A bioaktív peptid javítja az étrend által kiváltott májzsír-lerakódást és a hepatocita-gyulladásos reakciót az öregedő SAMP8 egerekben

Chih-Yang Huang, Ph.D.

Graduate Institute of Basic Medical Science, Kínai Orvostudományi Egyetem 91. sz,

Hsueh-Shih út, 40402 Tajcsung (Tajvan)

Tel. + 886-4-22053366, fax + 886-4-22333641, e-mail [email protected]

Kapcsolódó cikkek a következőhöz: "

Facebook
Twitter
LinkedIn
Email

Absztrakt

Bevezetés

A NAFLD progressziója a NASH-ra (nem alkoholos steatohepatitis) nagymértékben támaszkodik a mögöttes gyulladásos eseményekre, amelyeket a HFD táplálhat [10, 11]. A HFD-nek való kitettség ekkor aktiválja a kulcsfontosságú májproinflammatorikus mediátorokat, például a p38 MAP kinázt, TNF-α, IL-6 [12], egyidejűleg károsítja az AMPK-t, amely a máj metabolikus homeosztázisának útját szabályozó fő jelátviteli molekula [13]. Az AMPK máj-specifikus újraaktiválása elnyomja a NAFLD megjelenését [13]. Az AMPK gátlását máj gyulladásos ingerek jelezhetik [10, 14]. Bármely terápiás kísérlet az öregedő májban fellépő gyulladásos ingerek csökkentésére, a sejtenergiát érzékelő szabályozók, például az AMPK működésének fokozásával vagy helyreállításával együtt, jótékony hatást mutathat a NAFLD fejlődésével szemben. A közelmúltbeli farmakológiai fejlődés ellenére azonban még mindig nem áll rendelkezésre ajánlott gyógyszeres terápia a NAFLD-betegek számára, ideértve az időseket is [15]. A NALFD kapcsolódó kockázati tényezőit azonban a koleszterinszint csökkentő szerekkel vagy a társult betegségek specifikus gyógyszerekkel kezelik, az életmód és az étrend megváltoztatása mellett [4, 16, 17]. Növényi bioaktív vegyületeket alkalmazó alternatív stratégiákról kiderült, hogy késleltetik a NAFLD fejlődését.

Megállapítottuk, hogy vagy PH orális beadása, vagy peptidünk intraperitoneális (ip) injekciója csökkentette a lipidcseppek mennyiségét a SAMP8 egerekben, amelyek HFD-t tápláltak, párhuzamosan a p-p38 MAPK, FGF-2, TNF- α, IL-6 és az AMPK reaktiválása. Az összesített adatok azt sugallják, hogy bioaktív peptidünk potenciális hepato-protektív összetevő, amely képes ellensúlyozni a hepatosteatózissal összefüggő proinflammatorikus állapotot, amely felelős az NAFLD előrehaladásáért idősekben.

Anyagok és metódusok

Anyagok

Az elsődleges antitestek: FGF-2 (sc-79), IL-6 (sc-7920), MMP-9 (sc-6841), MMP-2 (sc-13595), PPAR-α (sc-9000), α- tubulint (sc-5286), p-aktint (sc-47778), TNF-a-t (sc-1350) a Santa Cruz Biotechnology-tól (Santa Cruz, Kalifornia, USA) szereztük be; AMPKα (# 2532), p-AMPKα (Thr172) (# 2535), p-FoxO1 (# 9464), p38 MAPK (# 9212) és p-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (# 9211) a Cell Signaling Technology-tól ( Danvers, MA, USA). Minden más reagens és vegyszer, beleértve a Probucolt is, Sigma Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) származott, hacsak másképp nem említettük.

Burgonyával kivont fehérje hidrolizátum és bioaktív peptid

A burgonyával kivont fehérjehidrolizát (PH) elkészítésének és tisztításának bevett módszereit követtük [4]. Nyers burgonyafehérjét a Han-Sient Co.-tól (Tajpej, Tajvan) és az Alcalase-t a Novo Nordisk A/S-től (Koppenhága, Dánia) vásároltak. A gyártó utasításait követve reakcióelegyet állítottak elő nyers burgonyafehérjével (2,5%), amelyet 2 óra alatt alcaláz enzim által hidrolízisnek vetettek alá (a nyersfehérje tömegének 1% -a megegyezik). 1 ml termékkeveréket kaptunk fehérje-hidrolizátum és o-ftaldial-deid (OPA) oldat vizes elegyéből, majd két percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Ezután a termék abszorbanciáját ultraibolya látható spektrofotometriával (Shimazu, UVmini-1240) kaptuk 340 nm hullámhosszon. A termékkeverék hidrolizátumot (~ 81% fehérje) eredményezett, amelynek hidrolízisfoka magasabb, mint 9,5%, és lipolízist stimuláló aktivitást mutat a 3T3-L1 sejtvonalakon. Különböző membrán-leválasztó szűrőket használtunk a PH-fragmensek molekulaméretének felmérésére: a kapott termékek 55% -a kisebb, mint 1000 Da, 40% 1000 és 6000 Da között, és csak 5% -kal több, mint 6000 Da.

Az MB Mission Biotech Co. (Tajpej, Tajvan) kereskedelmi szolgáltatást nyújtott a jellemzési folyamathoz, beleértve az aminosavak összetételét és a peptidszintézist. A frakcionálási munkát fordított fázisú nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (RP-HPLC) alkalmazásával végeztük. A kapott frakciókat tandem tömegspektrometriás teljes ionáram (MS-MS-TIC) alkalmazásával jellemeztük a peptidszekvencia azonosításához. Az MS-MS-TIC kromatogramból kiválasztott peptidek ion-sorozatait a TurboSequest szoftverrel (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) elemeztük a fehérje adatbázis (UniProt, Solanum tuberosum) alapján. Az adatok elemzése feltárta a DIKTNKPVIF peptidet, amely szekvencia homogenitást mutatott a burgonyafehérje patatinnal (Q2MY50 azonosítószám). A PH és a bioaktív peptid aminosavak (AA) összetételét az 1. ábra mutatja.

1. ábra.

Az alcaláz (PH) által termelt burgonyával kivont fehérje-hidrolizátum és az abból származó bioaktív peptid aminosav-összetétele.

A DIKTNKPVIF peptidet az N-terminálison szintetizáltuk, és RP-HPLC-vel tisztítottuk a tisztaság 95% -áig. A szintézist standard F-moc (9-fluorenilmetoxi-karbonil) kémia alkalmazásával hajtották végre egy ABI 433A, teljesen automatizált és programozható peptidszintetizátor (Applied Biosystems, Foster város, CA, USA) szilárd fázisú peptidszintézisben (SPPS), amelyet az automatizált berendezésekhez mellékelt szoftvercsomagok. 10 mM szintetikus peptideket oldószerrel oldunk, amely 1 rész 0,1% trifluor-ecetsavból dupla desztillált vízben és 1 rész 0,1% trifluor-ecetsav acetonitrilben készült. A kapott DIKTNKPVIF keveréket alikvot részekre osztottuk és -80 ° C-on tartottuk törzsoldatként.

Állatkísérletek és kezelések

Masson trichrom festése (MS)

Az egyes csoportokból összegyűjtött májszöveteket két hét alatt 10% -os formalinban áztattuk, majd egymást követően alkoholokba merítve (75%, 85%, 90% és 100%, 5 percig) dehidratáltuk és paraffinviaszba ágyazottuk. A paraffinba ágyazott szövetblokkokat 0,2 μm vastag tárgylemezekre osztottuk, majd deparaffinizáltuk háromszor xilolba merítve 5 percig, majd rehidratáltuk egymást követő áztatással 100%, 90%, 85% és 75% alkoholokban. 5 percig. Masson trikrom festékét 5 percig adtuk a szövetlemezekhez. A májmorfológiai változásokat elemeztük, és Zeiss Axiophot mikroszkóppal fotómikrográfokat készítettünk.

Szövetfehérje extrakció

Minden csoportból négy egér májszövetét összegyűjtöttük és háromszor mostuk foszfáttal pufferolt sóoldatban. Megfelelő mennyiségű lízispuffert (100 mg/ml) adtunk minden mintához. A mintákat homogenizáltuk, jégen helyeztük 30 percig, majd centrifugálási eljárással 12 000 fordulat/perc sebességgel 40 percig 4 ° C-on. Az összegyűjtött felülúszókat mikrocentrifuga csövekben -80 ° C-on tároltuk a további kísérletekhez. A puffert 0,02 M Tris, 0,002 M EDTA, 0,05 M 2-merkaptoetanol, 10% glicerin, 1 μl/ml foszfatáz inhibitor és 10 ml proteáz inhibitor alkalmazásával készítettük.

Lowry fehérje teszt

Szarvasmarha szérumalbumin (BSA) oldatot (0,5 mg/ml) készítettünk úgy, hogy megfelelő mennyiségű vizet csőben 2mg/ml BSA-val kevertünk. A fehérje standardok emelkedett fokozatai (0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 mg/ml) alapján standard görbét kaptunk a hígított BSA-oldat (0,5 mg/ml) alkalmazásával. Röviden, kétlépéses reakció zajlott le. Először a lúgos réz-tartarát oldatot készítettük úgy, hogy megfelelő térfogatú Na2CO3-ot (2% w/v) NaOH-ban (0,1 M) összekevertünk CuSO4.5H2O-val (1% w/v) és Na-K-tartaráttal (1% w/v). ), négy peptidkötéssel és egy központi rézatommal rendelkező tetradentát komplex képződött lúgos közegben egy 10 perces szobahőmérsékleten (RT) lejátszódó reakcióelegy eredményeként a fehérje és a rézionok között. (Cu 2+ és Cu 1+) található a lúgos réz-tartarát oldatban. Másodszor, a folin reagens hozzáadásával 30 percig szobahőmérsékleten történő reakcióhoz a foszfomolibdikus-foszfotungsztikus komplexet Cu 1+ ionok csökkentették, ennek következtében redukált fajok keletkeztek, amelyekre kék szín és 405-750 nm abszorbancia jellemző. Ezt követően egy Elisa olvasót használtunk az OD érték meghatározására 750 nm hullámhosszon.

Western blottolás

A májszövet-kivonatok fehérjetermék-koncentrációit Lowry protein assay módszerrel értékeltük. Az egyes szövetmintákból vett alikvot részeket megfelelő mennyiségű 5x-es töltőanyaggal összekevertük, majd öt percig melegítettük 95 ° C-on. A betöltött mintákat elektroforetikusan elválasztottuk 8% -os, 10% -os vagy 12% -os nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) 75 V állandó áram mellett, egy áramforrásból. Ezt követően egy újabb elektroforézis szekvencia, 50 V áramot használva 3 órán át, fehérjék átadását eredményezte a polivinilidén-difluorid (PVDF) membránokba (GE Healthcare UK Ltd). Ezután a membránokat 3% szarvasmarha-szérum albuminnal (BSA) inkubáltuk Tris-pufferolt sóoldatban (TBS). Specifikus primer antitesteket (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia, USA) adtunk a kiválasztott membránokhoz az antigén-antitest reakció céljából. Ezután torma-peroxidáz-jelölt másodlagos antitesteket alkalmaztunk ennek megfelelően. Az ECL reagensben áztató membránokat a Fujifilm LAS-3000 (GE Healthcare Life sciences) segítségével készítettük. Az adatok számszerűsítéséhez az NIH (USA) Image J szoftverét használtuk.

Statisztikai analízis

A bemutatott adatokat három (3) független kísérlet átlagának ± SD-ként fejezzük ki. Több csoport összehasonlításához a statisztikai elemzést egyirányú ANOVA-val végeztük általános lineáris modell (LSD) alapján, SPSS statisztikai szoftver (12.0 verzió) felhasználásával. A statisztikai szignifikanciát p szinten vizsgáltuk