A GPR3 ​​receptor nélküli egerek késői megjelenésű elhízott fenotípust mutatnak a barna zsírszövet termogén funkciójának károsodása miatt

Tárgyak

Absztrakt

Váratlan kapcsolatról számolunk be az öregedés, a termogenezis és a súlygyarapodás között az árva G fehérjéhez kapcsolt GPR3 ​​receptoron keresztül. Azoknak az egereknek, akiknek GPR3 ​​hiánya volt, és normál chow-n tartották, az első 5 hónapjukban hasonló volt a testtömeg, de ezt követően lényegesen nagyobb súlyra tettek szert, és csökkent az összes energiafelhasználás és alacsonyabb a testhőmérséklet. 5 hónapos korára a GPR3 ​​KO egerek termogén génexpressziója alacsonyabb és a protein 1 fehérje leválasztása alacsonyabb volt, és a WT alomtársakhoz viszonyítva csökkent intenzitású glükózfelvételt mutatott az interscapularis barna zsírszövetben (iBAT). Ezek a molekuláris eltérések a GPR3 ​​KO egerek iBAT-jában megelőzték a testtömeg és a testhőmérséklet mérhető különbségeit környezeti körülmények között, de a termikus homeosztázis fenntartásának sikertelenségéhez kapcsolódtak az akut hidegfertőzés során. Ugyanakkor ugyanaz a hidegfertőzés a WT egerek iBAT-ban a Gpr3 expressziójának 17-szeres növekedését okozta. Úgy tűnik tehát, hogy a GPR3 ​​kulcsszerepet játszik az iBAT termogén válaszában, és új terápiás célpontot jelenthet az életkorral összefüggő elhízásban.

Bevezetés

Az elhízás jelentős globális egészségügyi terhet jelent, amely már nem korlátozódik a fejlett országokra. Egy nemrégiben készült jelentés becslése szerint a fiatalok és felnőttek világszerte csaknem egyharmada túlsúlyos vagy elhízott 1, és ez a rész az előrejelzések szerint tovább növekszik az öregedő társadalom eredményeként 2,3,4,5,6. 2050-re az Egyesült Államokban a 65 év feletti felnőttek száma várhatóan meghaladja a 40,2 millióról 88,5 millióra 7 .

A bioenergetikai utak megértésében tett általános figyelemre méltó előrelépés ellenére továbbra sem megfelelő a kérdés, hogy az öregedés miért hajlamos a súlygyarapodásra. Felnőtt vagy későn megjelenő elhízást figyeltek meg azoknál az egereknél, akiknél hiányzott a trombocita-aktiváló faktor 8, a 3-as típusú adenilil-cikláz 9, az inzulinreceptor a barna zsírszövetben 10, az emberi renin gén transzgenikus egerekben 11, vagy kísérletileg kiváltották petefészek-eltávolított fiatal nőstény patkányokban . Az életkorral összefüggő súlygyarapodás következetesen összefügg a termogenezis károsodásával az interscapularis barna zsírszövet (iBAT) 8,13,14 programozott funkcióvesztése miatt, amely a felesleges energiát a viscerális és a szubkután zsírraktárakba helyezi tárolásra 12,14,15 . Mégis, az iBAT működését szabályozó életkorfüggő tényezők továbbra sem ismertek.

A GPR3 ​​a G-fehérjéhez kapcsolt receptor (GPCR) szupercsalád A osztályának árva tagja, a klaszter homológja, amely magában foglalja a GPR6-ot és a GPR12-t, amelynek natív ligandumai még nem ismertek. 16,17,18,19,20. A közelmúltban egy szintetikus kis molekulát azonosítottak a humán GPR3 ​​21,22 specifikus helyettesítő agonistájaként. A GPR3 ​​nagymértékben expresszálódik petesejtekben, ahol összefüggésbe hozható a petesejtek meiotikus leállításának 23,24,25,26,27,28,29,30 fenntartásával és a petefészkek elégtelenségével 31,32,33. A GPR3 ​​magasan expresszálódik a neurodegeneratív betegségekben érintett agyterületeken is, 34,35. A GPR3 ​​lehetséges szerepét az anyagcsere és az öregedési hatásokban, különösen a súlygyarapodás vonatkozásában, nem vizsgálták. A GPR3 ​​iránti érdeklődésünket kezdetben két létező kannabinoid receptorral 36 folytatott szekvencia-homológiája vezette, ami potenciális jelölté tette egy még nem azonosított harmadik kannabinoid receptor keresése során. Meglepődtünk azonban, amikor újszerű és váratlan fenotípust találtunk, amely új irányt adott tanulmányunknak. Itt váratlan összefüggésről számolunk be az öregedés és az elhízás között keresztül GPR3. A GPR3 ​​hiányában szenvedő egerek késői megjelenésű elhízást mutatnak, ami az iBAT és a termogenezis fehérje 1 szétkapcsolódásának csökkenésével jár.

Eredmények

Az idősebb Gpr3 KO egerek elhízott fenotípusúak

Gpr3 több metabolikusan aktív perifériás szövetben fejeződik ki, bár alacsonyabb szinten, mint a központi idegrendszerben (CNS) (1A. ábra), és részleges vagy teljes deléciója az idősebbek (12 hónaposok) testtömegének genotípus-specifikus változásaihoz vezet ) egerek (1B. ábra). Így egy év leforgása alatt a GPR3 ​​heterozigóta (Het) és a knockout (KO) egerek egy átlagos egérállományon tartva átlagosan

30% -kal nagyobb súly, mint életkoruknak megfelelő vad típusú (WT) alomtársak, és vizuálisan megkülönböztethetők voltak egymástól (1B. Ábra). A testtömeg-különbségek a 12 hónapos GPR3 ​​WT, Het és KO nők között szintén szignifikánsak voltak, de kevésbé hangsúlyosak, mint a hímeknél (27,31 ± 1,14 g, 27,39 ± 0,83 g és 30,93 ± 1,04 g; P 1. ábra

egereknél

Fenotípus-különbségek a GPR3 ​​egerek között.

Az idősebb GPR3 ​​Het és KO hím egerek zsírsavindexei 1,7 ± 0,3-szorosra, illetve 2,0 ± 0,1-szeresére emelkedtek, összehasonlítva a WT alomtársakkal (1C. Ábra). A legszembetűnőbb különbségeket a szubkután (1D. Ábra) és az epididymális (1E ábra) zsírraktárakban figyelték meg, amelyek a zsírosodás és a súlygyarapodás túlnyomó részét tették ki. A szövettani metszeteken való megjelenéssel összhangban a szubkután és epididymális adipocyták észrevehetően nagyobbak voltak a 12 hónapos GPR3 ​​KO egerekben, mint az életkornak megfelelő WT alomtársakban (1C. Ábra). Az idősebb GPR3 ​​KO egerek májszakaszainak hematoxilin- és eozin- (H&E) festése a zsírcseppek felhalmozódását tárta fel, amelyet a máj trigliceridtartalmának jelentős növekedése párhuzamosan mutatott (1C. Ábra). Meglepő módon a GPR3 ​​deléciója nem volt hatással a szérum metabolikus markerekre nem koplaló 12 hónapos egerekben. Az egyik figyelemre méltó kivétel a leptin volt, amelynek magas koncentrációja a GPR3 ​​KO egerekben közvetlenül korrelált a megnövekedett adipozitással (1. táblázat). Az egynapos éhomi étrend után a bazális vércukor-koncentráció az idősebb GPR3 ​​KO egerekben szignifikánsan magasabb volt, mint a WT alomtársakban, és a GPR3 ​​KO a glükóz toleranciájuk jelentős csökkenését mutatta (GTT; 1G ábra, bal oldali panel), amit egy magasabb AUC-érték, mint a WT társainál (353,63 ± 34,02, illetve 248,02 ± 11,64 óra x mg/dl, P, 1. táblázat: Szérum metabolikus markerek és teljes vércukor koncentráció 12 hónapos egerekben.

Az idősebb GPR3 ​​KO egerek csökkentették az összes energiafelhasználást

A közvetett kalorimetria az idősebb GPR3 ​​KO egerek (TEE; 2A. Ábra) összesített energiafelhasználásának jelentős és tartós csökkenését mutatta ki anélkül, hogy a légzési hányadukban jelentős változás történt volna (RQ; 2B. Ábra). A TEE csökkenése az oxigénfogyasztás és a szén-dioxid-termelés egyidejű csökkenésével járt a GPR3 ​​KO csoportban (S1. Ábra). A GPR3 ​​KO egereknél az ételfogyasztás is alacsonyabb volt, mint a WT alomtársaknál (2C. Ábra), miközben fontos, hogy az ambuláns tevékenység hasonló maradt a genotípusok között (2D. Ábra). Ezek az anyagcsere-különbségek hasonlóak voltak a világos és a sötét fázisban (2. ábra, jobb oldali panelek), és összhangban vannak az elhízott fenotípussal.

Az idősebb GPR3 ​​egerek metabolikus profilja közvetett kalorimetriával elemezve.

A GPR3 ​​KO egerek későn megjelenő elhízott fenotípust mutatnak

A GPR3 ​​KO fenotípus időbeli dinamikájának vizsgálatához 18 hónapig figyeltük a standard chow-táplált egerek testtömegét. Amint a 3A. Ábrán látható, a testtömeg nem volt különbözõ a WT és a GPR3 ​​KO egerek között az élet elsõ 5 hónapjában, de a GPR3 ​​KO egerek ezután jelentõsen nagyobb súlyt kaptak. 5 hónapos korban mindkét csoportban hasonló értékek voltak a TEE, az RQ, a táplálékfelvétel és az ambuláns aktivitás szempontjából (3B – E ábra). Hasonló széklet triglicerid tartalommal is rendelkeztek (S2. Ábra), ami összehasonlítható bélfelszívó képességre utal. Az állatok életkorának előrehaladtával a GPR3 ​​KO egerek lényegesen nagyobb súlyt kaptak. Annak érdekében, hogy jobban megértsük, miért alakul ki elhízás a GPR3 ​​KO egerekben az élet későbbi szakaszaiban, további vizsgálatokat végeztünk 5 hónapos (felnőtt) állatokon, mivel ez volt a legkésőbbi időpont az elhízott fenotípus nyilvánvalóvá válása előtt.

A GPR3 ​​KO egerek későn megjelenő elhízott fenotípust mutatnak, változatlan metabolikus profillal, felnőttkorukig.

Felnőtt GPR3 ​​KO egereknél csökkent a glükózfelvétel az iBAT-ban

Először hiperinsulinémiás euglikémiás clamp kísérleteket végeztünk, hogy megvizsgáljuk a szövetspecifikus különbségeket a glükóz felvételében 5 hónapos egerekben. Ebben a korban a WT és a GPR3 ​​KO állatok testtömege továbbra is hasonló volt (31,55 ± 1,02 g, illetve 31,06 ± 1,15 g; n = 6–7). A befogás előtti bazális vércukorszint (4A. Ábra), a glükózinfúziós sebesség (GIR) és a vércukorszint a szorítás alatt (4A – B. Ábra), az egész test glükóz clearance-e (Rd; 4C. Ábra) és az inzulin által kiváltott szuppresszió A máj glükóztermelésének (hGP; 4D. ábra) aránya szintén hasonló volt a felnőtt GPR3 ​​genotípusok között. Mégis volt néhány kiemelkedő különbség a WT és GPR3 ​​KO egerek között az egyes szövetek glükózfelvételében (4E. Ábra). Különösen figyelemre méltó volt a kétszer alacsonyabb glükózfelvétel a GPR3 ​​KO egerek iBAT-ban a WT-társaikkal összehasonlítva. Ezzel szemben a GPR3 ​​KO egerek epididymális zsírszövetében a glükózfelvétel szignifikánsan magasabb volt, míg a szubkután és perirenalis zsírraktárak, a máj és a gastrocnemius izomzat és a hipotalamusz csoportjai között hasonló maradt (4E. Ábra).

Glikémiás kontroll felnőtt GPR3 ​​egerekben.

A felnőtt GPR3 ​​KO egerek iBAT molekuláris változásai megelőzik az idősebb egerek testhőmérsékletének csökkenését

Az élet első 5 hónapjában nem figyeltünk meg lényeges különbségeket a testhőmérsékletben, bár a testhőmérséklet idővel gyorsabban csökkent a GPR3 ​​KO-ban, mint a WT egerekben. Amikor az állatok elérték a 12 hónapos kort, a testhőmérséklet szignifikánsan alacsonyabb volt a GPR3 ​​KO-ban, mint a WT egerekben, és 6 hónappal később alacsonyabb maradt (5A. Ábra). Ehhez alacsonyabb iBAT norepinefrinszint és alacsonyabb szérum tiroxin (T4), de nem trijódtironin (T3) és pajzsmirigy-stimuláló hormon (TSH) koncentráció társult 12 hónapos GPR3 ​​KO egerekben (S3. Ábra). A 12 hónapos WT egerekben a Gpr3 gén expressziójának csökkentése is észrevehető volt (5B. Ábra).

Felnőtt GPR3 ​​egerek termogén tulajdonságai.

Öt hónapos korban a GPR3 ​​KO és WT egerek szöveti noradrenalinszintje és a T3, T4 és TSH szérumkoncentrációja összehasonlítható volt (S3. Ábra). A normál nyugalmi testhőmérséklet ellenére az iBAT felnőtt GPR3 ​​KO egerekben már mutatott néhány molekuláris változást, amelyek összhangban voltak és előre jelezték a termogén funkció elvesztését egy későbbi életkorban. A GPR3 ​​hiányában szenvedő egereknél lényegesen alacsonyabb volt a szétkapcsolódó protein 1 (UCP1), a peroxiszóma proliferátor által aktivált receptor-γ koaktivátor 1 alfa (PGC1α) és a 2-es típusú jodotironin-dejodináz (Dio2) bazális expressziója, az adrenerg receptorokat, glükóz transzportereket kódoló gének változása nélkül, zsírsav-szintáz vagy sztearoil-CoA deszaturáz (5.C ábra). Amint azt a Western blot bizonyítja, a GPR3 ​​KO egerek iBAT-jának is szignifikánsan csökkent UCP1-tartalma volt, a citokróm c-oxidáz II-alegység (MTCO2) fehérje szintjének különbsége nem volt. Ezt a megfigyelést tovább támasztotta alá az iBAT metszetek alacsonyabb UCP1 fluoreszcencia-jelölési intenzitása (5D. Ábra).

Annak igazolására, hogy az iBAT-ban csökkent UCP1 fehérje élettani hatással van-e a felnőtt GPR3 ​​KO egerekre, ideiglenesen hideg környezetbe (4 ˚C) helyeztük, és megvizsgáltuk, hogy képesek-e megvédeni a testhőmérsékletüket akut hideg expozíció után. Amint az 5E. Ábra mutatja, a WT egerek a kísérlet időtartama alatt sikeresen tudták fenntartani fiziológiai hőmérsékletüket hideg kamrákban. Ezzel szemben, annak ellenére, hogy normál testhőmérséklet mellett szobahőmérsékleten, összehasonlítható iBAT norepinefrin szint és a pajzsmirigy működésének szérummarkerei voltak a csoportok között a hideg expozíció során (S4. Ábra), az 5 hónapos GPR3 ​​KO egerek csökkent toleranciát mutattak a hidegre, ami a testhőmérsékletük fokozatos csökkenésével nyilvánult meg a hideg okozta kihívás alatt. A hideg ülésszak végén a testhőmérséklet a GPR3 ​​KO egerekben átlagosan 0,9 ° C-kal alacsonyabb volt, mint a WT csoportban, míg a felnőtt GPR3 ​​KO egerek testhőmérséklete azonnal visszaállt az expozíció előtti szintre, miután az állatokat átültették házi ketrecek környezeti körülmények között (5D. ábra).

Az akut hideg expozíció erőteljesen befolyásolta GPR3 WR egerek mRNS expressziója iBAT-ban, amely 17-szeresére nőtt a környezeti viszonyok szintjéhez képest (5E. ábra). Ezzel szemben a Gpr6 és Gpr12 változatlan maradt (S5. ábra), míg a hidegteszt során a többi érdekes gén változása meglehetősen szerény volt, és mindkét csoportban ugyanazt a mintát követte. Az egyik figyelemre méltó kivétel a magasabb, esetleg kompenzációs növekedés volt Dio2 génexpresszió GPR3 ​​KO-ban a WT egerekhez viszonyítva (S6. ábra).

A fenti eredmények azt mutatják, hogy az 5 hónapos GPR3 ​​KO egerek, miközben fenntartják a normális testhőmérsékletet környezeti körülmények között, veszélyeztetettek abban a képességükben, hogy megvédjék a hőháztartást a hideg alatt.

Vita

Az öregedés elválaszthatatlanul összefüggésben van az anyagcsere változásaival, amelyek hajlamossá teszik az embert az elhízásra és a kapcsolódó patológiákra. Az átfedő jelátviteli utak ellenére az öregedést az elhízással összekötő tényezők nagyrészt ismeretlenek.

Jelen tanulmányban az árva GPR3 ​​abláció hatásait vizsgáltuk egerek energiacseréjére. Ez a receptor korábban szerepet játszott a korai petefészek-öregedésben (31,32,33) és a neurodegeneratív rendellenességekben (34,35), amelyek mind az életkorral összefüggő patológiák. Itt számolunk be először arról, hogy a GPR3 ​​hiányos hím egerek késői elhízást mutatnak, ha rendszeres chow-étrenden tartják őket. A testtömeg és az anyagcsere-profilok nem különböztek a férfi GPR3 ​​KO és WT csoportok között az élet első 5 hónapjában, majd a testtömeg szisztematikusan és genotípus-specifikus módon nőtt, így 12 hónapos korára a GPR3 ​​KO egerek jelentősen megnőttek súlyosabb, mint a WT alomtársaik, a lényegesen magasabb adipozitási index miatt és a károsodott termogenezissel összefüggésben. A génadagoló hatás a heterozigóta állatok köztes fenotípusában is nyilvánvaló volt. A női GPR3 ​​KO egerek súlya lényegesen kisebb, mint a hímeknél, ami azt jelzi, hogy a petefészek korai öregedése valószínűleg nem felelős az elhízott fenotípusért, és ha van ilyen, akkor valójában korlátozhatja ennek a fenotípusnak a kifejeződését nőstény egerekben.

A túlsúly ellenére a 12 hónapos GPR3 ​​KO egerek metabolikus profilja nem mutatta meg a metabolikus szindróma klasszikus szisztémás jellemzőit. A GPR3 ​​ablációja nem okozott szisztémás hiperglikémiát, hiperinsulinémiát, diszlipidémiát, májkárosodást vagy a metabolikus markerek jelentős részének megváltozását nem éhezési körülmények között. Amint azt a GTT és az ITT tesztek tükrözik, a 12 hónapos GPR3 ​​KO egerek glükóz-intoleránsak voltak, de inzulinérzékenyek maradtak, kompatibilisek az alacsonyabb energiafelhasználású állapottal.

Összefoglalva, amint azt a 6. ábra összefoglalja, a jelen eredmények kapcsolatot teremtenek a termogenezissel az életkorral összefüggő változások és a súlygyarapodás között. keresztül az árva receptor GPR3. A GPR3 ​​hiányában szenvedő egerek későn jelentkező elhízott fenotípust mutattak az iBAT károsodott termogén funkciója miatt. A GPR3 ​​tehát új farmakológiai célpontként szolgálhat az idősödő népesség elhízásának kezelésére szolgáló releváns terápiás beavatkozás kidolgozásában.

A fenotípus változásainak összefoglalása GPR3-hiányos egerekben.