Akaricid hatás és a szövettani károsodás Bacillus thuringiensis fehérje kivonatok az atkán Psoroptes cuniculi

Errátum a cikkhez elérhető

Absztrakt

Háttér

Az atka Psoroptes cuniculi világszerte elterjedt ektoparazita, és leggyakrabban a nyúlfarmokban található. Jelentős gazdasági veszteségeket okoz a kereskedelmi célú nyúltenyésztés terén, a rossz bőrminőség, a csökkent fogamzási arány, a fogyás, a gyenge növekedés és az elhullás miatt. Számos stratégiát javasoltak az atka által okozott sör kezelésére, kezdve az akaricidek, entomopatogén gombák, illóolajok és oltások alkalmazásától. Az emberi rüh és az állati rüh terápiája és kezelése azonban továbbra is főként olyan gyógyszerek és vegyi anyagok használatán alapul, mint az ivermektin, amely hátrányokkal jár, beleértve a genotoxikus és citotoxikus hatásokat, az ellenállást és a környezeti károkat. Bacillus thuringiensis olyan baktérium, ártalmatlan az emberi lények, a háziállatok és a növények számára, amely biológiailag lebontható fehérjéket termel, és amelyet világszerte használtak biológiai védekezésre. Ennek a munkának az volt a célja, hogy alternatív kezelést találjon az által okozott rüh biológiai ellenőrzésén alapulva Psoroptes cuniculi, - törzsek fehérje-kivonatainak felhasználásával Bacillus thuringiensis.

Mód

P. cuniculi atkákat természetes fertőzött új-zélandi nyulakból nyertek, és különböző dózisú fehérjét kaptak B. thuringiensis hozzáadták az atkákhoz. Megmértük a mortalitást, és megadtuk a medián halálos koncentrációt és a medián halálos időket. A szövettani elemzéshez az atkákat 10% -os formalinban rögzítettük, amelyet paraffinba ágyazott szöveti technikával dolgoztunk fel. A metszeteket hematoxilin-eozinnal festettük, hogy megfigyeljük az általános szövettani struktúrát.

Eredmények

Itt jelentünk először bizonyítékot a in vitro a GP532 törzs által okozott akaricid hatás B. thuringiensis az atkán Psoroptes cuniculi, LC50 értéke 1,3 mg/ml és LT50 értéke 68 óra. Szövettani elváltozások, amelyeket B. thuringiensis ezen az atka esetében kiterjedt intercelluláris terek jelenléte volt a bazális membránban, a peritrofikus mátrix membrán leválása és morfológiai változások a bél oszlopos sejtjeiben.

Következtetések

Mivel ez az atka kötelező ektoparazita, amely nyulakat, kecskéket, lovakat, teheneket és juhokat érint, B. thuringiensis fehérje kivonatokat javasolnak a sertés biológiai védekezésének lehetséges kezelésére haszonállatokban.

Háttér

Az atka Psoroptes cuniculi (P. cuniculi) világszerte elterjedt ektoparazita, és leggyakrabban a nyúlfarmokban található. Ez az atka középfülgyulladást okoz, amely a házinyulaknál a leggyakoribb betegség, és a fő oka annak, hogy a tulajdonosok állatorvoshoz fordulnak. Így ez a parazita hatással van az állatok általános egészségére és higiéniájára [1]. P. cuniculi a fertőzés jelentős súlycsökkenést, kevésbé kedvező takarmányátalakítási arányt, vestibularis diszfunkciót és agyhártyagyulladást okozhat, amelyet gyakran másodlagos bakteriális fertőzések bonyolítanak [2]. Jelentős gazdasági veszteségeket okoz a rossz bőrminőség, a csökkent fogamzás, a fogyás, a gyenge növekedés és a halál miatt [3].

Számos stratégiát javasoltak a P. cuniculi, az akaricidek, entomopatogén gombák és illóolajok használatától kezdve az oltásokig [4, 5]. Az emberi rüh és az állati rüh terápiája és kezelése azonban továbbra is főként olyan gyógyszerek és vegyszerek használatán alapul, mint az ivermektin [6]. A parazita elleni védekezésben olyan gyógyszerek, mint például az ivermektin alkalmazása hátrányokkal jár, mivel mind genotoxikus, mind citotoxikus hatással bír. Ezenkívül széles körű használatuk ellenállást vált ki, környezeti szennyezéssel együtt [7–10]. Ezek a tények, amelyek a jó egészségügyi minőséget, higiéniát és megfelelő kezelést biztosító termékek fogyasztása iránti érdeklődéshez kapcsolódnak, kutatási erőfeszítéseket vezettek új hatékony vegyületek felfedezéséhez.

Bacillus thuringiensis (B. thuringiensis) Gram-pozitív baktérium, ártalmatlan emberre, háziállatokra és növényekre. Rendkívül biológiailag lebontható fehérjéket termel, és világszerte számos mezőgazdasági kártevő és az emberi betegségek egyes szúnyogvektorai elleni biológiai védekezésre használják [11, 12], újabban pedig az állatok és az emberek egészségét befolyásoló néhány parazita ellen javasolják használni. [13]. A bio-rovarölő szerek piacának több mint 90% -a ezen a baktériumon alapuló termékeket foglal magában [14], és világszerte körülbelül 60 000 izolátum található a B. thuringiensis nyilvános és magángyűjteményekben, amelyeknek specifikus rovarölő hatása lehet [15–17]. E munka célja a. Törzsek fehérje kivonatainak akaricid potenciáljának vizsgálata volt B. thuringiensis, megállapítva, hogy a GP532 törzs LC50 értéke 1,3 mg/ml volt, és rövid ideig (LT50 = 68 óra) hat in vitro tanulmányok. Továbbá beszámolunk arról, hogy a B. thuringiensis a fehérje kivonatok szövettani elváltozásokat eredményeznek az atka bélén.

Mód

Etikai nyilatkozat

Minden állatkísérlet követte a mexikói előírások szerint ajánlott állatgondozási és kísérleti gyakorlatokat (NOM-062-ZOO-1999). Ezek az előírások szigorúan összhangban vannak a Nemzeti Egészségügyi Intézetek laboratóriumi állatok gondozásával és használatával kapcsolatos útmutatójában (NIH és The Weatherall jelentés) szereplő ajánlásokkal, biztosítva a nemzetközi előírások és irányelvek betartását. Jelen kézirat nem tartalmaz klinikai vizsgálatokat és betegadatokat.

A. Izolálása B. thuringiensis törzsek

Holttestei P. cuniculi új-zélandi fertőzött nyúlból vett varasodás mintájából vettük, és egyenként egy steril mikrocentrifuga csőbe helyeztük. Kétszer mostuk 1% -os nátrium-hipoklorittal és steril vízzel. Ezután egyenként egy steril mikrocentrifuga csőbe helyeztük, mindegyik csőhöz 500 μl folyékony Luria-Bertani (LB) táptalajt adtunk, és a tetemeket steril heggyel maceráztuk. A csöveket 30 ° C-on inkubáltuk 72 órán át. Ezt követően a tenyészet 100 μl-ét 800 μl steril vízzel hígítottuk, és 60 ° -os hősokknak tettük ki egy órával a gombák eltávolítása vagy a spóraképző baktériumok nélkül. Hurkot vettünk, beoltattuk szilárd LB táptalajú Petri-csészébe és 24 órán keresztül inkubáltuk, egyetlen telepet vettünk és HCT-táptalajra oltottuk. A kristályokat előállító törzseket kiválasztottuk, és 60% -os LB-ben és glicerinben tartottuk [11, 18]. A törzseket a B. thuringiensis a Mexikói Morelos Állami Egyetem Biológiai Kutatóközpontjának (LVP-BRC) növényi parazitológiai laboratóriumának gyűjteménye.

Felnőtt atkák

P. cuniculi atkákat nyertünk öt természetes úton fertőzött új-zélandi nyúlból, amelyet intramuszkulárisan adtunk be ketamin/xilazin (40 mg/kg és 10 mg/kg) intramuszkuláris beadásával. Az atkákat tartalmazó rákokat a külső fülből kaparva kaptuk, 50 ml-es csövek aljára helyeztük, és 15 percig 28 ± 2 ° C-on tartottuk, hogy stimuláljuk az atkák vándorlását a varasodásról [19]. Az atkafajtákat sztereomikroszkóppal azonosították fajaik morfológiai jellemzői szerint [20], és csak a felnőtt atkák vándoroltak legalább az 50 ml-es csőben 25 ml magasságnak megfelelő jelig.

A törzsek kiválasztása és spórakristály fehérjék előállítása

Törzsei B. thuringiensis az LVP-BRC törzsgyűjteményéből nyertük. Teszteltünk 12 törzset, melyeket a P. cuniculi, és izolált GP526 törzs Meloidogyne sp, mindegyik HCT-táptalajon nőtt 28 ± 2 ° C-on a teljes sporulációig (72 óra). Az összes fehérjét (spórákat és kristályokat) bakteriológiai hurokkal nyertük fel, és 100 μM PMSF proteáz-gátlót tartalmazó steril vízben szuszpendáltuk. A teljes fehérjekoncentrációt Bradford technikával számszerűsítettük [21].

In vitro toxicitási biológiai vizsgálatok

A korábban leírt merítési technikát alkalmaztuk [22], röviden harminc kifejlett atkát tettünk mikrocsövekbe, és 1 ml fehérjét B. thuringiensis háromszor adtuk hozzá 60 másodpercig. Az atkákat vizet és szűrőpapírt tartalmazó agar petri csészékbe helyeztük, és a kiszáradás elkerülése érdekében Parafilm®-rel lezártuk. A mortalitást mikroszkóppal határoztuk meg és számszerűsítettük, elhalt atkáknak tekintve azokat, akiknek az ecsettel történő stimulálására nem reagáltak, 5 percig állandó mozdulatlansággal [23, 24]. A biológiai vizsgálatokat négyszer megismételtük különböző napokon.

Medián letális koncentráció (LC50) és medián letális idő (LT50)

Dózis-válasz görbét hajtottunk végre, amely minden egyes dózishoz 10 ismétlést hajtott végre, és az LC50 volt a koncentráció, amely ≥50% mortalitást váltott ki. Az LC50-t a Polit Plus 2003 statisztikai programon keresztüli Probit elemzéssel számolták [25]. A mortalitást 24 óránként számszerűsítettük, lineáris regressziós elemzést hajtottunk végre, és az adatokat nettó mortalitásként fejeztük ki [18].

Szövettani elemzés

Az atkákat 10% -os formalinban rögzítettük, a paraffinba ágyazott szöveti technika szerint dolgoztuk fel, és 6 μm-es szövettani metszeteket kaptunk MR2235 Leica mikrotóm alkalmazásával. A metszeteket hematoxilin-eozinnal festették, mindegyik szakaszban tíz mikroszkópmezőt értékeltek, és képelemzővel dokumentálták [26].

Fehérje profil

Öt μg tömény spórakristályt bontási pufferben 10 percig forralunk, majd 5 percig 14 000 fordulat/perc sebességgel centrifugálunk [27]. A felülúszót 10% -os SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) választottuk el, és a gélt Coomassie kékkel festettük.

Eredmények

A törzsek kiválasztása, spórakristály fehérjék előállítása és in vitro biológiai vizsgálatok

13 törzsből nyert összes fehérje kivonat akaricid hatásának elemzése B. thuringiensis, beáztattuk P. cuniculi atkák oldatban 1 mg/ml teljes fehérjével 60 másodpercig (1. ábra). Az 1 mg/ml dózis több tesztelt törzs halálozását indukálta, és különböző időtartamokra tesztelték az expozíció után B. thuringiensis. A kezelés után 24, 48 és 72 órával a GP532 és GP392 törzsek maximális toxicitását 24 órával (11,48 ± 4,6 és 11,11) és 48 órával (18,88 ± 7,92 és 17,037 ± 4,41) találtuk (1. táblázat). 72 óra elteltével a GP532, GP522, GP392, GP871 és GP873 törzseknél tapasztaltuk a legnagyobb toxicitást, 34,62% ± 5,95, 29,44% ± 3,07, 29% ± 3,39, 28,8% ± 3,42 és 27,9% ± 3,98, míg a kontroll csoportban a mortalitás 16,4% ± 2,72 volt.

A toxicitás 72 órával az inkubáció után váltott ki P. cuniculi atkák 60 másodpercig, összesen 13 különböző törzsből származó fehérjékkel B. thuringiensis. A mortalitás százalékának átlaga ± SD látható. *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 és ***P ≤ 0,001, Kruskal-Wallis teszt

A legnagyobb toxicitást kiváltó törzs GP532 volt. Ezután teszteltük a GP532 törzset, növelve az merítési időt 60 másodpercről öt percre. Ezzel a merülési idő növekedésével a toxicitás 34,64% -ról 52,03% -ra növekedését figyeltük meg 72 órás kezelés után, míg a kontroll csoportban nem figyeltünk meg jelentős hatást a mortalitásra (16,46% -ról 16,94% -ra). Ez az 52% -os növekedés több mint 300% -ot jelent (16,94 100% -nak tekintve), ami a GP532 törzs jelentős hatékonyságát mutatja az atkák toxicitásának indukálásában. Alternatív megoldásként teszteltük az ivermektin kereskedelmi célú akaricid hatásosságát, amely a halálozás 98% -át eredményezte a kezelés után 48 órával (2. táblázat).

Medián letális koncentráció (LC50) és medián letális idő (LT50)

Ezt követően a GP532 törzs különböző koncentrációit értékeltük 5 perc merítéskor, és az LC50 meghatározásához a túlélés Probit elemzésével elemeztük az adatokat. Megállapítottuk, hogy az LC50 1,3 mg/ml koncentrációval érhető el (2a. Ábra).

Dózis (a) és időfüggő (b) citotoxicitás, amelyet az atkák 5 percig a GP532 törzs fehérjéibe merítenek (átlag ± SD, *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 és ***P ≤ 0,001, Mann Whitney-teszt)

A GP532 törzs toxicitásának különböző időpontokban történő meghatározása érdekében a TL50-et az elmerülés után minden hat órában értékeltük, és lineáris regressziós analízissel elemeztük, 68 perc TL50-t találtunk 0,94-es korrelációval az atkák 5 perc alatti merítése után (2b. Ábra ).

Szövettani elemzés

Ezenkívül elemeztük az atkák hisztarchitektúráját (3. ábra), és megfigyeltük, hogy a bél peritrofikus mátrixában 1 perc/1 mg/ml GP532-gyel végzett kezelés után dilatált intercelluláris terek vannak. Továbbá a kamrai zónában nagyobb mennyiségű vakuola alakú zsírraktárat figyeltünk meg. Megfigyelték azt is, hogy a kezelt atkák többségének nem volt béltartalma (3c. Ábra), míg a kontrollcsoport atkáinak nem voltak változásai a belekben, és béltartalmuk volt (3a. Ábra). A kontroll atkák kamrai szövete szétszórt zsírraktárakat mutatott (3b. Ábra), míg a kezelt atkákban a bazális membránban kitágult intercelluláris terek jelenlétét, a peritrofikus mátrix membránjában való leválást és a béltartalom teljes kiürülését figyeltük meg (3. ábra). Ábra, nyilak), és a kamrában zsírpárnák jelenlétét figyeltük meg (3d. Ábra, nyilak). Az ivermektinnel kezelt szövetben a vakuolizáció és a zsírlerakódások hiányát észleltük mind a belekben, mind a kamrában (3e, f ábra).

Az irányított hosszmetszetek fényképmikrográfja (a, b), atkákat kezelt a GP532 törzzsel B. thuringiensis (c, d) vagy ivermektinnel (e, f). LU: a bél lumenje, MP: peritrofikus mátrix, EC: ektoperitrofikus tér, MB: bazális membrán, CI: béltartalom, Va: vakuole, VEM: közepes kamra, Ov: petefészek. A nyilak a bél bazális membránjának vagy a kamrában lévő vakuola alakú zsírlerakódások változását jelzik, H & E-X40

Ezenkívül morfológiai változásokat figyeltünk meg a bél oszlopos sejtjeiben a kezelt atkákban (4b. Ábra), míg a kontroll atkák szövetében nem figyeltünk meg változásokat ezekben a sejtekben (4a. Ábra). Az ivermektinnel kezelt atkáknál nem figyeltük meg az általuk kiváltott változásokat B. thuringiensis a bél peritrofikus mátrixában, a kamrai zónában vagy az oszlopos sejtekben (4c. ábra).

Az atka oszlopos sejtjeinek szerkezetének reprezentatív képe P. cuniculi kezelés nélkül (avagy GP532 törzzsel végzett kezelés után B. thuringiensis (b) vagy ivermektin c, és a hozzájuk tartozó képeket a domborműves szűrőn (a1, b1, c1) keresztül. A nyilak jelzik az oszlopos hám kitágult intercelluláris tereinek jelenlétét a peritrofikus mátrix vonatkozásában. Bar = 20 μm

Az atka központi idegrendszerében a synganglion szövettanilag hasonló volt a kontroll csoporthoz (5a. Ábra) mind az ivermektinnel kezelt atkáknál (5b. Ábra), mind az atka központi idegrendszerében. B. thuringiensis (5c. Ábra).

Photomicrograph hosszmetszetek a kontroll atkák idegrendszerében (avagy GP532 törzzsel kezeljük B. thuringiensis (b) vagy ivermektin (c). Syn: Synganglion

GP532 GP532 törzs elektroforetikus profilja B. thuringiensis

Ezt követően elemeztük a GP532 törzs fehérje profilját, megjegyezve, hogy a GP532 törzs fehérje profiljának fő sávjai molekulatömege 25 és 135 kDa között mozog (6. ábra).

GP532 GP532 törzs elektroforetikus profilja B. thuringiensis

Vita

A GP532 törzs elektroforetikus profilja körülbelül 135 kDa fő sávot mutat. Beszámoltak arról, hogy a B. thuringiensis szerovariety kurstaki A HD73 törzs Cry1A, amelynek hozzávetőleges molekulatömege 133,3 kDa [48]. Továbbá, a cselekvés B. thuringiensis méhészeti jelentőségű atkán, Varroa destructor, számoltak be, és a parazita elleni aktív törzs 100% -ban azonos a B. thuringiensis szerovariety kurstaki HD73 törzs [18].

Az atkák esetében a B. thuringiensis ismeretlen. Enzimek, például tripszin, lúgos foszfatáz és néhány aminopeptidáz jelenléte a nemzetség emésztési fiziológiáján Psoroptes [49] arra utalnak, hogy a bél oszlopos sejtjeiben a P. cuniculi, oka lehet a B. thuringiensis protoxinok, mint a Cry1A, amelyek a Lepidoptera kefe határán lévő membrán vezikulákban pórusszerű változásokat idéznek elő. A Cry1A egy specifikus receptoron, az „A receptoron” keresztül hat, egy 170 kDa molekulatömegű aminopeptidáz-N-n, amelyet a bél hámsejtjeinek kefe határmembránjaitól tisztítottak. H. virescens [50]. Más Lepidoptera esetében a receptorok molekulatömege 120, 140 és 170 kDa [51]. Jelen tanulmányban nem elemeztük a fehérjékből izolált specifikus fehérjék toxikus hatását B. thuringiensis az atkán P. cuniculi, a jövőbeni tanulmányok azonban ezekre a vizsgálatokra összpontosítanak, valamint a toxikus fehérje szekvenálására az atka ellen P. cuniculi hogy ismerje a hatásmechanizmusát B. thuringiensis atkákon.

Ban,-ben in vitro tesztek az atka által okozott pusztulás során B. thuringiensis a halál előtt összehúzódásokat figyeltünk meg. Erről a jelenségről máshol is beszámoltak in vitro vizsgálatok ivermektinnel. Emlősökben a hatásmechanizmus modellezése szerint az ivermektin megkötődik, és egy membrán P-glikoprotein transzportálja, és aktiválja a glutamát kaput tartalmazó kloridcsatornákat, zavarva az idegrendszert és az izom működését, fokozva a gátló neurotranszmissziót [36, 52]. Vizsgálatunk során azonban nem figyeltünk meg változásokat a synganglionban, amely az atka idegi impulzusait szabályozza; ezért a kontrakciókat az izom-glikogén lebomlásának tulajdoníthatjuk, ami párosul az B. thuringiensis homeosztázis az atka emésztőrendszerében.

Következtetések

Számos B. thuringiensis törzsek izolálva P. cuniculi ebben a munkában tesztelték in vitro akaricid hatás erre az atkára. Kísérleti körülményeink között a GP532 törzs volt a legnagyobb hatású, LC50 értéke 1,3 mg ml -1, LT50 68 óra volt, és szövettani elváltozásokat okozott az atka bélében..