A Canephron N hatékonysága a kísérleti heymann glomerulonephritis komplex kezelésében

Absztrakt

Háttér

Míg az autoimmun vese patológiák leggyakoribb farmakológiai kezelését jól tanulmányozzák, a növényi gyógymódokat gyakran figyelmen kívül hagyják. Ebben a tanulmányban a Canephron® N (CAN) gyógynövényes kezelés hatását vizsgálták az aktív Heymann-féle autoimmun glomerulonephritis (AIG) patkánymodelljében.

Mód

Negyven BDIX hím hagyományos patkányt és hat nőstény patkányt a következő csoportokba osztottak: egészséges állatok, AIG, CAN-nal kezelt AIG, prednizolonnal kezelt AIG, prednizolonnal kezelt AIG és CAN.

Eredmények

A prednizolon vagy a CAN monoterápia különféle pozitív farmakológiai hatásokat tartalmaz.

A prednizolont kapó patkányok mérsékelt növekedést mutattak a CD4 + limfocitaszámban, növekedtek a CD8 + citotoxikus limfocitaszámban, de a CD4 +/CD8 + limfocita arány hiányos normalizálódását mutatták. Csökkentette a limfociták teljes számát. Az immunkomplexek koncentrációja és a krioglobulinszint jelentősen csökkent. A prednizolon monoterápia a nephroticus szindróma paramétereinek mérsékelt csökkenését biztosította.

A CAN monoterápia nem befolyásolta az immunológiai paramétereket és a CD4 +/CD8 + szubpopulációs arányt, de jelentősen csökkentette az immun komplexek szintjét az AIG-hez képest. A gyógyszer fő nephroprotektív hatása a diurézis normalizálása és a glomeruláris szűrési sebesség volt. A leukocyturia jelentős csökkenését figyelték meg az AIG csoporthoz képest.

A legtöbb pozitív hatást a kombinált prednizolon + CAN csoportban figyelték meg. Az immunitás sejthez kötött és humorális kapcsolataiban bekövetkező pozitív immunológiai eltolódások (prednizolon hatások) mellett a vesefunkció jelentősen javult: csökkent a proteinuria, csökkent a vér kreatinin és a karbamid, csökkent az AOPP és a PCO szintje (a CAN együttes hatása). A minőségi különbségek a glükokortikoid immunszuppresszorral és a gyógynövényes gyógyszerrel végzett komplex terápia szinergetikus hatásaira utalnak.

Következtetések

A tanulmányban alkalmazott AIG modell klinikai morfológiai szempontból megfelel az emberi membrános glomerulonephritisnek. A prednizolon monoterápia megfelelő hatékonyságot mutatott a vesebetegség immun- és metabolikus összetevői tekintetében.

Kimutatták, hogy a növényi monoterápia részben normalizálja az urodinamikát.

A CAN és az immunszuppresszáns prednizolon kombinációja pozitívabb farmakodinamikai hatásokat eredményez a patkányok immun- és veserejében.

A kombinált kezelés hasznos lehet a klinikai nephrológiai gyakorlatban, beleértve a vese autoimmun betegségben szenvedő betegeket, és tovább kell vizsgálni.

Háttér

A preklinikai és klinikai nephrológiai vizsgálatok három témára összpontosítanak: 1) a veseelégtelenség diagnosztikájának javítása [1, 2], 2) hatékony dialízis eszközök és méregtelenítő kezelések kidolgozása [3], 3) új gyógyszerek keresése a betegek megelőzésére és konzervatív kezelésére különféle gének vesepatológiái [4].

Az autoimmun vesepatológia mind állatmodellekben, mind emberben összefügg a nephron struktúrák autoantitestek által kiváltott pusztulásával, az immun komplexek lerakódásával és a leukociták vese szövetekbe történő migrációjával [5, 6]. Jelenleg a Т-helper-függő В-limfociták autoreaktív klónjai által az autoantitestek termelésének korlátozására szolgáló legáltalánosabb farmakológiai kezelés az immunodepresszáns gyógyszerek, például glükokortikoszteroidok (prednizolon, metilprednizolon), citosztatikus gyógyszerek (ciklofoszfamid, klorambucil), limfocita inozin-monofoszfát-dehidrogenáz gátlók mikofenolát-mofetil), kalciumfüggő Т-sejtes szignáltranszdukciós utak gátlói (ciklosporin A, takrolimusz), a limfokin gének diszkrét csoportjának transzkripciójának szuppresszorai, monoklonális antitestek stb. Az autoimmun vese patológia alapterápiája a prednizolon, metilprednizolon, azatioprin, ciklofoszfamid, mikofenolát-mofetil, ciklosporin А és takrolimusz [7]. A kezelés magában foglalja a heparin csoport antikoagulánsait, az angioprotektorokat [8] és a növényi gyógyszereket is [9].

A patológia kezelésében alkalmazott gyógynövényes gyógyszereket gyakran utolsónak tekintik. Jelentős tapasztalatok gyűltek össze a vese- és húgyúti betegségek fitoterápiájával kapcsolatban az évek során [4, 9, 10]. A vesebetegségek fitoterápiával történő kezelésének bizonyítékai, mind a preklinikai, mind a klinikai adatok továbbra is elégtelenek.

A Bionorica SE által előállított Canephron N (CAN) növényi gyógyszer három növényi összetevőt ötvöz: rozmaring, lovage és centaury [11]. A CAN farmakológiai hatásai gyulladáscsökkentő, vizelethajtó és nephroprotektív hatásokból állnak [12]. Ennek a gyógyszernek a fő előnye a gyógyszerpiacon való hozzáférhetőség, a magas vese- és húgyúti patológiák hatékonysága, a biztonság, valamint a gyermekek és a terhesség alatt történő alkalmazásának lehetősége. A CAN biztonságosságát és hatékonyságát késői terhességi toxikózisban szenvedő terhes nőknél jelezték [13, 14]. A klinikai [15, 16] és a preklinikai [17] fő tanulmányok bizonyítják a gyógyszer hatékonyságát tubuláris patológiában, például pyelonephritisben és tubulointerstitialis nephritisben, antibakteriális gyógyszerekkel (pefloxacin, amoxiclav, roxithromycin) kombinált terápia részeként [18]. ].

A tanulmány célja a CAN nefroprotektív hatásainak vizsgálata komplex farmakoterápiában, aktív Heymann autoimmun glomerulonephritis (AIG) patkánymodelljében. A vizsgálat a következő csoportokat foglalta magában: 1) egészséges állatok, 2) AIG-vel rendelkező állatok, 3) AIG-vel CAN-nal kezelt állatok (60 napig), 4) AIG-vel rendelkező állatok, amelyeket standard immunodepresszáns prednizolonnal (60 napig) kezeltek, és 5) AIG-vel rendelkező állatok, prednizolonnal és CAN-nal kombinálva (60 napig). A kezelések farmakológiai hatásának értékelését a preklinikai vizsgálatokhoz ajánlott laboratóriumi vizsgálatok sorozatával végezték [19].

Mód

Állatok

A laboratóriumi állatokkal végzett munka összhangban volt a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutatóval (USA, National Academy Press, Washington, D.C., 1996); a laboratóriumi állatok gondozására és használatára vonatkozó útmutató (FELASA, 2010); Laboratóriumi állatok (irányelvek, Orosz Orvostudományi Akadémia, Moszkva, 2003) [20]. A kísérleteket 40 BDIX hím hím patkánnyal és 6 nőstény patkánnyal [21] végeztük, amelyek súlya 200–220 g volt, az Orosz Tudományos Akadémia Pavlov Intézetéből (Szentpétervár, Oroszország) vásároltuk. Az ebben a vizsgálatban követett kísérleti protokollt a Toxikológiai Intézet Bioetikai Bizottságának Állatgondozása teljes mértékben jóváhagyta.

Autoimmun glomerulonephritis (AIG) modellezése

Az aktív Heymann-féle glomerulonephritis kiváltására az anyai veséket izolálták és homogenizálták, megszabadították a kötőszövetektől és összekeverték Freund teljes adjuvánsával (1: 1) [22–24]. Így az anyai vese antigént tartalmazó gp330 glikoproteint kaptuk. Három hónapos korban az f 1 nemzedék patkányait immunizáljuk anyai vese antigén (10 mg/200 g testtömeg) két intraperitoneális beadásával, 14 napos intervallummal. 28 nappal a második immunizálás után értékelték a proteinuria súlyosságát (a proteinuria a kísérleti patkányokban legalább 0,5 g/mmol kreatinin/nap volt), és a patkányokat a következő csoportokba osztották: egészséges állatok, akik nem részesültek immunizálásban (Healthy n = 8), patológiai kontroll (AIG, n = 8), prednizolon terápia (prednizolon, n = 8), CAN kezelés (CAN, n = 8), prednizolon + CAN kezelés (prednizolon + CAN, n = 8). A prednizolont 10 mg/kg/nap dózisban, a CAN orális cseppeket 3,0 ml/kg/nap dózisban adták be [25]. A gyógyszer beadását nem traumás szondán (p.o.) végezték naponta egyszer 60 napig. 60 nappal a kezelés befejezése után 24 órás vizeletet gyűjtöttek patkányoktól, majd az állatokat altatásban (zolazepam + tiletamin 1: 1, 20 mg/kg) eutanizálták, azonnali lefejezéssel, vérmintával biokémiai és immunológiai vizsgálatokhoz.

Paraméterek és tesztek

A kísérlet végén (60. nap) huszonnégy órás vizeletmennyiséget határoztunk meg úgy, hogy az összes patkányt 24 órán át metabolikus ketrecekbe helyeztük (Tekniplast Gazzada, Olaszország), szabad táplálék nélküli vízhez (minden patkányonként 100 ml). A vesepatológia (nefrotikus szindróma) fő markerei a fehérje és az eritrocita szintje voltak a vizeletben. A vizeletet Aution Sticks 10EA tesztcsíkokkal elemeztük az AutionEleven АЕ-4020-on (Arkray Factory, Inc. (Japán)). Az összegyűjtött vizeletmintákat elemeztük az eritrociták, a leukociták, a gipszek számára (szupravitalis festés Sternheimer-Malbin módszerrel, mikroszkóppal × 100 és × 400 nagyítással) [26, 27], fehérje szintre (pirogallol vörös kötési módszer alkalmazásával 600 nm-en) kreatininszint (Jaffe pszeudokinetikai reakció alkalmazásával 505 nm-en) [28]. A 24 órás vizeletben lévő proteinuriát g fehérje/mmol kreatininre számítottuk. Az Abris + és az Olvex Diagnosticum (Oroszország) által gyártott, kész klinikai kémiai készleteket használtak. A glomeruláris szűrési sebességet (GFR ml/perc) a vesetoxikológiai módszerek [29] által leírt egyenlet segítségével számítottuk ki.

A vért mintákba vettük antikoaguláns lítium-heparinnal az immunológiai vizsgálatokhoz, és a vérrög-aktivátor csövekbe a biokémiai vizsgálatokhoz (Vacuette).

Limfocita immunfenotipizálás

A CD4 + és CD8 + Т-limfociták számának értékeléséhez egér monoklonális antitesteket használtunk: PE-jelölt patkányellenes CD45, FITC-jelölt patkányellenes CD3, APC-jelölt patkányellenes CD4, PerCP-jelölt patkányellenes CD8a (BD Pharmingen). 10 μl antitestkeveréket adtunk 50 μl vérhez, és 30 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten. Ezután 450 μl 1% BD FACSC ™ lizáló oldatot (BD, USA) adunk hozzá és 30 percig inkubáljuk. A citometriát a BD FACSCalibur ™ (BD Biosciences, USA) áramlási citofluoriméteren végeztük CellQuestPrO univerzális szoftver alkalmazásával [30]. Minden mintában legalább 10 ezer sejtet mértünk.

Az immunkomplexek szintjét (CIC) turbidimetriával határoztuk meg 3,5% PEG-6000 jelenlétében borát pufferben 450 nm-en [28, 31]. A krioglobulinszintet 7 napos szérum + 4 ° C-on, nátrium-azid jelenlétében végzett inkubálás, krioprecipitátum centrifugálás, 0,1 M nátrium-hidroxidban oldott csapadék és 260 és 280 nm-en végzett spektrofotometria után határoztuk meg [31].

A vesekárosodás biomarkereinek, azaz a karbamidnak (vér-karbamid-nitrogén, BUN) és a kreatinin szérumszintjét UV-kinetikus módszerrel, a koleszterint 500 nm-en határozták meg Randox Laboratories Ltd. (Egyesült Királyság) kitek segítségével [28]. A krónikus vesebetegség markerként előrehaladott oxidációs fehérjetermékek (AOPP) szintjét 340 nm-en értékelték Witko-Sarsat módszerrel [32], a 2,4-dinitrofenilhidrazinhoz kötődő karbonilfehérje (PCO) 370 nm-en [33]. . A méréseket Synergy2 (BioTek Instruments, Inc., USA) mikrolemezolvasóval végeztük. A mérések helyességét a Randox Laboratories Ltd. (Egyesült Királyság) kontrollszérummal (1–3. Kalibrációs szérum szint) és a Bio-Rad (USA) vizeletanyagokkal (Liquichek vizeletvizsgálat 1–2. Szint) használtuk.

A statisztikai teszteket a Statistica 8.0 for Windows szoftverrel végeztük. A nem paraméteres Kruskall-Wallis teszt és Mann – Whitney U tesztet alkalmaztunk. Az adatokat az átlag ± az átlag standard hibájaként (SEM) mutatjuk be. A különbségek jelentőségét a o ≤ 0,05 [34].

Eredmények és vita

Az AIG-vel rendelkező állatok immunopatológiai elmozdulásokat mutattak az autoimmun patológiára: a vér CD8 + Т-sejtjeinek, a CD4 + Т-helper sejteknek statisztikailag szignifikáns csökkenése és az immunregulációs index növekedése (o ≤ 0,05). A CD4 + T-sejtek kritikus szerepet játszanak a Heymann nephritis kiváltásában. A szérumban keringő immunkomplexek (CIC) koncentrációja jelentősen (kb. 25-szeresére) nőtt, és a krioglobulinszint 5,4-szeresére nőtt az egészséges patkányokhoz képest (1. és 2. ábra).