Strukturális és funkcionális változások a magas zsírtartalmú étrend okozta elhízott egerek veséjében

Absztrakt

a metabolikus szindróma, amelyet az elhízás, diszlipidémia, hiperglikémia és magas vérnyomás csoportosulása jellemez, jelentős közegészségügyi probléma (1, 9, 10, 31). Nemrégiben számos vizsgálat kimutatta, hogy a metabolikus szindrómában szenvedő betegeknél nagy a krónikus vesebetegség (CKD) kockázata (7, 29, 32, 33). A CKD szintén fontos egészségügyi fenyegetésként jelenik meg, mert nemcsak a végstádiumú veseelégtelenség progressziójának előrejelzője, hanem a kardiovaszkuláris mortalitás független kockázati tényezője is (14, 16, 22, 30). Érdekes módon a metabolikus szindróma és a CKD számos közös kockázati tényezőt hordoz magában a szív- és érrendszeri betegségek szempontjából. A metabolikus szindrómában és a CKD-ben szenvedő betegeknél a szív- és érrendszeri betegségek additíve megnövekedett kockázatáról számoltak be, bár mindegyik a kardiovaszkuláris betegség független kockázatát jelenti (19 Ezért a metabolikus szindrómával járó CKD megelőzése fontos az ebben a szindrómában szenvedő betegek kimenetelének javítása érdekében. A CKD megelőzésére irányuló stratégia kidolgozásához elengedhetetlennek tűnik a metabolikus szindróma veseműködésének, valamint a szisztémás rendellenességeknek a tisztázása. Ezeket azonban még nem értékelték ki teljesen, és azok a mechanizmusok, amelyek révén a metabolikus szindróma megindíthatja és súlyosbíthatja a CKD-t, továbbra is megfoghatatlan és nagyrészt spekulatív.

Állatok.

Vér- és vizeletelemzés.

A triglicerideket (TG), az összes koleszterint és a nem észterezett zsírsavakat (NEFA) L típusú TG H készlet, koleszterin E-teszt készlet és NEFA C-teszt készlet (Wako Chemicals, Osaka, Japán) segítségével mértük. A plazma inzulint ELISA kit segítségével határoztuk meg (Morinaga Institute of Biological Science, Tokió, Japán). A plazma adiponektint egér-specifikus ELISA készlettel határoztuk meg (Otsuka Pharmaceutical, Tokió, Japán). A hemoglobin A1c-t (HbA1c) a DCA 2000 analizátorral (Siemens Medical Solutions Diagnostics, Tokió, Japán) mértük. A vizelet albumin koncentrációját ELISA kit segítségével (Exocell, Philadelphia, PA) mértük, és az Egyesült Arab Emírségeket a 24 órás vizeletgyűjtés során kiválasztott teljes mennyiségben fejeztük ki. Az oxidatív DNS károsodásának meghatározásához a 8-hidroxi-2′-deoxi-guanozin (8-OH-dG) 24 órás vizeletszintjét kompetitív ELISA készlet segítségével (8-OH-dG Check, Institute of the Ageing Control) határoztuk meg., Shizuoka, Japán).

Hasi komputertomográfia.

Minden étrendi csoportban az egereket pentobarbitális nátrium intraperitoneális injekciójával altattuk, majd hasi számítógépes tomográfiát (LCT100A; AcroBio, Tokió, Japán) hajtottunk végre.

Morfológiai elemzés és immunhisztokémia.

Elektronmikroszkópos vizsgálat.

Egerek LFD-n és HFD-n 12. hét A kísérleti idõszakban pentobarbitális nátrium intraperitoneális injekcióval altattuk. A veséket 0,1 mol/l foszfátpufferral perfundáltuk, majd eltávolítottuk, kis szövetblokkokra (1 mm 3) vágtuk, és 2,0% glutaldehidben és 2,0% paraformaldehidben rögzítettük 0,1 mol/l foszfátpufferrel 4 ° C-on. 2% -os ozmium-tetroxiddal történő utófixálás után a szöveteket fokozatmentes etanolkészítmények sorozatában dehidratáltuk, propilén-oxid helyett etanolt helyettesítve, és epoxigyantába ágyazva. Az ultravékony metszeteket kétszer festettük uranil-acetáttal és ólommal. A metszeteket JEM1200EX elektronmikroszkóppal (JOEL, Tokió, Japán) vizsgáltuk 80 kV-on.

Immunfluoreszcens képalkotás és olajvörös O festés.

Az extracelluláris mátrix (ECM) felhalmozódásának értékelésére immunfluoreszcens festést végeztünk nyúl anti-egér IV típusú kollagén antitesttel (Chemicon, Temecula, CA). A fagyasztott metszeteket 10% -os formalin PBS-ben 10 percig fixáltuk, és 2% BSA-val PBS-ben 10 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten. Ezután egy éjszakán át 4 ° C-on lefedtük IV típusú kollagén antitesttel (1: 200 arányban hígítva) az előinkubációs oldatban. A metszeteket háromszor PBS-sel öblítettük, 2% kecskeszérummal 2% BSA-ban PBS-ben inkubáltuk szobahőmérsékleten, és 1 órán át inkubáltuk 4 ° C-on a másodlagos antitesttel, rodaminnal konjugált kecske nyúlellenes IgG antitesttel (hígítva). 1: 100, MP Biomedicals, Solon, OH). PBS-sel végzett öblítés után a szakaszokat rögzítő közeg alkalmazásával szerelték fel. Ezután a vese metszeteket fluoreszcens mikroszkóppal (BX61, Olympus, Tokió, Japán) készítettük. Fagyasztott metszeteket használtak olajvörös O festéshez is, amelyekkel értékelték a semleges lipidek vesefelhalmozódását, amint arról korábban beszámoltunk.

RNS extrakció és kvantitatív valós idejű PCR.

A teljes RNS-t a teljes veséből izoláltuk a TRIzol protokoll alapján (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia). A cDNS-t reverz transzkripciós reagensek alkalmazásával szintetizáltuk (Takara Bio, Otsu, Japán). Az iQSYBR Green Supermix-et (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) használtuk valós idejű PCR-re (ABI Prime TM 7500 Sequence Detection System, PerkinElmer Applied Biosystems, Foster City, CA). Az mRNS expressziójának szintjét a standard görbe módszerrel számszerűsítettük. A standard görbéket sorozatban hígított standard sablon felhasználásával készítettük. Ct értékeket használtunk az mRNS expresszió szintjének kiszámításához a standard görbéből. Az analitikai adatokat belső kontrollként a β-aktin mRNS-expressziójának szintjével állítottuk be. A primerek szekvenciája a következő volt: β-aktin (előre) tggatgccacaggattccat, (fordított) cgtgcgtgacatcaaagagaa; renin (előre) atgaagggggtgtctgtggggtc, (fordított) atgtcggggagggtgggcacctg; angiotenzin-konvertáló enzim (ACE) (előremenő).

Akut sótöltési vizsgálat.

A vizelettel történő nátrium-kiválasztás vizsgálata akut sóterhelés hatására egerekben HFD-n vagy LFD-n 12. hét a kísérleti periódus során sótöltést hajtottunk végre, amint arról korábban beszámoltunk (13). 12 órán át tartó éhezés után az egereknek intraperitoneálisan 1,5 ml 0,9% -os sóoldatot adtak, és metabolikus ketrecekbe helyezték őket. Ezt követően óránként gyűjtöttük a vizeletet a következő 6 órában, és mértük a vizelet térfogatát és a vizelet nátrium-kiválasztását.

Hosszú távú sóterhelési vizsgálat.

Annak tesztelésére, hogy a hosszú távú magas sófogyasztás befolyásolja-e az egerek vérnyomását HFD-n, 4 hetes sóterhelést hajtottunk végre egerek segítségével HFD-n vagy LFD-n. Miután az egereket mindkét étrenden (minden étrendben 0,1% NaCl-ot tartalmazva) 8 hetes csapvízzel tartottuk a fent leírtak szerint, minden étrenden magas sótartalommal tartottuk úgy, hogy csapvizet 1% nátrium-klorid-oldattal helyettesítettünk 4 hétig. wk, from 9. hét nak nek 12. hét a kísérleti időszak. A vérnyomást a sótöltés előtt és után mértük, és elemeztük a szisztolés vérnyomás változását. A sóérzékenységi indexet a nyomás-natriuresis görbe meredekségének reciprokaként határoztuk meg. Nyomás-natriuresis görbét alakítottunk ki a 24 órás vizelet-nátrium kiválasztás felrajzolásával, normalizálva a 24 órás vizelet kreatinin kiválasztására és a szisztolés vérnyomásra (24, 46).

Statisztikai analízis.

Az eredményeket átlag ± SE értékben fejezzük ki. Egyirányú ANOVA-t, majd Scheffé-tesztet alkalmaztunk a különbségek jelentőségének meghatározására három független csoport között. Két csoport összehasonlítását Mann-Whitney alkalmazásával végeztük U-teszt két független csoport számára és egy Wilcoxon jelölt rangú teszt az ismételt mérésekhez. A P értéke

1. ábra.A fiziológiai paraméterek változásai a kísérleti időszak alatt egereken, minden étrenden. A diagramok a testtömeg (A), a vércukorszint (B) és a szisztolés vérnyomás (C) alacsony zsírtartalmú étrenden (LFD), magas zsírtartalmú étrenden (HFD) vagy magas zsírtartalmú étrendkorlátozáson (HFDR) való egereknél. Az értékek átlag ± SE; n = 14–19, 14–19 és 10 egérben LFD-n, HFD-n vagy HFDR-en. A statisztikai elemzéseket egyutas ANOVA-val végeztük, amelyet Scheffé teszt követett. *P

2. ábra.A hasi számítógépes tomográfia (CT) vizsgálata 12. hét LFD-n lévő egér kísérleti periódusa (A), HFD (B) és a HFDR (C).

Asztal 1. Jellemzők a kísérleti időszak 12. hetében

Az értékek átlag ± SE; n = 10–13 egér = alacsony zsírtartalmú étrend (LFD), n = 11–13 egér zsírtartalmú étrenden (HFD), és n = 7–10 egér magas zsírtartalmú étrend-korlátozáson (HFDR). Az ételbevitel az átlagos a kísérleti időszakban. 8-OH-dG, 8-hidroxi-2′-dezoxi-guanozin. A statisztikai elemzéseket egyutas ANOVA-val végeztük, amelyet Scheffè teszt követett.

* P † P

3. ábra.A vese változásai a kísérleti időszak alatt egereken, minden étrenden. A: 24 órás vizeletalbumin kiválasztás. B: vese súlya at 12. hét egerekben LFD, HFD vagy HFDR. Az értékek átlag ± SE; n = 11, 11, 9 egerekben LFD-n, HFD-n vagy HFDR-en a vizelet albumin kiválasztására és n = 10, 10 és 9 egereken LFD-n, HFD-n vagy HFDR-en a vese súlya szerint. A statisztikai elemzéseket egyutas ANOVA-val végeztük, amelyet Scheffé teszt követett. *P

4. ábra.Szövettani jellemzők az egerek veséjében minden étrenden. Az LFD-n lévő egerek periódusos sav-Schiff (PAS) festett vese szakaszainak reprezentatív fénymikroszkópos jellemzői (A), HFD (B) vagy HFDR (C) nál nél 12. hét a kísérleti időszak. Eredeti nagyítás × 400. A glomeruláris csomóterület kvantitatív elemzése szintén látható (D) és a mezangiális mátrix területe (E) LFD, HFD vagy HFDR egereken. Az értékek átlag ± SE; n = 10, 10 és 7 egerekben LFD-n, HFD-n vagy HFDR-en. A statisztikai elemzéseket egyutas ANOVA-val végeztük, amelyet Scheffé teszt követett. *P

Vese patogenetikai változások egerekben HFD-n.

A HFD egereken a 12. hét, az elektronmikroszkópos vizsgálat kimutatta a megnövekedett extracelluláris mátrixot, a szabálytalanul megvastagodó glomeruláris alapmembránt és a lábfolyamat effektusait a glomerulusok egy részén (5. ábra). Az immunfluoreszcenciás vizsgálat kimutatta, hogy a IV típusú kollagén, az egyik legfontosabb extracelluláris mátrixfehérje felhalmozódása megnőtt az egerek glomerulusaiban egy HFD-n (6. ábra, A és B). Olajvörös O-festéssel megvizsgált csoportok egereinek vesesejtjeiben a semleges lipid felhalmozódását detektáltuk az egerek glomerulusaiban és proximális tubulusaiban HFD-n, de LFD-n lévő egerekben nem (6. ábra)., C és D). Az F4/80 (makrofág marker) pozitív sejteket is főleg a vese medullájában figyelték meg (6. ábra, E és F). Az F4/80-pozitív sejtek száma a vese medullában szignifikánsan megnőtt az egerekben HFD-n, mint az LFD-n (4,64 ± 0,52/HPF vs. 2,74 ± 0,45/HPF, P

5. ábra.Ultrastrukturális jellemzők az egerek veséjében HFD-n. Reprezentatív elektronmikroszkópos felvételeket mutatunk be egerekről egy LFD-n (A és C) vagy HFD (B és D) nál nél 12. hét. A mezangiális mátrix tágulását csillag (B), a glomeruláris alapmembrán szabálytalan megvastagodása fekete nyíllal (D), és a lábfejproblémákat fehér nyíllal (D). Eredeti nagyítás × 5000 (A és B) és × 20 000 (C és D). Mes, mesangialis sejt; CP, kapilláris lumen.

6. ábra.Kóros elváltozások az egerek veséiben HFD-n. Immunfluoreszcenciás vizsgálat a IV típusú kollagén számára LFD-s egerek veseszakaszain (A) vagy HFD (B) nál nél 12. hét megmutatva. Eredeti nagyítás × 400. C és D: olajvörös O festés a vese szakaszain egy LFD-n (C) vagy HFD (D ) nál nél 12. hét. Eredeti nagyítás × 400. E és F: immunhisztokémia az F4/80-hoz LFD vese szakaszain (E) vagy HFD (F) nál nél 12. hét. Eredeti nagyítás × 100.

7. ábra.renin, angiotenzin konvertáló enzim (ACE) és angiotenzinogén mRNS expressziója a vesében. Az értékek átlag ± SE; n = 7–11 egerekben egy LFD-n és n = 8–12 HFD-n. A statisztikai elemzéseket Mann-Whitney végezte U-teszt. *P

Károsodott nátriumkezelés egerekben HFD-n.

A HFD által kiváltott szisztolés vérnyomás-emelkedés egyik mechanizmusának feltárásához végül megvizsgáltuk a sóérzékenységet az egerekben HFD-n. Először az akut sótöltés hatására a vizelettel történő nátrium-kiválasztást vizsgáltuk. Az első 4 óra alatt a vizelet kiválasztása a vizelettel (8. ábraA) és a vizelet térfogata (8. ábraB) szignifikánsan alacsonyabbak voltak a HFD egerekben, mint az LFD egerekben. 6 óra végén a teljes vizelettel történő nátriumürítés és vizeletmennyiség kissé, de nem szignifikánsan alacsonyabb, és kisebb ebben a csoportban. Ezután megvizsgálták a 4 hetes sóterhelés hatását a szisztolés vérnyomásra. A HFD-n lévő egerekben a szisztolés vérnyomás 4 hetes sóterheléssel történő növekedése nagyobb volt, mint a HFD-n lévő egerekben nátriumterhelés nélkül. 12. hét kísérleti periódusban (13,6 ± 2,1 vs. 4,8 ± 2,5 Hgmm, P

8. ábra.A vizelettel történő nátriumürítés akut sótöltés után. A vizelettel történő nátriumürítés (A) és a vizelet mennyisége (B) alacsony zsírtartalmú étrendben (LFD) vagy magas zsírtartalmú étrendben (HFD) szenvedő egereknél 6 órán át, 0,9% -os sóoldat intraperitoneális injekcióját követően. Az adatokat a vizelet kumulatív kiválasztásaként fejezzük ki. Az értékek átlag ± SE; n = 8 az egerekben egy LFD-n és n = 9 HFD-n. A statisztikai elemzéseket Mann-Whitney végezte U-teszt. *P

9. ábra.Nyomás-natriuresis görbe és sóérzékenységi index. Az egerek alacsony zsírtartalmú étrenden (LFD) vagy a magas zsírtartalmú étrenden (HFD) és a sóérzékenységi indexen mért nyomása-natriuresis görbéje, −1,17 ± 3,4 az egereknél LFD-vel szemben, 34,03 ± 6,3 a egerek HFD-n (P

Ebben a tanulmányban megerősítettük, hogy a HFD táplálása C57BL/6 egereknek az emberi metabolikus szindrómával kompatibilis főbb szisztémás változásokat idéz elő, beleértve az elhízást, a hiperglikémiát, a hiperinsulinémiát, a hipertrigliceridémiát és a magas vérnyomást. A metabolikus szindróma megjelenése után a HFD-n lévő egereknél az extracelluláris mátrixfehérje felhalmozódásával nőtt az Egyesült Arab Emírségek és a glomeruláris elváltozások. Továbbá bebizonyítottuk a vese patofiziológiai elváltozásait, ideértve a lipid felhalmozódást, a makrofág infiltrációt, a megnövekedett oxidatív stresszt és a nátrium kezelésének károsodását egerekben HFD-n. Ezeket a szisztémás változásokat és vesekárosodásokat megakadályozta a testtömeg szabályozása a HFD táplálásának étrendi korlátozásával, ami arra utal, hogy a testtömeg növekedése, nem pedig önmagában a HFD táplálása, hozzájárul e rendellenességek kialakulásához.

Korábban beszámoltunk arról, hogy a metabolikus szindrómában szenvedő betegeknél sóérzékeny magas vérnyomás alakul ki (45), amely szintén a metabolikus szindróma alatti veseelégtelenség egyik fontos mechanizmusa (12, 45). Ebben a vizsgálatban a HFD-n lévő egerek késleltették a vizelet nátrium-kiválasztását az akut sóterhelés hatására és a szisztolés vérnyomás sóérzékeny emelkedését 4 hét sóterheléssel. Emellett a renin, az ACE és az angiotenzinogén mRNS-expressziójának szintje a HFD-s egerek veséjében megnőtt, összehasonlítva az LFD-n lévő egerek vese-RAS-aktivációjával. A vese RAS aktiválása a vesében a nátrium kezelésének károsodásával jár (5, 35, 38, 41, 47). Így a kóros sóérzékenység, amely a vese RAS aktiválódásával járhat együtt, a vesefunkció sérülésének és a magas vérnyomás egyik mechanizmusa a HFD egereken.

Az emberi metabolikus szindrómáról beszámoltak, hogy társul a CKD-vel, definiálva albuminuria és csökkent glomeruláris szűrési sebességgel (7, 32). Az is ismert, hogy a glomerulomegalia és a fokális szegmentális glomerulosclerosis kialakulása masszív elhízással függ össze (17, 20, 21). A releváns szövettani vizsgálatok többsége azonban csak kis boncolási sorozatokra vagy operatív esetekre korlátozódott, mert elhízott betegeknél technikailag nehéz vesebiopsziát végezni. Ezért továbbra sem tisztázott, hogy vannak-e a metabolikus szindrómával társult vesebetegségnek specifikus kóros tulajdonságai. Ebben a tanulmányban azt figyeltük meg, hogy a HFD-n lévő C57BL/6 egereknél vesefunkciós és kóros rendellenességek alakultak ki, hasonlóan az elhízással vagy metabolikus szindrómával rendelkező betegeknél megfigyeltekhez. A bizonyítékok arra utalnak, hogy ez a modell hasznos lehet a metabolikus szindrómával járó CKD kóros jellemzőinek tisztázásában.

Összefoglalva, a metabolikus szindróma egérmodelljeként jellemeztük a C57BL/6 egerek veséiben bekövetkezett strukturális és funkcionális változásokat HFD-n. Javasoljuk, hogy az ezen egérmodell alkalmazásával végzett további kutatás hasznos lehet a metabolikus szindrómával járó vese patogenezisének tisztázásában és a metabolikus szindrómával járó CKD új terápiás stratégiáinak kidolgozásában.

Ezt a munkát a Salt Science Research Foundation (0724 sz.) És a Takeda Science Foundation támogatásai finanszírozták.

LÁBJEGYZETEK

A cikk megjelenésének költségeit részben az oldaldíjak megfizetése fedezte. A cikket ezért ezennel fel kell tüntetni:hirdetés”Szerint a 18 U.S.C. Az 1734. § kizárólag ennek a ténynek a feltüntetésére.

Hálásak vagyunk Hiroyuki Matsuno professzornak a Doshisha Női Szabadművészeti Főiskola Klinikai Kóros Biokémiai Tanszékén, hogy megosztotta technikáját az egerek komputertomográfiájában. Köszönjük Makiko Serának, Dr. Yuki Tanakának és a Shiga Orvostudományi Egyetem Központi Kutatólaboratóriumának a kiváló technikai segítséget.