Bénulással, gyulladással és súlyvesztéssel járó genetikai lokuszok azonosítása egér kísérleti autoimmun encephalomyelitisben

Jeffrey A. Encinas, Marjorie B. Lees, Raymond A. Sobel, Cammie Symonowicz, Howard L. Weiner, Christine E. Seidman, JG Seidman, Vijay K. Kuchroo, Bénulással, gyulladással és súlyvesztéssel járó genetikai lokuszok azonosítása kísérleti autoimmun encephalomyelitis, International Immunology, 13. évfolyam, 3. szám, 2001. március, 257–264. oldal, https://doi.org/10.1093/intimm/13.3.257

Absztrakt

Bevezetés

A kísérleti autoimmun encephalomyelitis (EAE) egy általánosan vizsgált autoimmun betegség, mivel viszonylag gyors indukciós ideje, és mivel fő klinikai megnyilvánulása, a bénulás egyszerűen szemrevételezéssel értékelhető. A betegséget mielinfehérjékkel történő immunizálás indukálja, és köztudott, hogy azokat a T-sejtek közvetítik, amelyek a központi idegrendszerbe (CNS) közlekednek, és olyan eseményeket indítanak el, amelyek szöveti sérüléshez és klinikai tünetekhez vezetnek. Fejlődését, súlyosságát és időbeli lefutását komplex genetikai és környezeti tényezők befolyásolják, amelyeket nem teljesen értenek (1, 2).

Az EAE iránti fogékonyság korábbi genetikai összekapcsolási elemzésében a fogékony SJL/J egerek és a rezisztens B10.S egerek keresztezésével nem találtunk olyan genetikai lókuszt az SJL/J genomból, amelyre feltétlenül szükség volt az érzékenységhez (3). Ugyanakkor több olyan lokuszt azonosítottunk, amelyek bizonyítékot mutattak a fogékonysághoz való kapcsolódásra. Ebben a vizsgálatban 68 nagymértékben fogékony backcross egér genotípusát hasonlították össze 68 betegség-rezisztens backcross egér genotípusával genom-szkenneléssel, az összes kromoszómát lefedő 130 mikroszatellit markert használva. Az összekapcsolás elemzéséhez a betegségre való fogékonyság tulajdonságát kvalitatív tulajdonságként kezeltük, ahol az érintett egereket fogékonynak, a nem érintett egereket pedig nem fogékonyaknak tekintettük. Ennek eredményeként találtak egy lokuszt a 2. kromoszómán, és egy másikat a 3. kromoszómán, amely érzékenységgel társult P = 0,001-nél. Nyolc másik régiót találtak a P 4–7 gyenge asszociációival, és azt sugallja, hogy az EAE-érzékenység poligén tulajdonság, amelyben a különböző géntermékek expressziójában vagy aktivitásában jelentkező kicsi különbségek együttesen meghatározzák a betegség valószínűségét.

Az EAE iránti érzékenységet szabályozó genetikai tényezők további tanulmányozásához ezért új kapcsolási elemzést végeztünk az EAE különböző betegségfenotípusainak felhasználásával, és növeltük az elemzésben használt egerek számát. A genetikai elemzés erejét növelte a betegség úgynevezett köztes fenotípusainak vizsgálata, amelyeket a betegséghez társuló lókuszok egy kis részhalmaza jobban befolyásolhat, és ahol lehetséges, megkísérli a kvantitatív tulajdonság-lokusz-elemzést alkalmazni. A változó fokú érzékenységű egereket fenotipizáljuk klinikai tüneteik súlyossága szerint, és genotipizálunk minden olyan kromoszóma-helyszínen, ahol a kezdeti elemzés során összefüggéseket találtak a betegségre való fogékonysággal. Ez lehetővé tette számunkra, hogy jelentős összefüggéseket találjunk a betegségekkel, és lehetővé tettük az egyes lokuszok által érintett tulajdonságok hozzávetőleges meghatározását.

Ehhez az elemzéshez 298 (SJL/J × B10.S) F1 × B10.S hátkeresztes egeret használtak, amelyek betegség súlyossága változó volt, az enyhe vagy semmilyen klinikai betegségtől az összes végtag súlyos bénulásáig. A betegség súlyosságát úgy mértük, hogy feljegyeztük a megjelenés napját, pontoztuk a bénulás mértékét, mértük a test tömegének változásait és értékeltük a központi idegrendszeri gyulladás mértékét. Az előzetes elemzés szerint az EAE-érzékenységet befolyásoló géneket hordozó kromoszómák genotipizálását mikroszatellit markerekkel végeztük.

Míg korábban szuggesztív bizonyítékokat mutattunk ki arról, hogy a 2. és 3. kromoszómán található lókuszok kapcsolódnak az EAE iránti érzékenységhez, most megmutatjuk, hogy a 2. kromoszóma lókusz jelentősen befolyásolja az EAE-vel kapcsolatos súlycsökkenést, és hogy a 3. kromoszóma lókusz befolyásolja a bénulás kialakulását. Ezenkívül azonosítottunk egy érdekes öröklődési mintát, amelyben a nőstény hátkeresztes egerek nagyon eltérő választ mutattak az immunizálásra attól függően, hogy F1 szülőjük hím vagy nőstény volt-e. Miután ezt felismerték, elemzést végeztek az egerek részhalmazain, hogy kihasználják ezt a különbséget, és a 8. kromoszóma centromerikus végén feltártak egy új lokuszt, amely jelentősen kapcsolódott a bénulás kialakulásához és a központi idegrendszer gyulladásának mértékéhez.

Mód

A szülői B10.S és SJL/J tenyészpárokat a Jackson Laboratóriumból (Bar Harbor, ME) szereztük be, és az E. K. Shriver Centerben (Waltham, MA) tartottuk. (B10.S × SJL/J) F1 és (F1 × B10.S) hátkeresztes egereket tenyésztettek ebben a létesítményben, és az összes egeret azonos körülmények között tartották fenn. Az F1 és a backcross tenyésztést anélkül állítottuk elő, hogy a B10.S törzset alkalmazták apának vagy anyának a párzás során.

Fenotipizálás

Az egereket akkor áldoztuk fel, amikor 4-es klinikai pontszámot mutattak, vagy amikor elkezdtek felépülni a betegségből, amit súlygyarapodás és a klinikai pontszám további növekedése nem jelez. Azokat az egereket, amelyeknél nem alakult ki bénulás, az immunizálást követően a 28. és 30. nap között feláldoztuk. Az egerek agyát és gerincvelőit vettük szövettani vizsgálatra, a májat pedig DNS-forrásként vettük fel a genotipizáláshoz. A vizsgálat során spontán elpusztult egereket kizárták az elemzésből, mivel a szövettani értékeléshez a szövetek minősége rossz volt, és az a bizonytalanság, hogy a pusztulást az EAE okozta. Az agyakat és a gerincvelőket 10% -os foszfáttal pufferolt formalinban rögzítettük, és a paraffinba ágyazott szakaszokat fénymikroszkópos fényfestéssel luxol gyorskék-hematoxilin és eozin festettük. A szövettani betegséget az agyhártya és a parenchima gyulladásos gócainak számolásával számszerűsítettük, ahogy azt korábban leírtuk (8).

Genotipizálás

Az összes kezelt egérből májat vettünk, és –70 ° C-on lefagyasztottuk. A DNS-t úgy állítottuk elő, hogy a homogenizált szöveteket proteináz K-vel emésztettük, és fenol – kloroform extrakciót hajtottunk végre a szokásos protokollok szerint (9). A mikroszatellit marker lókuszokat a

A hátkeresztes állatokat minden lokuszon homozigóta vagy heterozigóta pontozással értékeltük, összehasonlítva amplifikált termékeik méretét a szülői beltenyésztett törzsek mindegyikének egyidejűleg amplifikált termékeivel.

Statisztika

Az összekapcsolás elemzését a Map Manager QT (http://mcbio.med.buffalo.edu/mmQT.html) számítógépes programmal végeztük, amely lineáris regressziót használ a kvantitatív tulajdonság lokuszok intervallum térképezéséhez. A program kimenete linkage ratio statistic (LRS) formájában jelenik meg, amely egy follows 2 eloszlást követ és könnyen konvertálható P értékre. Az LRS átalakítható Lod-ponttá, ha elosztjuk 2ln10-gyel. A Lander és Kruglyak által javasolt irányelveket követve a P –4 (Lod pontszám 3.3) tekinthető a szignifikáns összekapcsolódás határának, a P –3 (Lod pontszám 1.9) pedig a kötődésre utalónak (13). A Student-féle t-próbát alkalmaztuk az egérhalmazok közötti kvantitatív tulajdonságok átlagának különbségeinek értékelésére. A többszörös összehasonlításokat Bonferroni módszerrel korrigálták. A normalitást egy normál kvantilis grafikon határozta meg.

Eredmények

Bénulás, a megjelenés napja, a gyulladás és a fogyás, mint EAE fenotípus

A kvantitatív tulajdonságelemzések azt feltételezik, hogy több allél járul hozzá egy tulajdonsághoz, így az allélok véletlenszerű választékával a tulajdonság különböző nagyságrendje normális eloszlást fog követni egy populációban (14). Ezeket a különböző tulajdonság-nagyságokat ezután korrelálhatjuk a genotípussal, hogy meghatározzuk a lókuszok kapcsolatát a tulajdonsággal. Az EAE-vel kapcsolatos, általunk mért tulajdonságok közül a súlycsökkenés jó kvantitatív tulajdonság volt, míg a bénulás, a kezdet napja és a gyulladás az értékelésükhöz kapcsolódó korlátozásokkal jártak, amelyek befolyásolták képességüket normál kvantitatív tulajdonságként való felhasználásra.

A második tulajdonság, a paralitikus betegség korai kialakulása jelezheti az önmagára irányuló immunválasz aktiválásának alacsony küszöbét, az immunszabályozó mechanizmusok hiányát, a CNS-be jutó gyulladásos sejtek gyenge gátját vagy fokozott érzékenységet az immun által közvetített károsodásokra. a központi idegrendszerben. A bénulás súlyosságának méréséhez hasonlóan azonban a bénulás kezdetének napja csak az érintett egereknél mérhető. Ezért a kezdet napját kvantitatív tulajdonságként elemeztük, de azokat az egereket, amelyek nem mutattak bénulás jeleit, kizárták az elemzésből.

A harmadik tulajdonság, a központi idegrendszer gyulladása az immunizálás után a sikeres immunaktiváció jele. A fogékony egerek azonban általában a klinikai betegség kezdeti epizódját tapasztalják, amelyet kiszámíthatatlan időközönként bekövetkező remissziók és relapszusok követnek, valamint a betegség mellett a központi idegrendszeri viaszokban és gyengeségekben gyulladás lép fel (17). Ezenkívül a bénulás súlyosságának változása kiszámíthatatlan ideig elmarad a szövettanilag megfigyelhető elváltozások számában bekövetkezett változásoktól (18). A gyulladásos gócok számának egyetlen időpontban történő mérésével a gócok száma jelentősen csökkenhet a maximális értéktől, sok esetben, ha az egerek már elkezdtek felépülni, amikor a központi idegrendszeri szövetüket vették, és ezért nem feltétlenül reprezentatív a bekövetkezett gyulladás. Emiatt az elemzés során a központi idegrendszer gyulladásának jelenlétét vagy hiányát, nem pedig annak mértékét használták fel.

A negyedik tulajdonság, a súlyos fogyás, az EAE közös jellemzője, amely általában bénulással jár. A fogyás valószínűleg a gyulladásos mediátorok (19–21) mellékhatásainak köszönhető, de az étvágy elnyomásából vagy a megfelelő hidratálás képességéből is fakadhat. Az immunizálás után az egereket rendszeresen lemértük, lehetővé téve a betegség által kiváltott maximális súlycsökkenés megközelítését. Mivel a betegségre fogékony egerek az immunizálás után 8–10 nappal kezdenek fogyni, a 7. napon vettünk egy kezdeti súlyt, majd ezt követően minden második nap lemértük az egereket a 28. napig. Azokat az egereket, amelyeknél bénulás alakult ki, addig mértük, amíg ki nem alakult egy klinikai pontszám 4 vagy a betegségből való kilábalás jeleit mutatta. A kezdeti testtömeg-különbségek kiigazításához a súlycsökkenést a test tömegének százalékos változásaként számoltuk ki a 7. napon vett súlytól. A 298 egér súlycsökkenésének mennyisége normális folyamatos eloszlást követett az 1. ábrán látható módon. Ezért a tömeg változásának mint kvantitatív tulajdonság elemzését végeztük az egereken.

Összekapcsolási elemzés

A kapcsolat elemzését 298 backcross egérrel végeztük a bénulás, a gyulladás, a fogyás és a bénulás kezdetének jellemzőire. Az egyik lokusz a 2. kromoszóma telomer végében (a D2Mit200 mikroszatellit markernél), azon lokusz közelében, amelynél korábban szubsztitív kötést találtunk a fogékonyságra, szignifikáns kapcsolatot mutatott a testsúlycsökkenéssel P = 6,7 × 10 –5 értéknél (2. ábra). A 8. kromoszómán a D8Mit84 közelében megfigyelhető volt a testsúlycsökkenéssel való összefüggés (P = 1,4 × 10 –3). Szuggesztív kapcsolatot is találtunk a 8. kromoszómán a D8Mit226 közelében (P = 4,3 × 10 –4) és a D3Mit40 közelében a 3. kromoszómán (P = 2,2 × 10 –3) (2. ábra). Nem volt látható kapcsolat a gyulladással vagy a bénulás kezdetével, amely elérte a szuggesztív kapcsolat szintjét.

A betegség-fogékonyság öröklődési mintázatának elemzése feltárta, hogy markáns különbség mutatkozott a betegség súlyosságában, amikor az egéreket, amelyek nőstény F1 egerek hím B10.S egereiből jöttek létre, összehasonlítottuk az egerekkel, amelyek hím párosításból jöttek létre F1 egerek nőstény B10.S egerekkel. Ez a különbség akkor volt a legegyértelműbb, ha a két csoport súlycsökkenését hasonlítottuk össze (1. táblázat). A B10.S anyától született egereknél az immunizálás után lényegesen nagyobb a súlyvesztés, mint az F1 anyától (P = 0,0029). Ez a különbség szinte teljes egészében a nők körében mutatkozott meg, ahol a B10.S anyától születettek súlya átlagosan 3,16% -kal csökkent, míg az F1 anyától születettek súlya átlagosan 6,78% -kal nőtt (P = 1,2 × 10 –4).

Az egerek szülői különbségeinek ellenőrzésére összekapcsolási elemzést végeztünk az egerek két alcsoportján: a B10.S anyáktól született egereken és az F1 anyáktól született egereken. A B10.S anyától született egerek között a 8. kromoszóma centromerikus végén lévő lókusz (D8Mit3) szignifikánsan összefüggött a bénulással (P = 8,2 × 1 0 –6) (3. ábra). Ez a lokusz szignifikáns kapcsolatot mutatott a gyulladással is (P = 7,0 × 1 0 –5). A bénulással való szuggesztív kapcsolatot a D8Mit84-nél a 8. kromoszóma közepe közelében találtuk (P = 1,6 × 1 0–3) és a 18. kromoszómán a D18Nds1 közelében (P = 1,9 × 1 0 –3). Az F1 anyától született egerek között nem találtak kapcsolatot az EAE tulajdonságokkal, ami a teljes egérkészlet elemzésén túlmutató szignifikancia szintet növelte. Ezenkívül az egerek egyik alcsoportjában sem volt utaló utalás a betegség megjelenésének napjára.

Vita

Az SJL/J egerek nagyon érzékenyek az EAE indukciójára CFA-ban végzett PLP-vel történő immunizálással (22). Az epitóp-térképészeti vizsgálatok megállapították, hogy a PLP 139–151 peptidje fő encephalitogén epitóp ennek a törzsnek (23, 24), és hogy a PLP139–151-et az SJL/J egerek H-2A s II. erős affinitás (25). A B10.S egerek, amelyek szintén expresszálják a H-2A s MHC II. Osztályú molekuláját, nagyon ellenállnak az EAE indukciójának akár teljes PLP-vel, akár PLP139–151-gyel. Az EAE iránti érzékenység ezen különbségének alapjainak meghatározásához kereszteztük a két törzset, és az F1 utódokat B10.S-re kereszteztük, hogy genetikai elemzésre alkalmas egereket állítsunk elő. Ezután teszteltük az utódok fogékonyságát a PLP139–151 által kiváltott EAE-re. A szintetikus PLP139–151 használata immunogénként kiküszöbölte azokat a különbségeket, amelyek az egész gerincvelő homogenátumának vagy a tisztított PLP-nek a felhasználásából származhatnak, amely kórokozókat, valamint további immunogén epitópokat tartalmaz.

Korábbi, ezen a kereszten végzett vizsgálatunk azt mutatta, hogy a betegség súlyosságának különböző mértékei, azaz a bénulás, a gerincvelő gyulladása és a súlycsökkenés jól korreláltak egymással, de az azonos bénulási fokú állatok között nagy eltérés figyelhető meg gyulladásos gócok és a fogyás mértéke (3). Figyelembe véve, hogy az EAE-érzékenység poligénesen meghatározott tulajdonság, ezeknek a szubfenotípusoknak a változása tükrözheti a betegség kialakulásához hozzájáruló több komponens részhalmazainak heterogén öröklődését. A betegség súlyosságának különböző mértékeinek külön elemzése tehát növelheti az egyes járulékos komponensek boncolásának képességét azáltal, hogy kisebb számú, a tulajdonságot befolyásoló génre összpontosít. Ezenkívül, miután meghatározták a betegség fogékonyságához hozzájáruló genetikai lokuszt, a lokusz és a betegség egy specifikus alfenotípusának társítása elősegítheti a jelölt gének szűkülését a lokuszon belül. Ezt szem előtt tartva, genetikailag elemeztük az egereket az EAE különböző alfenotípusainak mindegyikére.

A kvantitatív vonás lokusz elemzés szintén növelheti a kapcsolati elemzés erejét azáltal, hogy korrelálja a lokusz öröklődésének gyakoriságát a kvantitatív tulajdonság nagyságával. Az általunk mért tulajdonságok közül a betegség indukcióját követő fogyás volt a legalkalmasabb mennyiségi tulajdonságként történő elemzésre. Ezen új elemzések eredményeként azonosítani tudtuk a 2. kromoszóma telomer végében található lokuszt, amely szignifikánsan kapcsolódott a fogyáshoz. Ez nagymértékben javította ennek a lokusznak az EAE-hez való kapcsolódásának valószínűségét ahhoz képest, amit korábban ezen a lokuszon találtak, amikor az elemzést a betegség fogékonyságával, mint a társított tulajdonsággal végezték. Ezen túlmenően, elsősorban az elemzés során felhasznált egerek számának növekedése miatt, a 8. kromoszóma közepén lévő hely egy szuggesztív kapcsolatot mutat a bénulással, ahol korábban csak gyenge kapcsolat volt látható. A 3. kromoszómán a lokusz nem érte el a szignifikanciát, de külön tanulmányokban már korábban megerősítettük az EAE súlyosságát befolyásoló lokusz jelenlétét az IL2 gén közelében (D3Mit21 közelében) a NOD-ban. bizonyíték a NOD.B6-Idd17, Idd10, Idd18 kongén egerek felhasználásával a 3. kromoszóma közepe közelében lévő lókuszra (nem publikált adatok).

Bár ezt az elemzést meglehetősen nagy számú egérrel végezték, az elért kapcsolási pontszámok alacsonyak voltak, és csak egy lokusz érte el a szignifikáns kapcsolódás szintjét. Ez az eredmény hasonló ahhoz, amit mások találtak (4, 5), akik megpróbálták elemezni az EAE genetikai alapját. Bár lehetséges, hogy ez annak tudható be, hogy az EAE-érzékenységhez hozzájáruló genetikai lókuszok száma nagyon nagy, és mindegyik lókusz csak kis mértékben járul hozzá az általános érzékenységhez, azt is fontolóra vettük, hogy előfordulhat, hogy a betegség zavarja az elemzést.

Feltételezve, hogy egy adott szülőtől örökölt nem-mendeli tényező megváltoztathatja a betegség fenotípusát, elemeztük az egereket külön-külön két csoportban a származás szerint, hogy kiküszöböljük ezt a zavaró hatást. Ennek eredményeként a B10.S anyák utódainak elemzésében a 8. kromoszóma centromere közelében lévő lókusz mind a bénulással, mind a gyulladással szignifikáns kapcsolatot mutatott, a 18. kromoszómán pedig egy bénulással mutató szuggesztív kapcsolat.

Az EAE-t kontrolláló lokuszok és végső soron a gének azonosítása segít tisztázni e betegség kórokozó mechanizmusait. Mivel azonos vagy analóg mechanizmusok vehetnek részt az emberi immunválaszokban, ez az információ új megközelítésekhez vezethet a sclerosis multiplex és más autoimmun betegségek kezelésében.

Az EAE fenotípusainak összehasonlítása a hátsó keresztes egerek alcsoportjaiban, szülők és nemek szerint felosztva.