A baktériumok sokféleségének és bőségének összehasonlítása a nemek között Leptocybe invasa Fisher & La Salle (Hymenoptera: Eulophidae) Kínából

Absztrakt

Háttér

A rovarok számtalan mikroorganizmust hordoznak, amelyek közül sok befolyásolhatja a nemek arányát és manipulálhatja a gazdaszervezet szaporodását. Leptocybe invasa egy invazív kártevő, amely súlyos károkat okoz az eukaliptusz ültetvényekben, valamint a thelytokous parthenogenezis, az alacsony hőmérsékleti ellenállás, a golyvédelem, a generáció átfedés és a kis testtömeg L. invasa hozzájáruljon gyors inváziójához és a népesség növekedéséhez. Az endoszimbiotikus baktériumok összetétele, bősége és nemi különbségei azonban L. invasa továbbra is tisztázatlan. Ezért ez a kutatás a baktériumok közösségének azonosítását tűzte ki célul L. invasa felnőtteket, és hasonlítsa össze a nemek között L. invasa B törzs.

Eredmények

Az Illumina MiSeq platformot használták a baktériumok közösségének összetételének összehasonlítására a nők és a hímek között L. invasa a 16S riboszomális RNS gén V3 – V4 régiójának szekvenálásával. Összesen 1320 működési rendszertan (OTU) került beszerzésre. Ezeket az OTU-kat 24 phylára, 71 osztályra, 130 rendre, 245 családra és 501 nemzetségre osztották fel. Nemzetségi szinten a domináns baktériumok a nőknél és a hímeknél voltak Rickettsia és Rhizobium, illetőleg.

Következtetés

Az endoszimbiotikus baktériumok L. invasa nőstények és férfiak nagyon változatosak voltak. A baktériumok közösségében különbségek voltak L. invasa nemek között, és a hím példányok bakteriális sokfélesége nagyobb volt, mint a női példányokban. Ez a tanulmány a baktériumok közösségének átfogó összehasonlítását mutatja be L. invasa és ezek az adatok átfogó képet nyújtanak a baktériumok közösségéről mindkét nemnél L. invasa különös figyelmet fordítva a nemi baktériumokra.

Bevezetés

A mai napig kevés tanulmány számolt be a L. invasa, amely invazív epét kiváltó rovar. Csak néhány tanulmány vizsgálta átfogóan a faj endoszimbiotikus baktériumait. Wang és mtsai. (2018) 11 törzset tenyésztett a nőstény nőstényekből L. invasa télen hagyományos módszerekkel és három phylába (Firmicutes, Actinobacteriumok, és Proteobaktériumok), három osztály (Bacillusok, Actinobacteriumok, és Gammaproteobaktériumok) és négy megrendelés (Bacillales, Micrococcales, Lactobacillales, és Enterobacterales), amelyek összefüggésben voltak a növekedéssel, fejlődéssel, a táplálkozás anyagcseréjével és az immunitással. Nugnes és mtsai. (2015) különböző populációkban felnőtteknél élő baktériumokat kutatott denaturáló gradiens gélelektroforézis (DGGE) elemzésével, és megállapította, hogy Rickettsia nőstény reproduktív szöveteiben fordult elő L. invasa, kapcsolatra utal a thelytokous parthenogenezissel. L. invasa számtalan baktériumot tartalmaz, és a nemek közötti bakteriális különbségek erős hatással vannak a rovarokra, például a reproduktív szabályozásra (Wang et al., 2018; Nugnes et al., 2015). Ezért az endoszimbiotikus baktériumok általános összetétele és bősége L. invasa és a nemek közötti különbségeket fontos tanulmányozni.

Ebben a tanulmányban az endoszimbiotikus baktériumok a L. invasa a V3 – V4 régió 16S rRNS szekvenálásával azonosítottuk, hogy megvilágítsuk a belső baktériumösszetételüket. A nőstényeket és a férfiakat is összehasonlították az endoszimbiontok szexuális különbségeivel. Ezek az eredmények értékes baktériumkészletet jelentenek a L. invasa és tovább hozzájárul reproduktív stratégiáinak és inváziós mechanizmusainak megértéséhez.

Anyagok és módszerek

Rovar mintavétel

A DH 201-2 ágai (Eucalyptus grandis × E. tereticornis) (Myrtales: Myrtaceae) L. invasa eltávolították a Guangxi Egyetem Erdészeti Főiskolájának oktatási és kísérleti bázisáról (Guangxi Zhuang Autonóm Terület, Nanning város, Nanning város, 2018. július-augusztus). Az ágakat műanyag palackba töltötték vízzel a frissesség megőrzése érdekében, és szobahőmérsékleten zárt hálós ketrecbe (40 cm × 40 cm × 80 cm) helyezzük át, hogy a felnőttek ne menekülhessenek el. A műanyag palackban lévő vizet naponta újították fel, amíg nem keletkezett L. invasa felnőttek. A nemeket morfológiai megfigyeléssel azonosították (Zheng et al., 2014b).

DNS-kivonás

Ötven felnőtt minden nemből L. invasa 12 órán belül újonnan megjelenteket 6 órán át éheztettük. Ezután mindkét mintát kívülről 75% -os etanollal sterilizáltuk 2–5 percen keresztül, és háromszor öblítettük sterilizált vízzel, hogy eltávolítsuk a mikrobákat a felszínen. Az egyes minták összes baktérium DNS-ét Power Soil DNS Isolation Kit (MO BIO Laboratories) segítségével extraháltuk a gyártó utasításainak megfelelően. A DNS minőségét és mennyiségét 260 nm/280 nm és 260 nm/230 nm arányokkal értékeltük. Ezután a minősített DNS-t -80 ° C-on tároltuk további feldolgozás céljából. Az egyes egyedek DNS-ét Chelex-100 és proteináz K alapú módszerrel extraháltuk (Gebiola et al., 2009).

A bakteriális 16S rRNS gén PCR-amplifikációja és klónozása

Bioinformatika és statisztikai elemzés

A szekvenálás után a HiSeq szekvenálással kapott PE leolvasásokat átfedéssel egyesítettük, hogy nyers címkéket kapjunk. A tiszta címkék megszerzéséhez a nyers címkéket eltávolítottuk, válogattuk és elválasztottuk a Trimmomatic (0.33 verzió) alkalmazásával. A fennmaradó szekvenciákat szűrtük a redundancia szempontjából, és az egyes minták összes egyedi szekvenciáját operatív taxonómiai egységekbe (OTU) csoportosítottuk 97% -os hasonlóság alapján. Alacsony bőségű OTU-kat azonosítottak és elimináltak az UCHIME v4.2 használatával. Az OTU-k taxonómiai hozzárendelését a Silva referencia-adatbázissal végeztük. A fajbőség táblákat a QIIME generálta, és az egyes taxon kategóriák közösségi struktúráit R szoftverrel ábrázoltuk. A baktériumok relatív bőségét százalékok határozták meg.

A Chao1 gazdagság és az ACE gazdagság becslésein, valamint a Simpson és Shannon diverzitás indexeken alapuló alfa sokféleséget a mothur v.1.11.0 program segítségével értékeltük. Ezek közül a Chao1 és az ACE tükrözte a mintákban a fajgazdagságot, a Shannon-index a közösség sokféleségét, a Simpson-index a fajok dominanciáját a közösségben, a lefedettségi index pedig azt a mértéket tükrözte, amelyben a szekvenálási eredmények a tényleges összetételt reprezentálták. a mintákban található mikroorganizmusok.

Molekuláris jellemzés és filogenetikai elemzések

A COI-t az LCO1490 előreindító és a HCO2198 reverz primer felhasználásával amplifikáltuk (Nugnes et al., 2015). A 16S rRNS génje Rickettsia az S1 táblázatban felsorolt primerek alkalmazásával amplifikáltuk. Mindkét gén (COI és 16S rRNS) PCR-programja a következő volt: 3 perc kezdeti denaturálás 94 ° C-on, 30 ciklus 94 ° C-on 30 másodpercig, 55 ° C 30 másodpercig és 72 ° C 1 percig és 5 perc végső meghosszabbítás 72 ° C-on. A PCR-termékeket 1,0% -os agarózgél-elektroforézissel figyeltük meg, és az amplifikált fragmenseket közvetlenül a TsingKe Biological Technology Co., Ltd., Peking, Kína szekvenálta. Más régiók reprezentatív szekvenciáit letöltöttük a GenBank-ból, és a szekvenciák összehangolását a Clustal X alkalmazásával befejeztük. A szomszédos csatlakozási módszert alkalmaztuk konszenzusos filogenetikai fa létrehozására MEGA7 szoftverrel. A filogenetikai fa ágtartásának értékelésére 1000 ismétlés bootstrap elemzését végeztük.

Csatlakozási számok

Az adatok az NCBI SRA címen érhetők el, hozzáférési szám: SRR9591039, SRR9591038. Az ebben a vizsgálatban meghatározott COI és 16S rRNS szekvenciákat az MN524231 és az MN524230 azonosítójú GenBank adatbázisba rakták le.

Eredmények

Neme L. invasa példányok ebben a tanulmányban

Az összes női és férfi példányt a morfológia alapján azonosítottuk. Ebben a vizsgálatban összesen 656 nőstényt és 51 férfit gyűjtöttek össze (S2. Táblázat). Az anyagokat a Guangxi Egyetem Erdészeti Védelmi Laboratóriumában, Nanning 530004, Kína.

Sorrend és osztályozás

Összesen 533 266 nyers címkét (370 680 hímtől és 162 586 nősténytől) kaptunk L. invasa, és 476 235 tiszta címkét (328 833 hímtől és 147 402 nőstől) állítottunk elő (S3. táblázat), amelyeket 97% -os hasonlóság alapján különböző OTU-kba soroltunk. A 476 235 tiszta címke közül összesen 1320 OTU-t nyertek; ebből az 1320 OTU-ból 154 mindkét nemnél közös volt, 38 és 1128 pedig női és férfi felnőttekre volt jellemző (1. ábra).

1. ábra: Az OTU eloszlásának Venn-diagramja Leptocybe invasa női és férfi felnőttek.

Az alfa sokféleség elemzése

Az alfa változatosságot öt mutatóval becsültük: Chao1, Shannon index, Simpson index, ACE és lefedettség. Az 1. táblázat eredményei azt mutatják, hogy a baktériumok L. invasa a felnőttek mindkét nemben változatosak voltak. A Chao1 (229,50 vs 1282,00) és az ACE (212,84 vs 1282,28) értékek alacsonyabbak voltak a nőknél, mint a férfiaknál. Jó egyetértés volt megfigyelhető a Simpson és a Shannon indexek között is. A Shannon-index (0,59 vs 6,13) alacsonyabb volt a nőknél, mint a férfiaknál, míg a Simpson-index (0,85 vs 0,01) magasabb volt a nőstény darazsaknál, mint a hím darazsaknál, ami azt jelzi, hogy a férfiak baktériumközösségének változatossága magasabb, mint a nőknél. A lefedettség közel 100% volt mind a férfiak, mind a nők esetében, ami nagyobb valószínűséget mutat a baktériumok kimutatására, mint a nem észlelhető baktériumok.

Minta ACE Chao1 Simpson Shannon lefedettség

Női	212,84	229.50	0,85	0,59	1.00
Férfi	1282.28	1282,00	0,01	6.13	1.00

A közösség összetételének és fajgazdagságának elemzése

A baktériumok összetétele és a fajok száma mindkét nemben L. invasa az OTU-k eredményei alapján elemeztük (a bőség nagyobb, mint 0,1%) (2. táblázat, 2. ábra). Összesen 24 phylát detektáltak és osztályoztak a mintákban. Proteobaktériumok volt a domináns baktériumok menete a nőknél és a férfiaknál, a baktériumok 95,63% -át, illetve 34,99% -át tették ki. Nemzetségi szinten, Rickettsia (93,67% -os bőséggel) és Rhizobium (5,73% -os bőséggel) domináns baktériumok voltak a nőknél és a férfiaknál. Emellett figyelemre méltó volt, hogy a bőség Rickettsia kevesebb mint 1% volt a férfiaknál (3. táblázat).

Minta menedékjogi osztályrend családcsalád

Női	10.	26.	44.	76	122
Férfi	24.	69	127.	238	487
Nőspecifikus	0	2	3	7	14
Férfispecifikus	14	45	86	169	379
Nemi közös	10.	24.	41	69	108.
Teljes	24.	71.	130	245	501

2. ábra: A top 10 baktérium relatív bősége a törzs (A), a (B) osztály, a (C) rend, a család (D) és a genu (E) szintjén nőstényeknél és hímeknél Leptocybe invasa.

Nemzetség nő (%) férfi (%)

Rickettsia	93,67	0,04
Nem kulturált_baktérium_f_Bacteroidales _S24-7_csoport	0,71	5.37
Lactobacillus	0,31	2.38
Sphingomonas	0,25	2.62
Bacteroides	0.11	1.65
Fusobacterium	0,04	3.49
[Eubacterium] _koprostanoligének _csoport	0	2.34
Rhizobium	0	5.73
Ismeretlen	0	0,01
Xanthomonas	0	1.83
Mások	4.48	66,68
Besorolatlan	0,44	7.86

Molekuláris jellemzés és filogenetikai elemzések

A Genebankkal való összehasonlítást követően a L.invasa ebben a kutatásban a B törzs volt, és a COI filogenetikai fája is jelezte, hogy a kutatás populációja a származáshoz tartozik (3. ábra). A 16S rRNS gének filogenetikai elemzése során kiderült, hogy a Rickettsia nak,-nek L. invasa a szimbiontusok a Rickettsia átmeneti csoport (4. ábra).

3. ábra: Különböző filogenetikai fa Leptocybe invasa COI szekvenciák alapján.

4. ábra: Különbözőek filogenetikai elemzése Rickettsia csoportokat a 16S rRNS szekvenciájuk alapján.

Vita

A baktériumok közötti különbségek női és férfi felnőttek között

Ez a kutatás feltárta, hogy a baktériumok benne rejlenek L. invasa nagy diverzitással rendelkezett, és sok endoszimbióta baktériumot jegyeztek fel először ebben a fajban. Alfa-diverzitás-elemzés alapján a férfiaknál az endoszimbióta baktériumok diverzitása magasabb volt, mint a nőknél (1. táblázat). A hím és nőstény baktériumközösségének változása részben magyarázható az élettani szerkezet és a két nem közötti különbségekkel. L. invasa; konkrétan a nőstény darazsaknak petefészke van, amelyekben rengeteg Rickettsia, lehetővé téve a nemzetség számára, hogy más bakteriális fülkéket foglaljon el, mint a hímeknél (Nugnes et al., 2015). Egy másik lehetőség az, hogy a rovarok veleszületett és szisztematikus immunválaszokat indítanak el, hogy megbirkózzanak a mikrobák gyarmatosításával (Leulier & Royet, 2009), és a nők immunrendszere erősebb, mint a hímeké (Kurtz et al., 2000).

A baktériumok összehasonlítása más rovarokban található baktériumokkal

A baktériumközösség elemzése menedékjogi szinten azt mutatta Proteobaktériumok volt a domináns csoport a női és férfi darazsakban, és Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteriumok és Fusobacteriumok szintén jegyzetekkel ellátták. Korábbi tanulmányok azt tárták fel Proteobaktériumok dominánsak voltak a többi Hymenoptera-ban, mint pl Apis cerana és levélvágó hangyák (Ahn et al., 2012; Zhukova et al., 2017). Ellentétben, Firmicutes és Bacteroidetes a termeszek (Miyata és mtsai., 2007; Xiang és mtsai., 2012) és a méhek béljében kimutatott fő bakteriális phylák voltak (Mohr & Tebbe, 2006). Firmicutes és Actinobaktériumok voltak a domináns baktériumok A. mellifera és darázs (Ahn et al., 2012; Praet et al., 2018).

Domináns endoszimbióta baktériumok feltételezett funkciói L. invasa

A szekvencia-hasonlóság keresése feltárta Rhizobium volt a domináns baktérium férfi felnőttekben (2. ábra, 3. táblázat). Rhizobium különféle enzimeket állít elő cellulóz- és pektin-hidrolizáló aktivitással, amelyek hidrolizálni tudják a növény sejtfalának glikozidvázat, és nagyon fontos szerepet játszanak a szimbiózisban. Rhizobium és hüvelyes növények (Robledo et al., 2008; Huang et al., 2018). Rhizobium egyes fitofág rovarok béljében kimutatott endoszimbiont, amely segíthet a gazdaszervezetnek az élelmiszerben hiányzó nitrogéntartalmú anyagok szintetizálásában (Russell et al., 2009).

Következtetések

E tanulmány nagy áteresztőképességgel elért eredményei feltárták a baktériumok sokféleségét és a nemek közötti különbségeket L. invasa, bőséges endoszimbióta baktériumközösségre utal, és néhány baktériumról beszámoltak L. invasa először. Sőt, a hímek változatosabb baktériumközösséggel rendelkeztek, mint a nőstények. A következő kutatásnak az ebben a tanulmányban található baktériumokra kell összpontosítania, hogy azonosítsák specifikus ökológiai funkcióikat és a specifikus nemi alapú szabályozási mechanizmust Rickettsia előfordulása L. invasa.