A diéta, az arany-tioglikóz-kezelés és az Agouti által kiváltott elhízáshoz VGF szükséges, és a koplalás hatására a Pro-Opiomelanocortin- és Y-neuropeptid-tartalmú íves neuronokban eltérően szabályozott.

Absztrakt

  • VGF
  • neurotrofin
  • hipotalamusz
  • elhízottság
  • agouti
  • POMC
  • NPY
  • leptin
  • melanokortin

A központi idegrendszer hipotalamusi idegi útjai szabályozzák az etetést és az energiafelhasználást. A perifériás zsírraktárak állapotát a keringő hormonok, például a leptin, egy adipocitákkal szintetizált fehérje közvetíti az agyba, amely transzportjával és a hipotalamuszban lévő leptin-receptor rendszerhez kötődve transzdukálja a jelét (Ahima et al., 2000; Schwartz et al. ., 2000). Itt a jóllakottságot kiváltó melanokortin útvonalak csökkentik a táplálékfelvételt két olyan peptid kölcsönhatása révén, amelyek versengenek a melanokortin 4 receptorhoz (MC4-R), az α-melanocitát stimuláló hormonhoz (α-MSH) és antagonista agoutival kapcsolatos polipeptidjéhez (AGRP). ). Ezeknek a leptinre reagáló áramköröknek az energiaegyensúlyra gyakorolt ​​hatásait a hipotalamuszon belüli vetületek közvetítik az agytörzs, a gerincvelő és az agykéreg felé, és végül a perifériás anyagcsere szöveteket innerváló autonóm utak felé (Ahima et al., 2000).

diéta

Számos elhízott egérmodell elemzése azt mutatja, hogy a leptin és a melanokortin út kritikus szerepet játszik az energiaegyensúly szabályozásában. A leptin (ob/ob) vagy a leptin receptor (db/db) génjeiben mutációval rendelkező egereknél korán jelentkező elhízás alakul ki, amely csökkent anyagcserével, fokozott táplálékfelvétellel, cukorbetegséggel és csökkent termékenységgel jár (Friedman és Halaas, 1998). Azok az egerek, amelyek hibás jelátvitellel rendelkeznek a melanokortin útvonalában, amelyet a hipotalamusz MC4-R vagy agonista α-MSH [pro-opiomelanokortin (POMC) kiütés] célzott deléciója vagy agouti melanokortin receptor antagonisták túlzott expressziója okoz (A y/a ) vagy az agoutival kapcsolatos fehérje [AGRP vagy agouti-kapcsolódó transzkriptum (ART)] kifejleszti az érettségi elhízási szindrómát, amely hyperphagia, hyperinsulinemia és hyperglykaemia társul (Barsh, 1999; Salton et al., 2000a). Ezen elhízott egerek beltenyésztése más, további genetikai mutációkat hordozó törzsekkel, például mahagóni (Gunn et al., 1999; Nagle et al., 1999) vagy Y neuropeptid (NPY) kiütés (Erickson et al., 1996), és a kapott utódok fenotípusainak elemzése rendkívül hasznos technika volt a leptin és a melanokortin útvonalának molekuláris összetevőinek jobb meghatározásához.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Használt egér törzsek. Az egérVgf gén célzott törlését és a VGF mutáns egerek kezdeti jellemzését korábban leírták (Hahm et al., 1999). A kiméra VGF kiütésű hímeket közvetlenül kereszteztük 129/SvJ-re, vagy ismételten kereszteztük C57BL/6 törzsekkel 10 generációig; Az F10 és F1 heterozigóták homozigóta VGF-hiányos utódai mindkét háttéren fenotípusosan nem voltak megkülönböztethetők. Az itt leírt kísérletekhez vegyes hátterű VGF mutáns egereket használtunk F2 és F3 generációkból. Kettős mutáns egerek előállításához termékeny heterozigóta Vgf +/Vgf− nőstény egereket vagy kétoldalúan ovariektomizált C57BL/6 × 129/SvJ nőstényeket (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) használtunk, amelyeket Vgf−/Vgf− petefészkekkel oltottak be. Ezeket A y/a (agouti) hímekkel vagy termékeny ob-/ob-hímekkel pároztuk, mindkettő C57BL/6 háttérrel (a The Jackson Laboratory cégtől szereztük be), amelyeket intraperitoneális leptin kúra mentett meg. Az Amgen Inc. (Thousand Oaks, Kalifornia) által bőségesen biztosított rekombináns egér leptint (20 μg/testtömeg-g) naponta kétszer 7 napig, majd kb. Minden másnap 30–60 napig ob-/ ob-hímeknek juttattuk el.

Böjt és leptinpótló vizsgálat. A vad típusú anddb/db egereket 48 órán keresztül éheztettük és megöltük (éhomi csoport). A leptinpótló vizsgálathoz ad libitum táplált és éhomi egereket intraperitoneálisan 12 óránként injektáltunk sóoldattal vagy leptinnel (0,5 μg rekombináns egér leptin/testtömeg-gm; R & D Systems, Minneapolis, MN). Az utolsó, ötödik injekciót 30 perccel az egerek elpusztítása előtt adtuk be, 2 órával a fények bekapcsolása után.

Kémiai elváltozások. A 3-4 hónapos egereknek egyetlen intraperitoneális injekciót adtak be az arany tioglikóz (GTG) (0,8 mg/testtömeg-gm) (Bergen és mtsai., 1998) után, az egereket rendszeres időközönként megmérték és táplálékfelvételt hajtottak végre. mért. Két héttel a GTG (vagy fiziológiás sóoldat) injekció után az egereket leöltük és a szöveteket elemzés céljából eltávolítottuk. A vad típusú és a VGF mutáns egerek külön csoportjait 3 nappal a GTG injekció után megöltük, az agyakat eltávolítottuk és szövettanilag Nissl festéssel megvizsgáltuk (Hahm et al., 1999), hogy megerősítsük, hogy az egyes genotípusú egerekben hipotalamusz elváltozások alakultak ki.

A nátrium-glutamát (MSG) injekcióit a korábbi módszerek kisebb módosításával hajtották végre (Pizzi és Barnhart, 1976). Az egerek a következő napi szubkután injekciókat kapták a 2. születés utáni napon (P2) P12-ig: 2,5, 2,8, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4,0, 4,2, 4,4, 4,6 és 4,8 mg MSG/testtömeg-gramm (PBS-ben) ). Az egereket hetente lemértük és 9 hónapos korukban leöltük, hipotalamusz RNS-eket izoláltunk, és meghatároztuk a szervek és szövetek tömegét.

Northern blot, vér és szérum elemzések. A Northern blot elemzést a korábban leírtak szerint hajtottuk végre (Mizuno és mtsai., 1996b), NPY (Mizuno és mtsai., 1996a), POMC (Mizuno és mtsai., 1998) és AGRP (Mizuno és Mobbs, 1999) próbákkal; a relatív mRNS-szinteket a film autoradiogramjainak densitometriai elemzésével határoztuk meg.

Az egereket avertinnel altattuk, és a vérmintákat szívpunkcióval vettük fel. A vércukorszintet egygombos profilmérővel (Lifescan Inc., Milpitas, CA) határoztuk meg. A szérum inzulin- és leptinszinteket radioimmun vizsgálattal (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA) vagy ELISA-val (Crystal Chem Inc., Chicago, IL) határoztuk meg.

Az energiaegyensúly és a testösszetétel elemzése. Az élelmiszer-fogyasztást naponta mértük folyékony étrenddel vagy mérhető szilárd pellet szállító rendszerrel (Bio-Serv, Frenchtown, NJ) 5 egymást követő napon keresztül, és átlagoltuk. A magas zsírtartalmú étrend-vizsgálatokhoz az egereket 5 hétig szokásos chow-val vagy magas kalóriatartalmú chow-val (5,396 kcal/gm) táplálták, magas zsírtartalmú (35,5%) és magas szénhidráttartalmú (35,4%) tartalommal (# F2685; Bio- Serv). Az összes lipid, fehérje és víz testtest-analízisét a korábban leírtak szerint végeztük (Chung és mtsai., 1998; Hahm és mtsai., 1999).

Az összes kolchicinnel kezelt állatot mélyen altattuk nátrium-pentobarbitállal és transzkardiálisan perfundáltuk 20 ml 0,01 m PBS-sel (pH 7,4), amely 15 000 U/l heparin-szulfátot, 150 ml 2% paraformaldehidet/4% akroleint tartalmazott 0,01 m foszfátpufferben (PB). ), pH 7,4, majd 30 ml 2% paraformaldehid ugyanabban a pufferben. Az agyakat eltávolítottuk és 30% -os szacharózban PBS-ben 4 ° C-on egy éjszakán át krioprotektáltuk, majd szárazjégen lefagyasztottuk.

Az immunfluoreszcenciát lényegében a korábban leírtak szerint hajtottuk végre (Fekete és mtsai., 2000a). A koronális metszeteket (25 μm vastagságú) vagy juh anti-α-MSH (1: 5000) (Elias et al., 1998) vagy juh anti-NPY antiszérum (1: 1000) keverékeiben (Peninsula Laboratories, Belmont, CA) keverékekben inkubáltuk. ) és nyúl anti-VGF antiszérum (1: 400) (Salton és mtsai, 1995), PBS-ben leöblítve, Texas vörös konjugált szamár juh-ellenes IgG-ben és FITC-konjugált szamár-nyúl anti-IgG-ben inkubálva (mindkettő 1:40).; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), és elemezte Zeiss (Thornwood, NY) Axioskop 2 epifluoreszcens mikroszkóppal.

A VGF kolokalizációja a-MSH-val és NPY-vel az etetett és éheztetett patkányok íves magjában. A kettősen jelölt immunfluoreszcens készítmények (A – C) kis teljesítményű mikrográfiái a VGF (zöld) és az α-MSH (piros) kolokalizációját mutatják be a retrochiasmaticus régióban (A), valamint a rostralis (B) és a caudalis ( C) etetett kolchicinnel kezelt patkányok íves magjának egy része (n = 3). Alacsony teljesítményű mikrográfiák (D, E) a POMC mRNS (AMCA-val, pszeudokolorizált vörös színnel jelölt) és a VGF mRNS (az ezüstszemcsék sötét mezőjének képe, pszeudokolorizált zöld) kolokalizációját mutatják a táplált íves magjában (D ) (n = 4) és éheztetett (E) (n = 4) patkányok. Kolchicinnel kezelt táplált patkányokban (F) a VGF immunreaktivitás (zöld) és az NPY immunreaktivitás (piros) az íves neuronok különböző populációiban lokalizálódik. Ezzel szemben a dorsalisan lokalizált NPY-immunreaktív (sárga) neuronok ~ 50% -a az éheztetett kolhicinnel kezelt patkányok ívmagjában (G) (n = 3).

Az NPY a táplálékfelvétel erős stimulátora, akárcsak az AGRP (vagy ART), az MC4-R-hez kötődő α-MSH antagonista, és ez a két orexigén peptid együtt expresszálódik a hipotalamusz mediális íves neuronjaiban (Elias et al., 1998, 1999). A hipotalamusz NPY és AGRP mRNS expressziója növekszik és a POMC mRNS csökken az éhezéssel (Hahn et al., 1998; Mizuno et al., 1998, 1999). Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk, melyik hipotalamusz neuronban szabályozódik a VGF expresszió az éhezés során, kolokalizáltuk a POMC és a VGF mRNS-eket, valamint az NPY és a VGF polipeptideket 64 órán át tartó étkezés nélkül (1E, G ábra). Megjegyeztük a VGF-jel jelentős csökkenését a retrochiasmaticus területen és az oldalirányú ívmagot a POMC-t tartalmazó neuronokban. Összességében az ezüstszemcsék teljes sűrűsége a teljes ívben (mediális és laterális csoportokban), amely a VGF-hez való hibridizáció eredményeként jött létre, éhomi állatokban kevesebb volt, mint etetett állatokban, ~ 50% -kal. Megfigyeltük azonban az íves mag mediális részének fokozott VGF hibridizációját is, amely az etetett állatoknál nem látható. Kettős jelű immunfluoreszcencia alkalmazásával ez a növekedés az NPY-t termelő idegsejtekre korlátozódott, és dorsalis volt a táplált állatokban megfigyelt NPY-neuronokkal (1G ábra). Összefoglalva, akkor éhomi állapotban a VGF és NPY expresszió indukálódott a mediális ívű neuronok populációjában, de a VGF és a POMC kolokalizációja csökkent.

A leptin gátolja az éhgyomri indukálta VGF mRNS szint növekedését az íves magban.