenése stimulálja az élelmiszer-bevitelt, annak farmakológiai gátlásának meg kell akadályoznia a testtömeg hatalmas csökkenését a kóros testtömeg-csökkenés modelljében. A hasnyálmirigy-karcinómát (PSN-1) hordozó egereken kimutattuk, hogy a specifikus NEP-gátlás a kísérlet leállításáig jelentősen csökkenti a testsúly csökkenését. Bár az olyan betegségeknél, mint az anorexia nervosa, a pszichológiai hatás lehet a domináns, további kísérletekkel ki kell értékelni, hogy a NEP gátlása vagy a NEP-re irányuló origének szignalizációja csökkentheti-e a testtömeg-csökkenést olyan betegségek esetén, amelyek kóros testtömeg-csökkenéssel.

Mivel a NEP farmakológiai növekedése nehéz lehet, a NEP aktivitása által befolyásolt orexigén peptidek (és receptoraik) azonosítása ígéretes célzott megközelítés lehet a testtömeg csökkentése az elhízás kezelésében.

Anyagok és metódusok

Állatok

Hím és nőstény NEP-knockout egereket használtunk, amelyeket eredetileg Lu et al. [33] és a T.W. a Charitéban, a campus Benjamin Franklin (CBF), Berlin, Németország. A kísérleti állatokat olyan szülőktől tenyésztették, amelyek F2 voltak hemizigóta párosítás után és C57Bl/6N háttérrel rendelkeznek. Az állatokat nemek szerint elválasztott almokba helyeztük 22 ± 1 ° C-on, 12/12 órás világos/sötét ciklusban, korlátlan hozzáféréssel az élelemhez és a vízhez. A fiziológiai paraméterek rögzítését 9:00 és 13:00 óra között végeztük.

Felnőtt egereken végzett kísérleteket az Egyesült Államok Nemzeti Intézetének Egészségügyi Intézete által kiadott, a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutató (NIH 85–23. Kiadvány, felülvizsgált 1996), az Erasmus Állatgondozási Bizottságának előírásai szerint hajtották végre. MC és a kísérleti állatok németországi felhasználásáról szóló szövetségi törvény, amelyet a helyi hatóságok jóváhagytak (Landesamt für Gesundheit und Soziales des Landes Berlin).

Fogyókúrák

Valamennyi állat normál vizet kapott al libitumban és a következő típusú ételeket:

I. étel: Normál étel; „Ssniff SM/R/N-H (10 mm)”, (fűtőérték: 12,2 MJ/kg) ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Németország, az 1. és 4. ábrán leírt kísérletekhez.

II. Élelmiszer: („Alacsony zsírtartalmú étrend”): „Altromin Standard-1324”; Altromin (fűtőérték: 12,5 MJ/kg; ebben az étrendben az átalakítható energia 13,6% -a zsírtartalomnak tulajdonítható), amelyet a 2a – e.

III. Élelmiszer: („Nagy zsírtartalmú étrend”): „Altromin C1057” (fűtőérték: 14,6 MJ/kg; ebben az étrendben az átalakítható energia 35,0% -a zsírtartalomnak tulajdonítható), a 2f. Ábrán leírt kísérletekhez.

IV. Élelmiszer: A szokásos élelmiszereket (lásd fentebb az I. ételeket) hidegen őrölték, kiegészítve a gyakran használt, jól tolerálható, orálisan aktív és íztelen NEP-gátló kandoxatrillel (Pfizer) [34], [35], keverve és injektálva nyomás alatt (2). g/kg); ez kb. napi fogyasztásnak felel meg. 200 mg/kg/nap. A kandoxatrilt tartalmazó élelmiszerek gyártását a gyártó szokta elvégezni (ssniff/Németország). A használt kontroll ételt ugyanazon a napon készítette ugyanaz a vezetés; a 4. ábrán leírt kísérletekhez használják.

NMR elemzés

A testösszetételt NMR-spektroszkópiával mértük (Minispec MQ10 NMR Analyzer [Bruker, Billerica, Massachusetts/USA; www.minispec.com] nőstény egerekben az Echo Medical Systems [Houston, Texas, USA] szoftverével).

Légzéskamra és indirekt kalorimetria

Az energiafogyasztást és a metabolikus üzemanyag oxidációját oxigénfogyasztásból, szén-dioxid-termelésből és a vizeletből történő nitrogén kiválasztódásból becsülték a nyílt körű anyagcsere-ketrecekben, Aust és munkatársai által korábban leírtak szerint. [36]. A levegőben lévő oxigénkoncentrációt paramágnesesen, a szén-dioxid-koncentrációt infravörös abszorpcióval mértük. Ezekből az értékekből számoltuk ki a légzési hányadost (RQ). A paramétereket a Braun & Hartmann (Minden, Németország) berendezésével szabályoztuk, és online tároltuk minden egyes ketrechez (egér): Légáram; egerek alapértéke: 30 Nl/h légkompresszor által; Tényleges O2-tartalom (térfogat%); Tényleges CO2-termelés (ppm); Tényleges légnyomás (hPa).

A közvetett kalorimetriát egyetlen házban tartott egerekkel végeztük, házuk ketrecében szilárd hermetikusan lezárt fedéllel.

Biokémiai elemzések

A szérum leptinszinteket ELISA módszerrel mértük (egér leptin immunoassay kit Quantikine, MOB00, R&D Systems Inc., Minneapolis, USA). A lipideket a Cholestech LDX berendezéssel (Cholesttech Corp., Hayward, Kalifornia, USA) számszerűsítettük a gyártó kézikönyvei szerint. Minden állat 12 hónapos volt.

Glükóz tolerancia teszt

12 hónapos korban nyolc nőstény és 9 hím vad típusú, valamint 10 nőstény és 9 hím NEP-knockout egeret vizsgáltak szájon át történő glükóz-tolerancia szempontjából. A 8 órás éhgyomri vércukorszintet a teszt előtt teszteltük (a reggel 8-tól kezdődően). Szájon át alkalmazott glükózoldat (1 mg/g testtömeg) után a vércukorszintet 30 perc, 60 perc, 90 perc és 120 perc után regisztráltuk. A nyomozó elvakult a genotípusoktól.

NEP aktivitás mérése

A NEP aktivitást Winkler és munkatársai szerint mértük. [37] nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) alkalmazásával a [D-Ala2, Leu5] enkefalin (DALEK, 100 µM) lebomlásának és a Tyr – D-Ala – Gly párhuzamos képződésének monitorozására az aminopeptidáz inhibitor bestatin (10) jelenlétében. -4 M) és az angiotenzin-konvertáló enzim inhibitor lisinopril (10-6 M). A reakció specifitását 10-5 M candoxatrilat (Pfizer, UK73,967) alkalmazásával jellemeztük. Az összes mintában kétszer mértük a semleges endopeptidáz aktivitást.

Cachexia

Férfi NMRI: nu/nu 6 hónapos korú egereket (n = 16) szubkután beültetünk a humán PSN-1 hasnyálmirigy-karcinómába, és egyformán egy kontroll (standard táplálék) és kezelési csoportba (standard táplálék + kandoxatril; Food IV) osztjuk be. A szubkután daganat növekedését és az állatok tömegét naponta ellenőriztük. A kezelést a tumor beoltása után az 1. napon kezdték meg. A kezelést a tumor beültetése (a kísérlet vége) után a 23. napig folyamatosan végeztük, és a kutatót megvakítottuk a kísérleti csoportoktól. A kísérlet végén megmértük a máj, a lép, a vese és a tumor súlyát.

Rádió-telemetriai kísérlet

Hét NEP-hiányos egér és 7, életkornak megfelelő vad típusú kontroll kapott telemetriás implantátumot (TA11-PA20; Data Sciences International, St Paul, Minnesota, USA) a nyaki artériában, Gross et al. [38]. Röviden: a műszer nulla eltolását mértük, és az egységet beültetés előtt 0,9% NaCl-ban áztattuk. Az állatokat ketamin (10 mg/kg) és xilazin (5 mg/kg) keverékével altattuk. Az adókatétert a bal nyaki artérián keresztül az aortaívbe helyeztük. Ezt követően a katétert a helyére lezártuk. A bél gondos cseréje után az adó testét a hasfalra rögzítették, és az üreget varratokkal lezárták. Az összes egeret egyedi ketrecekben helyeztük el egy hangtompított helyiségben. A műtét után egy héttel az állatokat 3 napig ellenőriztük kontroll étrendben.

Adatok elemzése

Az adatokat Student t teszttel vagy ANOVA-val elemeztük, adott esetben ismételt mérésekkel.