A B-sejtek elősegítik az elhízás és a 2-es típusú cukorbetegség gyulladását a T-sejtek működésének szabályozása és a gyulladásos citokin profil révén

Szerkesztette Ajay Chawla, Kaliforniai Egyetem, San Francisco, Kalifornia, és a szerkesztőség elfogadta 2013. február 12-én (felülvizsgálatra érkezett 2012. szeptember 11)

Absztrakt

Annak tesztelésére, hogy a B-sejtek elősegítik-e az anyagcsere-betegséget azáltal, hogy támogatják a T-sejtek által közvetített gyulladást és így az IR-t, összehasonlítottuk a limfocita funkciót, a gyulladást és az anyagcsere eredményeit elhízott WT és B sejt-null egerekben. Az itt bemutatott adatok azt mutatják, hogy elhízott egerek B-sejtjei, akárcsak a T2D emberek, szétválasztanak egy gyulladáscsökkentő citokin profilt, beleértve a gyulladásgátló anti-IR IL-10 előállításának képességének hibáját is (14). Továbbá a B-sejt-null egerek védettek az elhízás és a gyulladás patogén kimeneteleitől, összhangban azzal a demonstrációnkkal, hogy az elhízott B-sejt-null egerekben megnövekedett a gyulladáscsökkentő Treg-k aránya. In vitro humán limfocita-elemzésekkel teszteltük ennek a megállapításnak a jelentőségét, amely kimutatta, hogy az emberi B-sejtek, de nem monocita/makrofágok, kontaktusfüggő mechanizmus révén elősegítik a T2D-hez kapcsolódó T-sejt gyulladást. Adataink együttvéve azonosítják az elhízott/IR egér és az emberi immunsejtek közötti funkcionális hasonlóságokat, és azt mutatják, hogy a B-sejtek kétféle útvonalon keresztül növelik az elhízás gyulladását: a gyulladásos T-sejtek arányának szabályozása és a proinflammatorikus citokin profil termelése.

Eredmények

Az elhízott egerekből származó B-sejtek gyulladásos citokinprofilt választanak ki.

A B-sejteket javasolják az elhízással összefüggő anyagcserebetegségek elősegítésére azáltal, hogy képesek behatolni a táguló AT-be, és autoimmun prodiabetogén IgG-t termelni (8, 15). Vizsgálataink alátámasztják a magas zsírtartalmú étrendre adott válaszként az egér epididimális AT-be történő korai B-sejtek beszivárgásának elemzését (HFD; S1A ábra) (8, 15). Az autoimmun IgG-k azonban rendkívül alacsonyak/hiányoztak az elhízott egerek szérumában, antinukleáris antitest-vizsgálattal mérve, amely az autoimmun antitestek klinikai mutatója (S1B ábra). Ezek az adatok megkérdőjelezik az autoantitestek közös osztályának fontosságát az IR-ben, és felvetik annak alternatív lehetőségét, hogy a B-sejtes citokinek humán T2D-ben jelentett proinflammatorikus változásai (2) szerepet játszanak olyan személyekben, akiknek nincs autoantitestük, mégis IR-asszociált gyulladásuk van.

Annak tesztelésére, hogy az elhízott egerek B-sejtjei olyan proinflammatorikus citokin-profilt termelnek-e, amely összefoglalja a T2D-betegek B-sejtjeinek emelkedett IL-8 és drámai mértékben csökkent IL-10 értékét (2), elhízott vagy sovány egerekből stimuláltuk a teljes splenocitákat, majd meghatároztuk citokin szekréció. Az elhízott splenociták a sovány egerekhez képest nagyobb mennyiségű általában gyulladásos IL-6 és IFN-y-t, valamint alacsonyabb mennyiségű gyulladásgátló IL-10-t választottak ki többféle ingerre válaszul (1A. Ábra). Az elhízott egerek splenocitái is kevesebb IL-5-t szekretáltak (S2A ábra), összhangban az IL-5-termelő Th2 sejtek alacsonyabb százalékos arányának bemutatásával és az IL-5 szerepével a glükóz tolerancia javításában (9, 16).

A B-sejtek hiánya alacsonyabb szisztémás gyulladással és a szabályozó T-sejtek (Tregs) megnövekedett százalékával társul az elhízás hatására. (A) Szérum citokinek sovány és elhízott WT és μMT egerekben a jelzettek szerint. (B) Az elhízott WT és μMT egerekből előállított és 40 órán keresztül tenyésztett stimuláció nélküli táptalajok vagy a-CD3/α-CD28-mal stimulált összes splenocita citokinjei. A és B esetében a * μMT szignifikánsan különbözik a WT-től (P # szignifikáns különbség a stimulált és a nem stimulált között (P + CD4 + CD25 + Foxp3 + az S6. Ábrán látható kapuzási stratégiával). * Különbség (P # különbség a sovány és elhízott egerek között) azonos genotípusú. (D) Treg-analízis sovány (fehér) vagy elhízott (szürke) μMT egerekből jelzett szövetekből. A kétfarkú Student t teszttel kiszámított különbségek P értékei a következők. (E) jelzett T-sejt-asszociált vagy (F) pro-/gyulladásgátló gének epididimális AT-ben elhízott WT (fehér) vagy μMT (szürke) egerekből. * Különbség (P + CD4 + T sejtek (azaz jóhiszemű Th17-ek) termelnek IL-t -11 ilyen körülmények között (11). Arra a következtetésre jutunk, hogy a T-sejtek és a B-sejtek és/vagy monociták közötti interakció a T2D-hez társuló proinflammatorikus Th17.

A T2D-asszociált Th17 működéséhez szükséges sejt (ek) pontosabb meghatározása érdekében stimuláltuk a T sejteket tisztított B sejtek jelenlétében. A B-sejt – T-sejt-kultúrák az IL-17-vel mérten összegzik a T2D-specifikus Th17 funkciót (4B. Ábra, BT), bár a BT-kultúrákban az IL-17-koncentráció mennyiségileg alacsonyabb volt, mint az MBT-tenyészetekben. Ezenkívül a T-sejt stimuláció a B-sejt-kimerített (CD19 -) PBMC-k összefüggésében azt mutatta, hogy a B-sejtek eltávolítása a T2D-asszociált Th17 funkció csökkenését eredményezte (4C. Ábra, CD19 -), ami megközelítette az IL-17 termelést nem T2D mintákból származó MBT tenyészetekkel. Az egér splenociták párhuzamos elemzése azt mutatta, hogy a B-sejtek kimerülése a T-sejt stimulálására reagálva csökkentette a gyulladásos citokintermelést (IL-6 és IFN-y) (S10. Ábra), bár továbbra is lehetséges, hogy a citokint szekretáló B-sejtek eltávolítása részben megmagyarázza ezeket a változásokat. Ezzel szemben az IL-10 csak a sovány egerek splenocitáinak B-sejt-kimerülése esetén csökkent (S10. Ábra). Ez az eredmény összhangban van a B-sejtekkel, mint az IL-10 jelentős forrásaival sovány, de nem elhízott/IR, egerekben és emberekben (1B ábra) (2).

Az elhízás/IR alacsonyabb B-sejtes IL-10-et megzavarhatja a gyulladásos T-sejtek IL-10-re való reagálásának hiánya. Annak tesztelésére, hogy a T2D-asszociált változások a T-sejt IL-10 válaszában megerősítik-e a proinflammatorikus B-sejt funkciót, stimuláltuk a T-sejteket a B-sejt (CD19) -hiányos PBMC-k kontextusában és IL-10 jelenlétében vagy hiányában. . Az IL-10 szignifikánsan csökkentette az IL-17 mennyiségét az összes mintában (4C. Ábra). Arra a következtetésre jutunk, hogy a T2D-asszociált T-sejt gyulladás - legalábbis részben - a hibás IL-10 válasz hiányában a B-sejt IL-10 csökkenésének következménye lehet. Mind humán, mind egér vizsgálatokból származó adatok azt mutatják, hogy a B-sejtek támogatják a proinflammatorikus T-sejt működését IR/T2D-ben, és hogy az elhízással kapcsolatos B-sejt-belső változások, beleértve a csökkent IL-10 termelést, valószínűleg domináns szerepet játszanak a betegséggel összefüggő T-sejt funkció.

A proinflammatorikus Th17 funkció B-sejtjeinek támogatása a T2D-ben (4. ábra A és B ábra) nem foglalkozik azzal a lehetőséggel, hogy a monociták/makrofágok, az IR-ben érintett első immunsejt-típus (25, 26) az elhízásban is kontrollálják a T-sejt gyulladását . Ezért megmértük a Th17 funkciót (vagyis az IL-17 koncentrációkat) tisztított monociták és T-sejtek (MT) együttes tenyészeteiben. Az MT kultúrák hasonló mennyiségű IL-17-et termelnek, függetlenül attól, hogy a sejteket megtisztítják-e nem T2D vagy T2D alanyoktól (4D. Ábra). Ezek az adatok összhangban vannak a betegségtől független IL-17 termeléssel, amelyet B-sejt-kimerített PBMC-k termelnek, amelyek lehetővé teszik az MT kölcsönhatását (4C. Ábra, CD19 -). A WT T-sejt-stimulációjának magasabb IL-17 termelésével együtt, összehasonlítva az μMT rágcsáló lépsejtjeivel (3B. Ábra), valamint az emberi MBT és BT együttes tenyészetek eredményeivel, az adatok erősen alátámasztják azt a következtetést, hogy a monociták helyett a B-sejtek, közvetlenül elősegítik a T2D-hez kapcsolódó megemelkedett proinflammatorikus Th17 funkciót. Ezek az adatok így kiegészítik annak demonstrálását, hogy a B-sejtek in vivo szabályozzák a Treg-terjeszkedést az elhízásban (3D. Ábra), hogy alátámasszák azt az általános következtetést, hogy a B-sejtek a T2D-asszociált T-sejt gyulladás fő szabályozói.

A T2D-ben a B-sejtek által közvetített T-sejt gyulladás hátterében álló mechanizmusok további részletezéséhez teszteltük annak lehetőségét, hogy a B és T sejtek kontaktusára vagy minimális szoros közelítésére van szükség ahhoz, hogy a B sejtek támogassák a T sejt által közvetített gyulladást. Összehasonlítottuk az MTB kultúrákban a Th17 funkciót azokhoz a kultúrákhoz, amelyek a B sejteket az MT együttes kultúráktól citokin-áteresztő transzwell membránnal (1 μm pórusméret) választották el. A B-sejtek kontaktusának elvesztése megakadályozta a Th17 funkció T2D-asszociált emelkedését (4E. Ábra, MT/B), ami arra utal, hogy önmagában a B-sejtes citokinek nem elegendőek a gyulladásos pr-gyulladásos funkció támogatásához. Blokkoló antitesttel végzett kísérletek azt mutatták, hogy a CD80/86 és a CD28 nem szükséges a B-sejtek által közvetített Th17 funkcióhoz T2D-ben. Összességében adatunk azt mutatja, hogy több mechanizmus, ideértve a sejtkontaktust és az IL-10 termelés csökkenését, magyarázza a B-sejtek képességét a T-sejtek által közvetített gyulladás elősegítésére a T2D-ben.

Vita

Anyagok és metódusok

Egész állat- és sértetlen szöveti vizsgálatok.

Az összes eljárást a Bostoni Egyetem Orvosi Központjának intézményi állatgondozási és felhasználási bizottsága hagyta jóvá. A vizsgálatok során hím C57BL/6J háttér egereket használtak, és a standard protokollokat az SI anyagok és módszerek ismertetik.

Humán tantárgyak.

A Bostoni Egyetem Orvosi Központjának Intézményi Felülvizsgálati Testülete minden eljárást jóváhagyott a Helsinki Nyilatkozattal összhangban, és a mintákat tájékozott beleegyezéssel nyerték. A T2D-vel és a BMI-vel egyeztetett, nem T2D-s betegeket a Boston University Medical Center/Boston Medical Center Endokrinológiai, Diabétesz- és Táplálkozási Központjából toborozták. A kiválasztási kritériumokat az SI anyagok és módszerek sorolják fel. Az összes alany jellemzőit az S1 táblázat mutatja.

Immunsejt előkészítés/tenyésztés.

Perifériás vért (50–100 ml) gyűjtöttünk heparinizált csövekbe vénás szúrással, és a sejteket megtisztítottuk, tenyésztettük, stimuláltuk és összegyűjtöttük a korábban leírtak szerint (2, 11). CD19 - PBMC-ket úgy állítottunk elő, hogy eltávolítottuk a CD19 + B-sejteket pozitív szelektív mágneses gyöngyökkel (Miltenyi), és megerősítettük, hogy a CD19 + -sejtek áramlási analízise kimerítette a B-sejteket. Immunsejtek az egér s.c. (inguinalis) AT-t két szövet hajlított tűjének kézi ugratásával szabadítottuk fel, amelyek nem aktiválták az immunsejteket (ezt a CD69 felületi festés jelzi). Egész egér splenocitákat állítottunk elő kézi ugratással és vörösvértestek lízisével, majd a CD19 + B sejteket negatív szelektáló mágneses gyöngyökkel (Miltenyi) tisztítottuk, és tenyésztettük az emberi sejteknél leírtak szerint. Az összes limfocita és monocita készítmény tisztasága ≥95%, illetve ≥92% volt, és 1 millió sejt/ml koncentrációban inkubáltuk. A tisztított B-sejteket 24 órás stimuláció után gyűjtöttük be. Az összes T-sejtet tartalmazó tenyészetet 40 óra elteltével gyűjtöttük be. Humán IL-10-et adtak néhány tenyészethez magas fiziológiai koncentrációban (2 ng/ml).

Biokémia.

Az epididimális AT mRNS-t a korábban leírtak szerint számszerűsítettük (38), CD19-re specifikus primerek alkalmazásával (előre: 5′CCCTGTATCTCTGGCTCTGC; fordított: 5′GGGCACATACAGGCTTTGTT), normalizációs kontrollként a ciklofilin B-vel. ELISA-t használtunk a leptin, a MIP-2, az adiponektin és a humán IL-17 mennyiségének meghatározására. Az összes további citokint multiplex protein-vizsgálatokkal (Invitrogen) számszerűsítettük.

Áramlási citometria.

Az áramlás elemzéséhez az egér vért szívszúrással gyűjtöttük össze, és azonos térfogatú PBS/50 mM EDTA pufferhez adtuk; lép és szk. AT manuálisan disszociált. A vörösvértesteket az antitest által közvetített festés előtt lizáltuk. A festési stratégiákat az SI anyagok és módszerek sorolják fel. A sejteket festés után kétszer FACS pufferrel (PBS 0,5% BSA-val és 2 mM EDTA-val) mostuk, majd LSR-II áramlási citométeren (BD Biosciences) elemeztük. A végső adatelemzésekhez FlowJo szoftvert (8.7 verzió; Tree Star) használtunk. Az egyes reagensek titrálását és a „fluoreszcencia mínusz egy” kontrollokat (39) végeztük a panelek optimalizálása érdekében.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Dr. Jongsoon Lee és Susan Leeman a kéziratos kritikákért; Joel Nikolajczyk szakértői technikai segítségért; valamint az Evans Interdiszciplináris Orvostudományi Kutatóközpont és annak Affinity Research Collaborative tagjai értékes beszélgetésekért és forrásokért. Ezt a munkát az Országos Egészségügyi Intézetek támogatták: R21DK089270, 5R21DE021154, R56 DK090455 és R56 DK096525, immunológiai képzési program AI007309, hematológiai képzési program HL007501, a Boston Area Diabetes Endocrinology Research Center kísérleti programja és a Boston Nutrition DK0200.

Lábjegyzetek

↵ 1 Ezek a szerzők egyformán járultak hozzá ehhez a munkához.

A szerző közreműködései: J.D., A.C.B., M.J.-B., J.S.-C., D.M., K.J.S., M.Z., R.J., M.S.O., M.E.M., C.A., G.V.D. és B.S.N. tervezett kutatás; J.D., A.C.B., M.J.-B., J.S.-C., J.D.C., D.M., K.J.S., A.A.W., M.Z., J.A., J.B., G.T., G.V.D. és B.S.N. végzett kutatás; Y.R.N., A.A.W. és M.S.O. új reagensekkel/analitikai eszközökkel járult hozzá; J.D., A.C.B., M.J.-B., J.S.-C., Y.R.N., G.T., R.J., G.V.D. és B.S.N. elemzett adatok; és J.D., J.S.-C., M.S.O., M.E.M., C.A., G.V.D. és B.S.N. írta a lap.

A szerzők nem jelentenek összeférhetetlenséget.